WWW.MASH.DOBROTA.BIZ
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - онлайн публикации
 

«С.Н. Куликов, Ю.А. Тюрин, А.В. Ильина*, А.Н. Левов*, С.А. Лопатин*, В.П. Варламов* Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Роспотребнадзора, Казань, Россия * Центр ...»

УДК 615.281:577.1

АНТИБАКТЕРИАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ ХИТОЗАНА И ЕГО ПРОИЗВОДНЫХ

С.Н. Куликов, Ю.А. Тюрин, А.В. Ильина*, А.Н. Левов*, С.А. Лопатин*, В.П .

Варламов*

Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии

Роспотребнадзора, Казань, Россия

* Центр «Биоинженерия» РАН, Москва, Россия

Введение

Хитозан - природный полиаминосахарид, состоящий из остатков глюкозамина, был

открыт в середине девятнадцатого века, однако, стал находить практическое применение только в последние два десятилетия [1]. Широкий спектр биологической активности, биосовместимость, биодеградируемость делают хитозановый полимер привлекательным объектом для использования в разнообразных целях. Одними из первых свойств, обнаруженных у хитозана, стали его антибактериальная и противогрибная активности, которые в настоящее время интенсивно осваиваются медициной, сельским хозяйством, пищевой и текститильной промышленностями .

Биоцидной активности хитозана посвящено большое количество экспериментальных работ [2, 3]. При этом, ингибируя рост прокариотов, мицелиальных и дрожжеподобных грибов, хитозан оказывает меньшее влияние на клетки млекопитающих [4]. Тем не менее механизмы антибактериального действий этого биополимера на клеточном и молекулярном уровнях раскрыты неполностью .

Полагают, что антибактериальные свойства полимера связаны в первую очередь с его воздействием на клеточные стенки микроорганизмов .



В случае грам-отрицательных бактерий первой мишенью действия хитозанового поликатиона становится липополисахарид (ЛПС), который входит в состав внешней мембраны и заряжен отрицательно. Роль заряда ЛПС в проявлении хитозаном своей антибактериальной активности подтверждается тем, что мутантный штамм Salmonella typhimurium, во внешней мембране которого присутствует положительно заряженный ЛПС, обладает повышенной устойчивостью к действию полимера [5]. ЛПС выполняет важную структурную роль и придаёт поверхности микробной клетки гидрофильные свойства, благодаря чему затрудняется проникновение внутрь гидрофобных молекул с антибиактериальным действием. Поэтому взаимодействие хитозана с ЛПС и возникающие при этом структурные изменения во внешней мембране делают клетку более чувствительной к действию некоторых детергентов [5]. Кроме того, стабильность мембраны обеспечивается двухвалентными катионами металлов, которые находятся в комплексе с ЛПС. Поэтому хелатирование ионов металлов хитозаном, обладающим многочисленными первичными аминогруппами, приводит к дестабилизации внешних структур грам-отрицательных бактерий. И хотя по сравнению с более сильным хелатирующим агентом – ЭДТА, хитозан не вызывает существенного высвобождения из мембраны ЛПС и глицерофосфолипидов [5], тем не менее изменения в структуре резко снижают её барьерную функцию, делая клетки бактерий более подверженными действию других антибактериальных веществ, которые не способны проникать через неповреждённую мембрану [5, 6] .

У грам-положительных бактерий главной мишенью для хитозана могут быть тейхоевые кислоты, отрицательный заряд которым придают многочисленные остатки фосфорной кислоты. Подобно ЛПС грам-отрицательных бактерий тейхоевые кислоты находятся в комплексе с двухвалентными ионами металлов тем самым являясь их важнейшим резервуаром и регулятором ионного обмена. Поэтому связывние хитозаном катионов металлов способно нарушить ионный баланс клетки. Тейхоевые кислоты в составе клеточных стенок также связаны с положительно заряженными белками – автолизинами, которые играют важную роль в деградации муреина, которая необходима в процессе роста и деления бактерий .



