WWW.MASH.DOBROTA.BIZ
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - онлайн публикации
 

«по применению набора реагентов для определения делеций AZF локуса методом ПЦР в режиме реального времени Генетика наследственных заболеваний. Делеции локуса AZF Форма ...»

ИНСТРУКЦИЯ

по применению набора реагентов для определения делеций AZF

локуса методом ПЦР в режиме реального времени

Генетика наследственных заболеваний .

Делеции локуса AZF

Форма комплектации:

Генетика наследственных заболеваний. Делеции локуса AZF

Регистрационное удостоверение

№РЗН 2014/2078

ВНИМАНИЕ! Изучите инструкцию перед началом работы

ИНСТРУКЦИЯ

по применению набора реагентов для определения делеций AZF локуса методом ПЦР в режиме реального времени Генетика наследственных заболеваний. Делеции локуса AZF 1 НАЗНАЧЕНИЕ

1.1 Набор реагентов «Генетика наследственных заболеваний .

Делеции локуса AZF» предназначен для определения делеций локуса AZF методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени .

1.2 Набор может быть использован в клинико–диагностических лабораториях медицинских учреждений и научноисследовательской практике .

2 ХАРАКТЕРИСТИКА НАБОРА

2.1 Принцип действия Принцип метода ПЦР основан на использовании процесса амплификации ДНК, заключающегося в повторяющихся циклах температурной денатурации ДНК, отжига праймеров с комплементарными последовательностями и последующей достройки полинуклеотидных цепей с этих праймеров Taq– полимеразой .

Для повышения чувствительности и специфичности реакции предусмотрено применение «горячего» старта, который обеспечивается методикой приготовления реакционной смеси, состоящей из двух слоёв, разделённых прослойкой из парафина. Смешение слоёв и превращение их в реакционную смесь происходит только после плавления парафина, что исключает неспецифический отжиг праймеров на ДНК-мишени при начальном прогреве пробирки .



В реакционную смесь для амплификации введены ДНК– зонды, каждый из которых несёт флуоресцентную метку и гаситель флуоресценции. При образовании специфичного продукта ДНК-зонд разрушается, действие гасителя на флуоресцентную метку прекращается, что ведёт к возрастанию уровня флуоресценции. Количество разрушенных зондов (а, следовательно, и уровень флуоресценции) увеличивается пропорционально количеству образовавшихся специфических ампликонов и измеряется на каждом цикле амплификации .

Исследование состоит из следующих этапов: выделение ДНК (пробоподготовка) и ПЦР-амплификация ДНК в режиме реального времени с использованием набора реагентов «Генетика наследственных заболеваний. Делеции локуса AZF» .

Набор реагентов «Генетика наследственных заболеваний .

Делеции локуса AZF» включает: смеси для амплификации, специфичные для маркеров Y-хромосомы, делеции которых являются причиной азооспермии или олигозооспермии (sY84, sY86, sY127, sY134, sY142, sY242, sY254, sY255, sY615, sY1125, sY1197, sY1206 и sY1291); смесь для амплификации ДНК гена половой принадлежности (SRY) и смесь для амплификации геномной ДНК человека, предназначенную для контроля взятия клинического материала (КВМ). КВМ используется для исключения ошибок преаналитического этапа. В случае недостаточного для анализа количества забранного материала требуется повторное взятие клинического материала .

В состав ДНК-зондов, использующихся для детекции продуктов амплификации искомой ДНК, включены флуоресцентные метки Fam и Hex. В состав ДНК-зондов, использующихся для детекции продуктов амплификации гена половой принадлежности (SRY), входит флуоресцентный краситель Fam, для контроля взятия материала – Hex (таблица 1) .



Использование нескольких флуоресцентных красителей позволяет сократить количество пробирок, поскольку появляется возможность одновременно регистрировать результаты разных реакций амплификации, проходящих в одной пробирке .

В одну из пробирок (таблица 1) добавлен олигонуклеотид с флуоресцентной меткой Rox – «Маркер». Он используется прибором как маркер определения положения стрипованных пробирок (стрипов) в плашке. После прохождения амплификации программа сравнивает заданное оператором расположение пробирок с реальным положением маркера, и, если находит несовпадение, то предупреждает оператора об этом. Оператору следует либо расположить данные из каждой отдельной пробирки в соответствующем порядке вручную, либо повторить исследование данного образца, правильно расположив пробирки в термоблоке .

Набор выпускается в следующих формах комплектации:

«Генетика наследственных заболеваний. Делеции локуса AZF» - предназначен для выявления микроделеций Yхромосомы, ассоциированных с азооспермией, ДНК гена половой принадлежности (SRY) и геномной ДНК человека (в качестве контроля взятия биологического материала) .

