WWW.MASH.DOBROTA.BIZ
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - онлайн публикации
 

«Волкова Рауза Асхатовна СИСТЕМА КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА МЕДИЦИНСКИХ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ХИМИЧЕСКИМИ И ИММУНОХИМИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ ...»

На правах рукописи

Волкова Рауза Асхатовна

СИСТЕМА КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА МЕДИЦИНСКИХ

ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ХИМИЧЕСКИМИ И

ИММУНОХИМИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ

03.00.23 - биотехнология

Автореферат

Диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

1 9 [-І0Я /Вод

Москва 2009

Работа выполнена в Федеральном Государственном учреждении науки

«Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека .

НАУЧНЫЕ КОНСУЛЬТАНТЫ

Доктор медицинских наук, профессор [Бектимиров Тагир Абдуллаевич| Петухов Валерий Георгиевич Доктор биологических наук

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Доктор медицинских наук, профессор Далин Михаил Викторович Доктор биологических наук Лютов Андрей Германович Доктор биологических наук Куралесова Альбина Ивановна

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Федеральное Государственное учреждение науки «Ростовский научноисследовательский институт микробиологии и паразитологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека .



Защита состоится 10 декабря 2009г. в 10 часов на заседании диссертационно­ го совета Д 208.046.01 при Федеральном Государственном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, г.Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10 .

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора .

Автореферат разослан «_ 2009г .

Ученый секретарь диссертационного совета, О.Ю.Борисова доктор медицинских наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Широкое применение медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП), направленных на профилактику, лечение и диагностику инфекционных за­ болеваний, определяет повышенные требования к их эффективности и безопасности .

В современных условиях рынок иммунобиологических препаратов является международным, требования к их качеству регламентируются соответствующими международными правилами как на этапах лабораторных исследований - правила GLP (Good Laboratory Practice) и клинических испытаний - правила GCP (Good Clinical Practice), так и на этапе производства - правила GMP (Good Manufacturing Practice) .

Соблюдение международных правил обязательно для всех стран входящих в мировую систему ВТО (Всемирная торговая организация). Россия предпринимает меры по вхождению в ВТО и, следовательно, требуется организация работ по вы­ полнению требований GLP, GCP и GMP как со стороны разрабатывающих и выпус­ кающих МИБП организаций, так и со стороны ГИСК им.Л.А.Тарасевича .

В Российской Федерации в этом плане достигнуты определенные позитивные сдвиги. Так, утвержден ГОСТ Р 52249-2004 «Правила производства и контроля ле­ карственных средств», положения которого гармонизированы с Руководством GMP, принятым в Европейском союзе. Выполнение этих стандартов гарантирует высокий уровень осуществляемых функций предприятием и контролирующими органами .



Правила GMP устанавливают требования к персоналу, помещениям, оборудо­ ванию, документации, производству продукции, проведению анализов, системе обеспечения и контроля качества и др .

Анализ современного состояния вопроса о контроле качества свидетельствует о том, что эта деятельность базируется на нескольких элементах, в том числе: мето­ дики, валидация, техническое обеспечение/оборудование, стандартные образцы, до­ кументирование, персонал .

В настоящее время в нашей стране проблемам обеспечения качества лабора­ торных исследований уделяется большое внимание, принята система мер по повы­ шению качества лабораторных исследований в учреждениях здравоохранения и микробиологической промышленности .

Одним из основных элементов системы обеспечения качества является вали­ дация - составляющая GMP, которая подтверждает, что поддерживающие системы, оборудование, процессы и методы контроля находятся на должном уровне, поэтому производится продукт, соответствующий требованиям нормативной документации (WHO TRS 822, ГОСТ Р 52249, СП 3.3.2.1288) .

Аналитические методы позволяют судить об адекватности функционирования системы производства .

Валидация метода - это процесс установления пригодности метода или мето­ дики для оценки качества конкретной продукции в соответствии с требованиями нормативных документов (WHO 1999, ICH Q2A и Q2B, Eurachem 1998). Необходимость валидации аналитических методов при контроле МИБП определена между­ народными документами, рекомендациями Всемирной организации здравоохране­ ния, а также отечественными нормативными документами .

В мировой практике разработка, промышленное освоение и методы контроля современных МИБП носят наукоемкий характер. Расширение номенклатуры МИБП, понимание механизмов иммунного ответа на молекулярном уровне, использование достижений генной инженерии требует разработки новых методов контроля или расширения области применения существующих, повышает требования к уровню их разработки, прежде всего, с учетом современных требований валидации. Данный подход широко используется в работе национальных органов контроля в странах с развитой экономикой - Великобритании, Германии, Голландии, США и др .