Конкурентное вытеснение хитозановым полимером избыточного количества автолизинов из их комплекса с тейхоевыми кислотами способно вызвать неконтролируемый лизис клеточной стенки. Именно таким образом активируются автолитические ферменты Staphylococcus simulans - N-ацетилмурамил-L-аланин-амидаза и эндо-b-N-ацетилглюкозаминидаза при воздействии некоторых положительно-заряженных веществ [7] .

Следующей по значимости мишенью для хитозана после компонентов клеточной стенки бактерий является ЦПМ. Под воздействием полимера нарушается проницаемость плазмалеммы, что ведёт к падению мембранного потенциала, выходу из клетки цитоплазматических веществ. Вызванные действием хитозана конформационные изменения мембранных белков, учавствующих в переносе электронов в процессе аэробного дыхания, могут негативно повлиять на работу электрон транспортной цепи. Это подтверждается тем, что при действии хитозана усиливается экспрессия генов, которые кодируют ферменты, участвующие в энергентическом метаболизме в условиях недостатка кислорода или при разрыве электрон транспортной цепи: форматацетил-трансферазы, форматацетил-трансферазного активирующего белка, нитрат-редуктазы, НАДНдегидрогеназы и некоторых других [8] .

Кроме механизма антимикробного действия остаётся до конца невыясненной взаимосвязь между химической структурой хитозанового полимера и его биологическим эффектом на клетки микроорганизмов [9]. Установление подобной взаимосвязи осложняется тем, что хитозан, являющийся природным сополимером Nацетилглюкозамина и глюкозамина, представляет собой гетерогенную группу веществ, различающихся по молекулярной массе, степени ацетилирования, расположению ацетилированных звеньев вдоль полимерной цепи, вязкости, значению рКа [10, 11] .

В первую очередь биоцидная активность хитозана определяется его аминогруппами, положительный заряд которых обуславливает связывание полимера с поверхностными структурами клеток микроорганизмов. Установлено, что увеличение степени деацетилирования хитозана усиливает его антибактериальную активность [12] .

Поскольку положительный заряд аминогрупп определяется уровнем рН среды, то максимальную антибактериальную активность хитозан проявляет в кислых условиях, а защелачивание среды ведёт к её снижению [12]. Положительный заряд позволяет хитозану связываться с анионными компонентами клеточных структур бактерий за счёт электростатического взаимодействия, а увеличение заряда полимера при закислении среды способствует более прочному связыванию хитозановой молекулы на поверхности клеток микроорганизмов .

Противоречивыми остаются сведения о влиянии молекулярной массы хитозана на его антимикробное действие. Возможно это связано с тем, что молекулы полимера сильно различающиеся по степени полимеризации имеют различные рН оптимумы для проявления своей максимальной антибактериальной активности .



Так, исходный высокомолекулярный хитозан обладает наибольшим антибактериальным эффектом в кислой среде, поскольку при значениях рН выше 6,0-6,5 его аминогруппы теряют заряд и полимер выпадает в осадок. В меньшей степени теряют эффективность антимикробного действия в среде с близким к нейтральному значению рН хитозаны с небольшой степенью полимеризации – так называемые низкомолекулярные водораcтворимые хитозаны с молекулярной массой от 2 до 50 кДа, которые получают из исходного высокомолекулярного с помощью кислотного или ферментативного гидролиза [1] .

Не менее важным в оценке биологической активности хитозана, в том числе его антибактериального действия, является молекулярно-массовая характеристика используемых в экспериментах хитозановых образцов. Поскольку часто применяемое на практике указание только молекулярной массы хитозана (обычно средневязкостной) не даёт представления о молекулярно-массовом распределении хитозановых молекул в образце. Кроме того, в случае большой степени полидисперсности образцов затрудняется интерпретация экспериментальных данных, поскольку биологический эффект хитозана может определяться минорной долей молекул с молекулярной массой, значительно отличающейся от средней для данного образца величины [13] .