Таблица 1 Состав стрипов, цветовая маркировка и каналы детекции продуктов амплификации

–  –  –

3 АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАБОРА

3.1 Специфичность Список выявляемых набором маркеров представлен в таблице 1 .

Для образцов биологического материала, содержащих выявляемые Y-специфичные маркеры, во время проведения амплификации амплификатор должен регистрировать экспоненциальный рост уровня флуоресценции в соответствующей пробирке по соответствующим каналам детекции .

Для образцов биологического материала, не содержащих выявляемые Y-специфичные маркеры, при проведении амплификации экспоненциальный рост уровня флуоресценции в соответствующей пробирке по соответствующим каналам детекции отсутствует .

3.2 Определение пола Для образцов биологического материала, принадлежащих мужчине, амплификатор должен регистрировать экспоненциальный рост уровня флуоресценции в соответствующей пробирке (SRY) .

Для образцов биологического материала, принадлежащих женщине, при проведении амплификации экспоненциальный рост уровня флуоресценции в соответствующей пробирке (SRY) отсутствует .

3.3 Контроль взятия материала Для образцов биологического материала, в которых присутствует геномная ДНК человека, детектирующий амплификатор должен регистрировать экспоненциальный рост уровня флуоресценции в соответствующей пробирке .

Для образцов биологического материала, в которых отсутствует геномная ДНК человека, при проведении амплификации экспоненциальный рост уровня флуоресценции в соответствующей пробирке отсутствует .

3.4 Чувствительность Количество анализируемой ДНК должно быть не менее 1,0 нг на амплификационную пробирку. При использовании меньшего количества ДНК возможно получение недостоверного результата .





–  –  –

6 АНАЛИЗИРУЕМЫЕ ОБРАЗЦЫ

Для исследования используют цельную периферическую кровь человека .

Взятие, предобработку и хранение материала проводят в соответствии с инструкцией к комплекту реагентов для выделения ДНК из биологического материала .

– по мере обновления программного обеспечения рекомендуемая версия ПО может измениться. Последнюю рекомендуемую версию ПО можно скачать на сайте компании «ДНК-Технология»: http://www.dnatechnology.ru/po/

6.1 Взятие цельной периферической крови Взятие цельной периферической крови проводится в вакуумные пластиковые пробирки типа Vacuette объёмом 2,0 или 4,0 мл с добавленной в качестве антикоагулянта динатриевой солью этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) в конечной концентрации 2,0 мг/мл. В качестве антикоагулянта допускается также использование цитрата натрия. Для перемешивания крови с антикоагулянтом после взятия материала необходимо перевернуть пробирку 2–3 раза .

ВНИМАНИЕ! Не допускается использование гепарина в качестве антикоагулянта .

6.2 Транспортировка и хранение исследуемого материала Допускается хранение образцов при температуре от 2°С до 8 °С не более 24 часов. В случае невозможности доставки материала в лабораторию в течение суток допускается однократное замораживание материала. Допускается хранение замороженного материала при температуре минус 20 °С в течение 1 месяца .

7 ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА

7.1 Выделение ДНК из биологического материала Выделение ДНК проводят в соответствии с инструкцией к используемому комплекту реагентов. Рекомендуемые комплекты для выделения ДНК из биологического материала: ПРОБА-ГC-ГЕНЕТИКА или ПРОБА-РАПИДГЕНЕТИКА .

Комплект ПРОБА-ГС-ГЕНЕТИКА рекомендуется использовать в случае, если предполагается длительное хранение выделенной ДНК (до 6 месяцев). ДНК, полученную с использованием комплекта ПРОБА-РАПИД-ГЕНЕТИКА, следует хранить не более 1 месяца .

О возможности использования других комплектов реагентов для выделения ДНК из биологического материала совместно с набором реагентов для определения делеций AZF локуса методом ПЦР в режиме реального времени можно узнать у представителя компании «ДНК-Технология» .

Независимо от используемого комплекта для выделения ДНК одновременно с выделением ДНК из периферической крови необходимо провести через все этапы пробоподготовки отрицательный контрольный образец (в его качестве можно использовать физиологический раствор в объёме согласно инструкции к комплекту реагентов для выделения ДНК) .

7.2 Подготовка и проведение полимеразной цепной реакции 7.2.1 Промаркируйте по одному стрипу с запечатанной парафином смесью для амплификации для каждого исследуемого образца, отрицательного контрольного образца («K–») и положительного контрольного образца («К+») .

ПРИМЕЧАНИЕ. Один стрип рассчитан на исследование одного образца .

Например, необходимо проанализировать два образца .

Нужно промаркировать два стрипа для исследуемых образцов, один для «K-» и один для «K+». Общее количество стрипов — четыре (таблица 2) .