Применение валидированных и стандартизованных методов является одним из необходимых условий выполнения международных стандартов GLP, GCP и GMP в Российской Федерации, а также требований к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий. Однако в настоящее время применительно к контролю МИБП нет единого мнения, как устанавливать валидационные характеристики. Бо­ лее того, понимание терминов еще не однозначно и окончательно не сложилось .

Контроль качества МИБП не может проводиться без стандартных образцов, которые используются и как мера сравнения, и для внутрилабораторного контроля качества работы аналитической лаборатории .



В отсутствии эталонов порядок атте­ стации стандартных образцов становится не простой задачей, основой для создания стандартных образцов становится сама измерительная процедура. Аттестация долж­ на проводиться валидированными методами, поскольку только при этом условии можно обеспечить корректное установление доверительного интервала для аттесто­ ванной характеристики стандартного образца и результата анализа, полученного при его использовании .

В связи с этим разработка методологии валидации и аттестации стандартных образцов МИБП, а также методических основ контроля качества МИБП с использо­ ванием современных химических, иммунохимических, молекулярно-биологических методов является актуальным .

Как известно, при разработке, производстве и контроле качества МИБП ак­ тивно используются такие химические методы, как определение белка, консерван­ тов, сорбента, иммунохимические методы, интенсивно разрабатываются и внедряют­ ся методы на основе амплификации ДНК. В связи с усовершенствованием прибор­ ной, реагентной базы возникает необходимость модернизации известных методов и разработки новых. С другой стороны, возрастающие научно-методические и техно­ логические возможности конструирования новых МИБП, средств для генной тера­ пии, в том числе получаемых с помощью методов современной биотехнологии и нанотехнологии, остро ставят задачу совершенствования системы контроля меди­ цинских препаратов. Поскольку эта проблема является многоплановой, т.к. включает научный, технологический, технический, человеческий факторы, то ее решение мо­ жет быть постепенным. С нашей точки зрения, в первую очередь внимание должно быть направлено на методики, их валидацию, внедрение и создание стандартных об­ разцов. Одновременно такие исследования в большой степени помогли бы сформи­ ровать новое поколение специалистов, востребованных в сфере разработки, произ­ водства и контроля качества МИБП .

В связи с этим цель работы состояла в создании методологической базы кон­ троля качества МИБП как основного элемента системы контроля качества данных препаратов .

Цель исследования Создание методологической базы системы контроля качества МИБП на мо­ дели химических и иммунохимических методов .

Задачи исследования

• Разработка методологии валидации стандартизованных (определение белкового азота с реактивом Несслера и Ви-антигена методом РИЭФ) и вновь разра­ батываемых методов контроля МИБП на примере определения БСА методом РИЭФ и ИФА, мертиолята атомно-абсорбционной спектрометрией, хлороформа колори­ метрическим методом, фенола методом ГЖХ .

Разработка стандартных образцов для определения показателей качест­ ва МИБП - содержания Ви-антигена, белка, БСА .

• Создание стандартных образцов для оценки работы лабораторий по контролю качества МИБП ГИСК имЛА.Тарасевича и предприятий-изготовителей МИБП на примере стандартных образцов содержания белкового азота, алюминия, мертиолята, молекулярного состава препаратов иммуноглобулинов..„

• Валидация ПЦР тест-систем на примере набора реагентов «АмплиСенс НВ Монитор FRT» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора РФ) для количественного определения ДНК вируса гепатита В в плазме крови человека .

Научная новизна исследования .

Впервые в отечественной практике разработана методология валидации стандартизованных и вновь разрабатываемых химических методов контроля МИБП .

Установленные с использованием данного подхода показатели точности методик позволяют использовать научно обоснованные критерии для сравнения результатов контроля в ГИСК им. Л.А.Тарасевича и на предприятиях-изготовителях МИБП .

Впервые показана значимость предложенной методологии валидации химиче­ ских методов контроля для стандартизации контроля количественных ПЦР тестсистем .

Впервые в области контроля МИБП внедрены стандартные образцы для оцен­ ки правильности определения белкового азота в очищенных анатоксинах, вакцинах, аллергенах, а также мертиолята и алюминия в сорбированных препаратах; показа­ на целесообразность применения стандартных образцов для оценки соответствующих анализов в.межлабораторных испытаниях .