Для усиления антибактериальных свойств хитозанового полимера получают его производные. Наличие реакционноспособных функциональных групп в хитозане обеспечивает возможность подобной химической модификации полимера. Производные хитозана как антибактериального агента получают с двумя целями: повысить собственно биоцидные свойства вещества либо обеспечить лучшую растворимость полимера, особенно при нейтральном и щелочном значениях рН среды .

Целью настоящей работы являлось получение производных хитозана с улучшенными антибактериальными свойствами. Для достижения цели были поставлены задачи: получить низкомолекулярный узкодисперсный хитозан; получить ацильные производные низкомолекулярного хитозана; провести исследование антибактериальной активности хитозана и его производных .

Методы исследования Низкомолекулярный узкодисперсный хитозан был получен методом деполимеризации в соляной кислоте из высокомолекулярного исходного хитозана со средневязкостной молекулярной массой 700 кДа и степенью деацетилирования 85% (ЗАО «Биопрогресс», Щёлково, Московская обл.) .

Полученный в ходе кислотного гидролиза низкомолекулярный хитозан имел степень деацетилирования 99,9%, средневесовую молекулярную массу (Mw) 8,3 кДа, индекс полидисперсности (Ip) 1,5. Средневесовую молекулярную массу и значение полидисперсности хитозана определяли методом гель-проникающей ВЭЖХ на приборе «Sykam» (Германия) c использованием тандема колонок Ultrahydrogel 250 и Ultrahydrogel 500 (Waters, США). Контроль и обсчёт хроматографии осуществляли с помощью программы «Мультихром» версия 1.6 (ЗАО «Амперсенд», Москва). Растворы хитозана стерилизовали посредством фильтрации через мембраны с диаметром пор 0,22 мкм .

Ацилированные производные низкомолекулярного хитозана получали в результате реакции между свободными аминогруппами полимера и ангидридами соответствующих жирных кислот, содержащих 2, 4, 6 и 14 атомов углерода .

Антибактериальную активность хитозана и его производных в отношении Escherichia coli и Staphylococcus aureus исследовали согласно методике [8]. Для этого готовили двойные разведения веществ в МПБ (рН 6,5), затем добавляли суспензию бактерий в той же среде до конечного количества клеток 105 КОЕ/мл. После 24 ч инкубации при 37°С определяли минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) и минимальную бактерицидную концентрацию (МБК) вещества. МИК – минимальная концентрация вещества при которой не наблюдается рост бактериальной культуры, МБК

– минимальная концентрация вещества при которой погибают 99,9% клеток .

Результаты и обсуждение Для усиления антибактериальных свойств хитозана в молекулу полимера могут быть внедрены заместители, которые способны, например, усиливать его действие на клеточные липидные мембраны. Таким образом, эти заместители должны обладать сродством к компонентам мембран и могут иметь ярко выраженные гидрофобные свойства. Нами были получены такие производные узкодисперсного низкомолекулярного хитозана. В качестве заместителя к аминогруппам хитозана были присоеденены ацильные остатки различной длины и в разном количестве (рис.1) .

Было показано, что E. coli и S. aureus обладают одинаковой чувствительностью к исходному низкомолекулярному хитозану (табл. 1). Введение С-2 ацильного (ацетильного) остатка практически никак не влияло на активность хитозана, поэтому можно сказать, что 10% ацетилирования практически не изменяет антибактериальный эффект за счёт уменьшения свободных аминогрупп, но и не улучшают таковую вследствии малого размера алкильного остатка. Введение более длинных ацилов (С-4, С-6, С-14) повышает антибактериальные свойства хитозанового полимера, особенно в отношении грам-отрицательной кишечной палочки, которая имеет внешнюю мембрану и потому обладающая хорошей мишенью на поверхности клетки для взаимодействия с модифицированными хитозанами .

–  –  –

Выводы Таким образом, в ходе работы был получен низкомолекулярный узкодисперсный хитозан, на основе которого были синтезированы производные, содержащие различные по длине ацильные заместители с различной степенью замещения. Было показано, что антибактериальная активность производных хитозана увеличивалась по сравнению с исходным немодифицированным образцом при невысокой степени замещения ацильными остатками и возрастала при увеличении длины их жирных хвостов .