Таблица 2 Пример маркировки стрипов для проведения ПЦР

–  –  –

ВНИМАНИЕ! При использовании других амплификаторов необходимо уточнить программу амплификации у представителя компании «ДНК-Технология» .

7.3 Загрузка теста «AZF» для амплификаторов детектирующих при первой постановке на данном компьютере .

Версия ПО не ниже 7.3.4.0, рекомендуемая версия 7.6.5.124 .

ПРИМЕЧАНИЕ. Для иллюстраций в настоящей инструкции использованы скриншоты версий 7.3.4.0, 7.3.5.25 Тест «AZF»(файл AZF.ini) для приборов ДТлайт, ДТпрайм и ДТ-96 предоставляется производителем набора.

Его установку в программу RealTime_PCR необходимо производить в режиме «Работа с прибором» в следующем порядке:

7.3.1 Откройте программное обеспечение RealTime_PCR, выберите оператора, который будет работать с набором «Генетика наследственных заболеваний. Делеции локуса AZF», выберите режим «Работа с прибором» .

При добавлении нового оператора необходимо создать или выбрать рабочую директорию для сохранения файла с результатами .

7.3.2 В меню «Тест» выберите закладку «Копировать группы тестов» .

7.3.3 В левой половине окна «Копировать группы тестов»

выберите строку «из *.ini файла», откройте ini файл «AZF» .

7.3.4 В правой половине окна «Копировать группы тестов»

выберите оператора, в директорию которого необходимо скопировать тест «AZF» .

– по мере обновления программного обеспечения рекомендуемая версия ПО может измениться. Последнюю рекомендуемую версию ПО можно скачать на сайте компании «ДНК-Технология»:

http://www.dna-technology.ru/po/ 7.3.5 Выберите тест для копирования. Нажмите кнопку, после чего выбранный тест появится в правой половине окна .

Теперь с тестом «AZF» может работать оператор, для которого был скопирован тест .

7.4 Ежедневная работа с тестом «AZF» .

7.4.1 Откройте программное обеспечение RealTime_PCR, выберите оператора, для которого копировали тест (см. 7.3.4), выберите режим«Работа с прибором» .

7.4.2 Нажмите кнопку «Добавить тест» .

7.4.3 Выберите из списка тест «AZF» .

7.4.4 Укажите количество исследуемых образцов (отрицательные и положительные контрольные образцы следует указывать как образцы), нажмите кнопку «Ок» .

Укажите идентификаторы пробирок .

7.4.5 7.4.6 Отметьте расположение стрипов на матрице термоблока в соответствии с их установкой (при необходимости нажмите

–  –  –

Если термоблок не заполнен полностью, рекомендуется устанавливать пробирки по центру термоблока .

7.4.7 Нажмите кнопку «Применить» в правом нижнем углу окна «Протокол». В окне «Запуск программы амплификации»

будет отображена необходимая программа амплификации .

7.4.8 Нажмите кнопку «Запуск программы» в правом нижнем углу окна .

7.4.9 Укажите имя файла и директорию на компьютере для сохранения файла с результатами (по умолчанию будет предложено сохранить файл в рабочую директорию выбранного оператора, см. 7.3.1) .

8 РЕГИСТРАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ АМПЛИФИКАЦИИ

Регистрация сигнала флуоресценции проводится прибором автоматически во время амплификации .

Детекция и учёт результатов осуществляются детектирующим амплификатором автоматически .

После окончания программы амплификации на экране появится соответствующее информационное сообщение и будет предложено перейти к анализу результатов (п. 4.6 части 1 («Работа с прибором») Руководства по эксплуатации для амплификаторов детектирующих). Анализ проводится программным обеспечением .

На графике будет отображена зависимость флуоресценции от номера цикла для каждой пробирки в термоблоке. В таблице справа будет показан идентификатор образца, название исследования, индикаторный цикл (Ср), результат по каждому исследованию (качественный анализ) .

По результатам анализа можно сформировать и распечатать отчёт .

Для создания специализированного отчёта следует открыть инструментальную панель (кнопка ), выбрать «Отчёты»

(кнопка ), выбрать «Специализированный отчёт по

–  –  –

9 УЧЁТ РЕЗУЛЬТАТОВ РЕАКЦИИ

9.1 Учёт и интерпретация результатов реакции осуществляется автоматически с помощью программного обеспечения, поставляемого с детектирующим амплификатором .

9.2 После прохождения амплификации программное обеспечение сравнивает заданное оператором расположение пробирок с реальным положением маркера (флуоресцентной метки Rox), и, если находит несовпадение, то предупреждает оператора об этом .

Оператору следует либо расположить данные из каждой отдельной пробирки в соответствующем порядке вручную, либо повторить исследование данного образца, правильно расположив пробирки в термоблоке .