Разработаны стандартные образцы как мера сравнения для определения спе­ цифически активного компонента (Ви-антигена, белка в иммуноглобулинах), примеси (БСА), стандартный образец для калибрования хроматографической системы при определении показателя «молекулярные параметры» в иммуноглобулинах .

Разработаны с учетом требований валидации методики количественного оп­ ределения БСА методом РИЭФ, мертиолята с помощью отечественного атомноабсорбционного спектрометра KBAHT-Z.3TA, хлороформа по цветной реакции с резорцином, использующиеся при контроле МИБП .

Теоретическая значимость работы .

Теоретическая значимость работы определяется формированием научных ос­ нов методологии валидации химических и иммунохимических методов, использую­ щихся в системе контроля качества МИБП, что необходимо для осуществления ста­ тистического подхода к контролю качества .

Практическая значимость работы Практическая значимость работы определяется внедрением системы контроля качества МИБП на основе использования стандартных образцов и химических и иммунохимических методик с установленными валидационными характеристиками в ГИСК им.Л.А.Тарасевича и на предприятиях-изготовителях МИБП .

Использование аттестованных образцов позволило стандартизовать условия проведения соответствующих анализов при контроле МИБП (определение Виантигена в брюшнотифозной вакцине, белкового азота, мертиолята и алюминия в полуфабрикатах и готовой продукции анатоксинов и вакцин, БСА в культуральных вирусных вакцинах, белка и молекулярных параметров в препаратах иммуноглобу­ линов, аналитической чувствительности ПЦР тест-систем для выявления ДНК виру­ са гепатита В) на предприятиях по производству МИБП и ГИСК им. ЛА.Тарасевича и получать объективные данные .

Применение разработанных и охарактеризованных на основе проведенной ва­ лидации химических и иммунохимических методик контроля качества МИБП по­ зволило унифицировать определение БСА, мертиолята и хлороформа, а также ис­ пользовать обоснованные критерии для сравнения результатов контроля в ГИСК им .

Л.А.Тарасевича и на предприятиях-изготовителях МИБП при определении белково­ го азота, мертиолята, алюминия, БСА, белка с биуретовым реактивом .

Внедрение в практику результатов работы ОСО содержания Ви-антигена (ОСО 42-28-383-2005) используется при кон­ троле качества брюшнотифозной вакцины «Вианвак» (ФСП 42-0112-0274-05) .

ОСО содержания белка в иммуноглобулинах (ОСО 42-28-340-08П) и ОСО для калибрования хроматографической колонки (ОСО 42-28-301-06П) используются при контроле зарубежных и выпускаемых в Российской Федерации препаратов им­ муноглобулинов (ФСП 42-0504-6733-05, ФСП 42-0504-6732-05 и др.) .

ОСО содержания БСА (ОСО 42-28-328-07) используется при контроле качест­ ва культуральных вирусных вакцин: герпетических (ФСП 42-0107-4707-03, ФСП 42-0022-3841-03), антирабических (ФСП 42-4046-07, ФСП 42- 0504- 7029-05), вакцины против клещевого энцефалита (ФСП 42-0070-5497-04), вакцины гепатита А (ФСП 42-0168-0478-06) .

ОСО содержания белкового азота (ОСО 42-28-322-06П) используется для контроля правильности проведения анализа в полуфабрикатах анатоксинов и вак­ цин; в неинфекционных аллергенах (ФСП 42-0504-3763-04, ФСП 42-0504-3762-04, ФСП 42-0504-3764-04, ФСП 42-0010-1828-01, ФСП 42-0010-1739-01 и др.) исполь­ зуется ОСО содержания белкового азота ОСО 42-28-303-04 .

ОСО содержания мертиолята (ОСО 42-28-334-09П, ОСО 42-28-334а-9П) и ОСО содержания алюминия (ОСО 42-28-ЗЗЗа-09П и ОСО 42-28-333-09П) использу­ ются для контроля правильности проведения соответствующих анализов в сорбиро­ ванных препаратах (анатоксины и АКДС вакцины по ФСП 42-0504-5805-04, ФСП 42-0504-5804-04, ФСП 42-0504-4423-04, ФСП 42-0504-4424-04; ФСП 42-0010-4377ФСП 42-0010-4375-03, ФСП 42-0010-4376-03; вакцины гепатита В по ФСП PN000738/01-191107, ФСП 42-0505-5653-0 и др.) .