Работа частично поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (грант № 09-04-99035 р_офи) .

Список литературы

1. Хитин и хитозан: получение, свойства и применение / Под ред. К.Г. Скрябина, Г.А .

Вихоревой, В.П. Варламова. - М.: Изд-во Наука, 2002. - 368 с .

2. Lim S.H., Hudson S.M. / Review of chitosan and its derivatives as antimicrobial agents and their uses as textile chemicals // J. Macromol. Sci. – 2003. - V. C43. - № 2. - P. 223-269 .

3. Rabea E.I., Badawy M.E., Stevens C.V., Smagghe G., Steurbaut W. / Chitosan as antimicrobial agent: applications and mode of action // Biomacromol. – 2003. - V. 4. - № 6. - P .

1457-1465 .

4. Rhoades J., Roller S. / Antimicrobial actions of degraded and native chitosan against spoilage organisms in laboratory media and foods // Appl. Environ. Microbiol. – 2000. - V. 66. P. 80-86 .

5. Helander I.M., Nurmiaho-Lassila E.L., Ahvenainen R., Rhoades J., Roller S. / Chitosan disrupts the barrier properties of the outer membrane of gram-negative bacteria // Int. J. Food Microbiol. – 2001. - V. 71. - P. 235-244 .

6. Liu H., Du Y., Wang X., Sun L. / Chitosan kills bacteria through cell membrane damage // Int .

J. Food Microbiol. – 2004. - V. 95. - P. 147-155 .

7. Bierbaum G., Sahl H.G. / Autolytic system of Staphylococcus simulans 22: influence of cationic peptides on activity of N-acetylmuramoil-L-alanine amidase // J. Bacteriol. – 1987. - V .

169. - P. 5452-5458 .

8. Raafat D., Bargen K., Haas A., Sahl H.G. / Insight into the mode of action of chitosan as an antibacterial compound // Appl. Env. Microbiol. – 2008. - V. 74. - № 12. - P. 3764-3773 .

9. Куликов С.Н., Тюрин Ю.А., Долбин Д.А., Хайруллин Р.З. / Роль структуры в биологической активности хитозана // Вестник Казанского технологического университета. – 2007. - № 6. - С. 10-15 .

10. Singla A.K., Chawla M. / Chitosan: some pharmaceutical and biological aspects – an update // J. Pharm. Pharmacol. – 2001. - V. 53. - P. 1047-1067 .

11. Tharanathan R.N., Kittur F.S. / Chitin – the undisputed biomolecule of great potential // Crit .

Rev. Nutr. – 2003. - V. 43. - P. 61-87 .

12. Liu X.F., Guan Y.L., Yang D.Z., Li Z., Yao K.D. / Antibacterial action of chitosan and carboxymethylated chitosan // J. Appl. Polym. Sci. – 2001. - V. 79. - P. 1324-1335 .

13. Куликов С.Н., Чирков С.Н., Ильина А.В., Лопатин С.А, Варламов В.П. / Влияние молекулярной массы хитозана на его противовирусную активность в растениях // Прикладная биохимия и микробиология. – 2006. - Т. 42. - № 2. - С. 224-228 .

14. Kong M., Chen X.G., Liu C.S., Liu C.G., Meng X.H., Yu L.J. / Antibacterial mechanism of

chitosan microspheres in a solid dispersing system against E. coli // Colloids Surface B:

Biointerfaces. – 2008. – V. 65. – P. 197-202 .

15. Ильина А.В., Куликов С.Н., Чаленко Г.И., Герасимова Н.Г., Варламов В.П. / Получение и исследование моносахаридных производных низкомолекулярного хитозана // Прикладная Биохимия и Микробиология. – 2008. - Т. 44. - № 5. - P. 606-614 .