9.3 В результатах анализа необходимо учитывать значения контроля взятия материала (КВМ). Значение КВМ по Cp больше 32,0 следует интерпретировать как недостаточное количество материала (см.3.2). В этом случае требуется повторное взятие клинического материала .

Интерпретация результатов проводится в соответствии с таблицей 4 .

9.4 Для отрицательного и положительного контрольных образцов должны быть получены следующие результаты:

–  –  –

КВМ

9.5 При получении положительных значений для отрицательного контрольного образца результаты всей постановочной серии считают недостоверными. В этом случае необходимо проведение специальных мероприятий для устранения возможной контаминации .

9.6 При получении отрицательных значений для положительного контрольного образца результаты всей постановочной серии считают недостоверными. В этом случае требуется повторная постановка амплификации всей партии образцов .

ВНИМАНИЕ! При получении сомнительного результата требуется повторное проведение амплификации для этого образца, при получении такого же результата снова - повторное взятие клинического материала у пациента .

–  –  –

N — норма, Del — делеция

10 УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВКИ, ХРАНЕНИЯ И

ЭКСПЛУАТАЦИИ НАБОРА

10.1 Срок годности набора – 12 месяцев с даты изготовления .

10.2 Все компоненты набора реагентов следует хранить при температуре от 2°С до 8 °С в течение всего срока годности набора .

10.3 Транспортировку набора осуществляют всеми видами крытого транспорта при температуре от 2°С до 8 °С в течение всего срока годности набора .

10.4 Набор с истекшим сроком годности использованию не подлежит .

10.5 Для получения надёжных результатов необходимо строгое соблюдение инструкции по применению набора .

10.6 Предприятие-изготовитель гарантирует соответствие набора требованиям технических условий при соблюдении условий транспортировки, хранения и эксплуатации, установленных техническими условиями .

По вопросам, касающимся качества набора реагентов для определения делеций AZF локуса методом ПЦР в режиме реального времени (Генетика наследственных заболеваний.

Делеции локуса AZF), следует обращаться к официальному представителю производителя по адресу:

ООО «ДНК-Технология», 117587, Москва, Варшавское шоссе, д.125ж, корп.6, тел./факс +7 (495) 980-45-55, www.dnatechnology.ru .

Служба клиентской поддержки: 8 800 200-75-15 (звонок по России бесплатный), E-mail: hotline@dna-technology.ru .

Анкета для осуществления обратной связи находится на сайте компании «ДНК-Технология»:

http://www.dna-technology.ru/customer_support/ .

–  –  –






Похожие работы:

«ДОМ ДЕТСКОГО ТВОРЧЕСТВА "Упражнения для развития воображения на уроках мультипликации" Юрий Мещеряков старший педагог студии игрового кино и анимации "Ровесник" Нарва 2017 Содержание: 1. Ан...»

«Аттестация учителей начальных классов Демоверсия Квалификационный экзамен для учителей начальных классов Департамент образования администрации Владимирской области ГБУ ВО Региональный информационноанал...»

«ГЛАВА ПЕТРОПАВЛОВСК-КАМЧАТСКОГО ГОРОДСКОГО ОКРУГА ПОСТАНОВЛЕНИЕ от 19.10.2018 г. № 80 О назначении публичных слушаний по проекту межевания территории части квартала № планировочного подрайона 1.1.2. Деловое ядро центра городского план...»

«Айк Харазян Санкт-Петербург "БХВ-Петербург" УДК 004.438 Swift ББК 32.973.26-018.1 Х20 Харазян А. А. Х20 Язык Swift. Самоучитель. — СПб.: БХВ-Петербург, 2016. — 176 с.: ил. — (Самоучитель) ISBN 978-5-9775-3572-4 Книга предназначена для самостоятел...»

«Корнеева Светлана Анатольевна Корнеева С в е т л а н а А н а то л ь е вн а, Белгородский государственны й у н и в е р с и т е т, с т а р ш и й п реподаватель кафедры психология педагогического ф а к у л ь т е т а Глава 7. Разноуровне...»

«Тезисы к докладу в библиотеке "Дом А. Ф. Лосева" 19 октября 2017 г. "Учение о всеобщем спасении (апокатастасисе) в оценках русских философов" Предметом рассмотрения является хорошо из...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации ФГАОУ ВПО "Российский государственный профессионально-педагогический университет" В. П. Строшков, Ю . И. Категоренко ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОЕ ФОРМООБРАЗОВАНИЕ ИНСТРУМЕНТА, ЛИТЕЙНОЙ ОСНАСТКИ, ДЕТАЛЕЙ МАШИН Учебное пособие Допущено Учебно-методическим объединением по профессио...»




 
2019 www.mash.dobrota.biz - «Бесплатная электронная библиотека - онлайн публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.