ОСО содержания ДНК гена HBsAg вируса гепатита В (ОСО 42-28-332П) используется при контроле ПЦР тест-систем для выявления данного возбу­ дителя в плазме и сыворотке крови человека (ФСР 2007/00584, ФСР 2007/00585, ФСР 2007/00586, ФСР 2007/00813) .

Разработанные ОСО внесены в Реестр Национальных стандартов МИБП .

Определение БСА методом ракетного иммуноэлектрофореза включено в МУК 4.1/4.2.588-96, ФС 42-3874-99 «Физико-химические, химические, физические и иммунохимические методы контроля медицинских иммунобиологических препара­ тов» и проект общей фармакопейной статьи в ГФ XII (том 3), введено в НД на 6 культуральных вирусных вакцин на пяти производствах. Валидированная ИФА тестсистема для определения БСА введена в НД на 3 живые культуральные вирусные вакцины (ФСП 42-0504-7362-06, ФСП 42-2975 -07, ФСП 42-0504-0988-07, ФСП 42Колориметрический метод определения хлороформа введен в НД на 5 наименований антитоксических сывороток на трех производствах (ФСП 42-0504ФСП 42-0504-6561-05, ФСП 42-0504-5438-04, ФСП 42-0504-0745-05, ФСП 42-0504-3277-04) .

Определение мертиолята с помощью атомно-абсорбционного спектрометра KBAHT-Z.3TA включено в проект общей фармакопейной статьи для ГФХІІ (том 3) и используется при контроле мертиолята в МИБП в ГИСК им.Л.А.Тарасевича .

На основе материалов диссертации разработаны Методические указания 3.3.2.1886-04 «Валидация методов контроля химических и физико-химических пока­ зателей качества МИБП: организация, порядок проведения и представления резуль­ татов», М.,2004, а также проект общей фармакопейной статьи по валидации методов для ГФ XII. Материалы диссертации включены в лекции на ежегодном семинаре ГИСК им. Л.А.Тарасевича по GMP для сотрудников предприятий-изготовителей МИБП и использованы на обучающем семинаре ВОЗ по системе регулирования вакцин для Национальных органов контроля стран СНГ (г.Алма-Ата, 2008 г.) .

Совокупность новых научных результатов, выносимых на защиту

1. Разработанная методология валидации химических методов контроля каче­ ства МИБП позволяет в соответствии с современными международными требованиями оценить прецизионность, диапазон линейности и пределы определения стандартизованных и вновь разрабатываемых химических, иммунохимических, молекулярно-биологических методов при количественном определении специфически активного компонента, консервантов и примесей .

2. Разработанные на основе методологии валидации методы оценки качества МИБП по содержанию Ви-антигена, БСА, хлороформа, мертиолята обеспечивают достоверность и воспроизводимость контроля МИБП в ГИСК и на предприятияхизготовителях МИБП .

3. Разработанные ОСО содержания Ви-антигена, белка, БСА позволяют стан­ дартизовать методы контроля специфически активного компонента и гетерологичных примесей МИБП .

4. Разработанные ОСО содержания белкового азота, ОСО содержания мер­ тиолята и ОСО содержания алюминия позволяют проводить оценку стабильности результатов аналитической лаборатории при контроле данных показателей, а также проводить оценку работы аналитических лабораторий в межлабораторных испытаниях .

Личный вклад автора Основные результаты получены в лаборатории биохимии и биотехнологии ГИСК им.Л.А.Тарасевича самостоятельно и под руководством автора в рамках ис­ следований в соответствии с основными планами научных исследований ГИСК им.Л.А.Тарасевича - договора №№ 737/089/024 и 034/089/009 с Минздравом России

- Отраслевая научно-исследовательская программа «Эпидемиология и микробиоло­ гия» и договор с Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребите­ лей и благополучия человека № 73-Д в рамках отраслевой научноисследовательской программы «Научные аспекты обеспечения санитарноэпидемиологического благополучия в Российской Федерации на 2006-2010 годы» .

Апробация материалов диссертации Диссертация апробирована на заседании Ученого совета ФГУН ГИСК им .