16. Kumar A.B.V., Varadaraj M.C., Gowda L.R., Tharanathan R.N. / Characterization of chitooligosaccharides prepared by chitosanolysis with the aid of papain and pronase, and their bactericidal action against Bacillus cereus and Escherichia coli // Biochem. J. – 2005. - V. 391. - P .

167-175 .

17. Chung Y-C., Kuo C-L., Chen C-C. / Preparation and important functional properties of water-soluble chitosan produced through Maillard reaction // Bioresource Technol. – 2005. - V .

96. - № 13. - P. 1473-1482 .






Похожие работы:

«ЮБИЛЕИ И ДАТЫ Самарская Лука: проблемы региональной и глобальной экологии. 2010. – Т. 19, № 3. – С. 187-199. УДК 01+092.2 АНДРЕЙ ЛЬВОВИЧ МАЛЕНЁВ (К 50-ЛЕТИЮ СО ДНЯ РОЖДЕНИЯ) © 2010 Г.С. Розенберг; А.Г. Бакиев, О.Л. Носкова, С.В. Саксонов* Институт экологии Вол...»

«Вестник МГТУ, том 9, №5, 2006 г. стр.821-824 Изменения биохимических свойств молоди атлантического лосося при замораживании и хранении при низких температурах Л.А . Похольченко Биологический факультет МГТУ, кафедра биохимии Аннотация. Целью работы является...»

«Отделение Пенсионного фонда РФ по Республике Мордовия Новая отчетность в ПФР: "Сведения о страховом стаже застрахованных лиц" (СЗВ-СТАЖ), "Сведения по страхователю, передаваемые в ПФР для ведения индивидуального (персонифицированного) учета" (ОДВ-1). Декабрь 2017 г. Нормативно-правовая база Федерал...»

«Особенности реализации на физическом факультете ОПОП с использованием ресурсных центров Научного парка СПбГУ на примере образовательной программы "Нейтронная и синхротронная физика" Структура Научного п...»

«Известия Челябинского научного центра, вып. 4 (21), 2003 БИОЛОГИЯ УДК 574.5(28):591.553 НЕКОТОРЫЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ЦЕНОТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ НА ПРИМЕРЕ ПЛАНКТОННЫХ СООБЩЕСТВ ОЗЕР ИЛЬМЕНСКОГО ЗАПОВЕДНИКА И СОПРЕДЕЛЬНО...»

«УДК 615.074, 615.072 РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ СТАНДАРТИЗАЦИИ ТРАВЫ РЕПЕШКА ОБЫКНОВЕННОГО AGRIMONIA EUPATORIA ПО ФЛАВОНОИДАМ Ж.С. Лесовая Надземная часть репешка обыкновенного используется в народной медицине при лечени...»

«РОССИЙСКИЙ М ОРСКОЙ РЕГИС ТР СУД ОХОД СТВА Электронный аналог печатного издания, утвержденного 03.10.17 ПРАВИЛА КЛАССИФИКАЦИИ И ПОСТРОЙКИ МОРСКИХ СУДОВ Часть IX М ЕХАНИЗМ Ы НД № 2-020101-104 Санкт-Петербург украшения для одежды Правила классификации и...»

«Вестник НПУА. “Химические и природоохранные технологии”. 2016. №1 УДК 631.4 ЭКОЛОГИЧЕСКИ ЧИСТАЯ ТЕХНОЛОГИЯ ПЕРЕРАБОТКИ РЕЗИНОСОДЕРЖАЩИХ ОРГАНИЧЕСКИХ ОТХОДОВ А.А . Исаков Национальный политехнический университет Армении Рассмотрены вопросы переработки органических резиносодержащих промышленных и бытовых отходов для получе...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации САРАТОВСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ Н.Г . ЧЕРНЫШЕВСКОГО Кафедра общей геологии и полезных ископаемых "Оценка загрязнения грунтовых вод и почво-грунтов нефтепродуктами в зонах влияния автозаправочных комплексов (г. Саратов)" АВТОРЕФЕРАТ ДИПЛ...»




 
2019 www.mash.dobrota.biz - «Бесплатная электронная библиотека - онлайн публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.