Л.А.Тарасевича Роспотребнадзора - протокол № 9 от 23 июня 2009 г. Основные экс­ периментальные материалы и положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на VII и VIII съездах Всероссийского общества эпидемиологов и пара­ зитологов, Москва, 1997, 2002 гг.; Всероссийских научно-практических конференциях «Генодиагностика в современной медицине», Москва, 2000, 2002, 2007 гг.; Всероссийских конференциях по вакцинологии «Медицинские иммуно­ биологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций», Москва, 2004, 2006, 2008 гг.; Второй международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность», Москва, 2005 г.; конференции «Но­ вые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекцион­ ных заболеваний», Нижний Новгород, 2006 г .

Публикации По материалам диссертации опубликовано 36 научных работ, в статьях -18 (в том числе 8 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, 10 - в периодических изданиях), в материалах всероссийских и международных конференций - 14, Общая Фар­ макопейная статья - 1, методических указаний, утвержденых МЗ РФ - 1, методиче­ ских рекомендаций, утвержденых Роспотребнадзором РФ - 1, утвержденных ГИСК им.Л.А.Тарасевича - 1 .

Объем и структура диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы. Библиография включает 275 источников, в том числе 90 отечественных и 185 - зарубежных. Работа изложена на 276 страницах машино­ писного текста, включает 86 таблиц, 33 рисунка .

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы исследования Вакцины паротитная, коревая, паротитно-коревая и полуфабрикаты к ним, АКДС, АС, АД, АДС, антитоксические сыворотки (противодифтерийная, противо­ столбнячная, противоботулинические, противозмеиная) производства ФГУП «НПО «Микроген». Вакцина «Вианвак» и полуфабрикат к ней, производство ООО «Гритвак». Вакцина «Typhim і» («Тифим Ви») производства Авентис Пастер, Франция .

АКДС вакцина, анатоксины: дифтерийный, столбнячный, дифтерийно-столбнячный производства ОАО «Биомед» им.И.И.Мечникова, Петрово-Дальнее (далее «Биомед»). Вакцины герпетическая, антирабическая, гриппозные, против клещевого эн­ цефалита, гепатита В, гепатита А различных изготовителей .

Сыворотка преципитирующая белки сыворотки крови рогатого скота (СРС) адсорбированная кроличья диагностическая для судебно-медицинских целей жидкая и сыворотка преципитирующая белки сыворотки крови крупного рогатого скота (СКРС) кроличья диагностическая для судебно-медицинских целей жидкая, произ­ водство ФГУП Санкт-Петербургский НИИВС .

Сыворотка кроличья против Ви-антигена производство 0 0 0 «Гритвак» .

Наборы для определения БСА производства фирмы "Cygnus Technologies, Inc.", США .

Наборы для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) «АмплиСенс НВ Монитор FRT» производства ЦНИИЭ Роспотребнадзора РФ .

Международный стандартный образец ДНК вируса гепатита В (National Insti­ tute of Biological Standards and Control (NIBSC), Великобритания), содержащий ви­ рус гепатита В генотип А, субтип adw2 - 5x105 международных единиц в ампуле (МЕ/амп) .

Образцы от больных гепатитом В для ПЦР исследований были предоставлены клиническими инфекционными больницами № I и № 2 г.Москвы .

Препарат рекомбинантной плазмиды рВН320, несущей вставку участка ДНК генома вируса гепатита В, кодирующей области HBsAg и HBcAg вируса гепатита В, любезно предоставлен к.м.н. Шипулиным Г.А., ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора РФ .

Методы исследования Определение химических показателей: общего и белкового азота с реактивом Несслера, белка по методу Лоури, белка с биуретовым реактивом, ионов алюминия комплексонометрическим методом, молекулярных параметров полисахаридов и иммуноглобулинов методом гель-фильтрации проводили по ФС 42-3874-99 .

Определение Ви-антигена проводили методом РИЭФ по ФСП 42-0112-0274-05 .

Высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) проводили на хроматографе 2695 «Alliance» фирмы Waters, США с детектором с фотодиодной матрицей, системой Empower, колонкой TSK-G 3000 SWXL, размером 7,8 х 300 мм, диаметром частиц 5 мкм с предколонкой .

Определение фенола методом ГЖХ проводили на хроматографе Fisons 8000 (Великобритания) с пламенно-ионизационным детектором, колонка SE-54 (непод­ вижная фаза - неполярный силиконовый каучук) диаметром 0,15 мм и длиной 20 м .

ИФА проводили в соответствии с инструкцией по применению набора «Immunoenzymetric Assay for the Measurement of BSA» («Cygnus Technologies, Inc.», США) .

ПЦР проводили в соответствии с инструкциями по применению наборов «АмплиСенс НВ Монитор FRT» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) и «Cobas Amplicor HBV Monitor test» («Хоффманн Ла-Рош», Швейцария) .

Рестрикционный анализ плазмиды рВН320 проводили согласно общеприня­ той методике [Маниатис Т., 1984] .

Статистическую обработку результатов проводили с использованием про­ граммного обеспечения Excel: расчет среднего арифметического, стандартного от­ клонения, стандартной ошибки среднего, достоверности различия средних, регрес­ сионный анализ, дисперсионный анализ [Гланц С, 1999, Дерффель К., 1994] .

Расчеты линейности и параллелизма при аттестации стандартных образцов проводили по программе «Паралайн» [Петухов, 2004] .

Приготовление лиофилизированного ОСО содержания БСА для метода РИЭФ было проведено совместно с предприятием по производству бакпрепаратов Белорусского НИИЭМ .

Разработка программы проведения межлабораторпых испытаний определения белкового азота в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725 и статистическая обработка полученных результатов была проведена совместно с группой специалистов лабора­ тории метрологии ВНИИНП (руководитель - Гринэ М.М.) .



Экспериментальные материалы, необходимые для аттестации ОСО содержа­ ния Ви-антигена и валпдации метода РИЭФ для определения Ви-аптигена были по­ лучены совместно с сотрудниками лаборатории иммунохпмической диагностики НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН РФ .

Экспериментальные материалы, необходимые для проведения валпдации ИФА тест-системы "Cygnus Technologies, Inc.", США, были получены совместно с сотрудниками иммунохпмической лаборатории Московского подразделения по производству бактерийных препаратов ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ .

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. РАЗРАБОТКА МЕТОДОЛОГИИ ОЦЕНКИ ВАЛИДАЦИОННЫХ

ХАРАКТЕРИСТИК СТАНДАРТИЗОВАННЫХ ХИМИЧЕСКИХ И

ИММУНОХИМИЧЕСКИХ МЕТОДОВ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА МИБП .

1.1.Определение белкового азота с реактивом Несслера .

Содержание белкового азота отражает количество специфически активного вещества в анатоксинах (стандартизуются по активности на единицу содержания белкового азота) и аллергенах (стандартизуются по содержанию белкового азота) .

Определение белкового азота проводят после предварительного осаждения белка и его минерализации. Белковый состав анализируемых препаратов существенно раз­ личается, поэтому различаются способы осаждения белка: с помощью ТХУ для вы­ сокомолекулярных белков (для анатоксинов и вирусных вакцин) и с помощью ФВК для пептидов и низкомолекулярных белков (для аллергенов). Методики являются трудоемкими, состоят из нескольких этапов и занимают 5-6 дней. В связи с этим для контроля правильности определения белкового азота было необходимо разработать ОСО для обоих вариантов методики и с их использованием установить валидационные характеристики в соответствии с современными требованиями .

1.1Л. Разработка стандартного образца для контроля правильности опре­ деления белкового азота .

Для неинфекционных аллергенов ОСО был разработан на основе амброзийного аллергена - ОСО(І), для остальных препаратов ОСО был разработан на основе раствора БСА (растворитель - 0,15 % калия хлорид, 0,01 % натрия гидрокарбонат, рН 6,8) - ОСО(И). Аттестованные характеристики стандартных образцов были опре­ делены в межлабораторных испытаниях с участием лабораторий, проводящих соот­ ветствующие виды анализа. Аттестованную характеристику устанавливали как ин­ тервал, в который должны укладываться результаты исполнителей с вероятностью 95 %, и рассчитывали как Хср.ср + 2 S (Хср.ср - общее среднее арифметическое, S стандартное отклонение). Для ОСО(І) аттестованная характеристика составила 0,088 ± 0,009 мг/мл (п=40), для ОСО(П) - 0,221 + 0,013 мг/мл (п=180) .

Для оценки характеристик методики с использованием разработанных стандартных образцов в ФГУН ГИСК им.Л.А.Тарасевича Роспотребнадзора (далее ГИСК) и на предприятиях провели 10-кратное определение белкового азота в ОСО одномоментно (внутрисерийная сходимость) и в разные дни (внутрилабораторная воспроизводимость) .

При оценке внутрилабораторной воспроизводимости методики определения белкового азота с применением ФВК в диапазоне 0,02 - 0,12 мг/мл коэффициент ва­ риации не превышал 7,1 %. При оценке внутрилабораторной воспроизводимости методики определения белкового азота с применением ТХУ для верхнего диапазона концентраций (0,2 - 0,6 мг/мл) коэффициент вариации не превышал 6 %, для ниж­ него диапазона (около 0,01 мг/мл) - 16 % .

Для обоих вариантов методики коэффициент вариации при оценке воспроиз­ водимости был в 1,5 - 2 раза выше коэффициента вариации при оценке сходимости .

Разработанные стандартные образцы в течение 3 лет направляли ежегодно на предприятия для проведения внутрилабораторного контроля качества данного вида анализа. Согласно отчетам предприятий в первый и второй год использования стан­ дартных образцов на основе БСА отдельные результаты выходили за пределы атте­ стованной характеристики ОСО в 4 из 6 предприятий, в третий год - все полученные результаты были в пределах аттестованной характеристики, что свидетельствовало об удовлетворительной правильности анализа .

Через 3 года с использованием новой серии стандартного образца была про­ ведена оценка сопоставимости результатов ГИСК и предприятий по производству МИБП, использующих методику определения белкового азота с осаждением ТХУ .

Исследование состояло в проведении испытаний на растворе БСА с содержанием белкового азота 0,15 мг/мл. В работе принимали участие предприятие НИИПВЭ РАМН СССР (далее ИПВЭ), Ленинградский, Уфимский, Пермский, Томский НИИ вакцин и сывороток, Казанский НИИЭМ (названия предприятий даны на момент проведения испытаний). Каждый участник получил 5 ампул образца и провел одно­ моментно 10 определений по два параллельных определения из каждой ампулы .

Общее распределение результатов испытаний представлено на гистограмме (рис.1), из которой видно, что основная масса результатов находится в области 0,15 мг/мл белкового азота, Хер составило 0,147 мг/мл, S = 0,01 мг/мл, однако наметился дополнительный максимум в области 0,13 мг/мл, в основном за счет результатов участников №1 и№2. Несмотря на несимметричность, в целом распределение ре­ зультатов не противоречит нормальному закону: медиана, равная 0,149 мг/мл, и среднее арифметическое, равное 0,147 мг/мл, практически совпадают, все результа­ ты укладываются в интервал + 2S. В связи с этим из расчетов не мог быть исключен ни один крайний результат .

–  –  –

Рисунок 1. Распределение результатов всех участников испытаний Таким образом, несмотря на удовлетворительные результаты при использова­ нии ОСО содержания белкового азота по данным отчетов производственных лабора­ торий, межлабораторные испытания с новым образцом показали расхождение ре­ зультатов, требующие установления источника расхождений .

1.1.2.0ценка валіідационных характеристик методики определения белко­ вого азота .

С целью выяснения возможных источников расхождения результатов, а также с целью оценки валидационных характеристик методики в соответствии с современ­ ными рекомендациями ВОЗ и стандартов ИСО, совместно с группой специалистов под руководством сотрудника лаборатории метрологии ВНИИНП Гринэ М.М была разработана программа межлабораторных испытаний по определению белкового азо­ та с участием ГИСК и предприятий по производству МИБП, применяющих данную методику. Межлабораторные исследования провели дважды. Участники испытаний, кроме ГИСК, не повторялись .

В первых испытаниях участвовали ГИСК и три предприятия по производству МИБП, расположенные в г.Москве: ИПВЭ, предприятие НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи, предприятие НИИВП. Для испытаний использовали 3 образца с концентрацией белкового азота около верхнего и нижнего предела содержания показателя в МИБП, а также в середине диапазона: ОСО содержания белкового азота с концентрацией 0,06 мг/мл и 2 серии очищенного дифтерийного анатоксина производства Пермского НПО «Биомед» с концентрацией около 0,2 и 0,3 мг/мл белкового азота .

Вторые межлабораторные испытания были проведены с участием ГИСК и трех других предприятий - Томского, Уфимского, Пермского филиалов ФГУП «НПО «Микроген». Для испытаний использовали ОСО содержания белкового азота с концентрацией 0,175 мг/мл, 2 серии очищенного дифтерийного анатоксина с кон­ центрацией белкового азота около 0,1 и 0,12 мг/ мл, приготовленные для испытаний ОАО «Биомед» им.И.И.Мечникова, столбнячный анатоксин (Уфимский филиал ФГУП «НПО «Микроген») с концентрацией белкового азота по данным предпри­ ятия 0,45 мг/мл .

Все образцы были зашифрованы, коды проб не повторялись. Образцы иссле­ довались каждым участником трижды: в первых испытаниях, благодаря участию только московских предприятий, удалось обеспечить одновременное проведение каждого этапа во всех лабораториях с интервалом в 1 неделю, во вторых испытаниях интервал у разных участников был от 1 недели до 2 мес. На предприятиях анализ проводили в химической группе ОКК. Результаты каждый участник оформил по разработанному нами протоколу, который включал указание конкретных условий анализа, результаты измерения оптической плотности и расчет белкового азота .

По данным оптической плотности, указанным в протоколе испытаний, мы провели построение калибровочного графика и расчет содержания белкового азота для каждого из участников с помощью программы Excel (таблица 1) .

Все участники первых испытаний построение калибровочного графика про­ водили вручную. Нами было выявлено различие результатов, полученных участни­ ками испытаний, и результатов, рассчитанных нами. Максимальное различие соста­ вило 0,014 мг/мл для наибольшей концентрации, что в пересчете на белок составляет около 0,08 мг/мл. Наибольшие различия выявлены для участника №4 .

Во вторых испытаниях все участники построение калибровочного графика и расчет содержания белкового азота проводили с помощью программы Excel, резуль­ таты, представленные участниками, и результаты, рассчитанные нами, практически совпали .

Таким образом, способ обработки первичных результатов может иметь значе­ ние при оценке результатов изучения прецизионности и правильности методики и должен быть указан в методике. В дальнейшем оперировали результатами, рассчи­ танными нами .

–  –  –

Результаты статистической обработки по образцам представлены в таблице 2 .

Размах средних между лабораториями в первых испытаниях составил 0,015 мг/мл для наименьшей концентрации, и 0,079 мг/мл для наибольшей концентрации, что в пересчете на белок достигает значительной величины - 0,11 и 0,44 мг/мл соот­ ветственно .

–  –  –

Оценка прецизионности .

Оценка стандартного отклонения для каждого участника (таблица 1) показала, что оно не постоянно и увеличивается с увеличением концентрации (рисунок 2) .

Как видно из таблицы 1, коэффициент вариации результатов участников ко­ леблется в первых испытаниях от 2,3 % до 9,8 %, во вторых испытаниях - от 1,5 % до 15,4 %, превышая коэффициент вариации, полученный в предыдущих исследованиях на образцах без шифрования .

Во вторых испытаниях у двух участников - №1 и №4 - коэффициент вариации достигает 10 - 15 %, что значительно выше, чем в первых испытаниях. В лаборато­ рии №4 это связано с набором нового персонала, в лаборатории №1 - с использова­ нием морально устаревшего оборудования .

Расчет предела прецизионности показал, что разница в содержании белкового азота около 0,1 мг/мл различается только на внутрилабораторном уровне .

A

–  –  –

Рисунок 2. Стандартное отклонение (S) результатов участников межлабораторных испытаний в зависимости от среднего значения белкового азота (S пропорционально площади окружности) .

А - Первые испытания. В - Вторые испытания .

Оценка правильности Результаты участников различаются по смещению относительно общего среднего (рисунок 3) .

В первых испытаниях, если исключить результаты участника №4 в связи с тем, что он не выполнил точно процедуру методики, участником №1 были получены несколько более высокие результаты (рис.3). Анализ протоколов испытаний данно­ го участника показал, что это связано с использованием свежеприготовленных рас­ творов 20 % ТХУ. На основании полученных результатов в методику введено требо­ вание периодического контроля концентрации исходного раствора ТХУ и приго­ товленных из него 10 % и 20 % растворов .

Смещение средних результатов для каждого участника по отношению к об­ щему среднему во вторых испытаниях оказалось меньше, чем в первых, и не превы­ сило 0,02 мг/мл. На наш взгляд это связано с тем, что для участников вторых испы­ таний (за исключением участника №1) определение белкового азота в диапазоне концентраций 0,1 - 0,15 мг/мл является рутинным анализом, при проведении кото­ рого периодически используется ОСО содержания белкового азота .

–  –  –

Рисунок 3. Отклонение средних по лабораториям от общего среднего в первых испытаниях: 1 - образец А, 3 - образец В, 5-образец С Оценка линейности Проведено изучение калибровочных графиков всех исполнителей: оценены линейность и коэффициенты наклона и сдвига .

Линейность оценивали несколькими способами. На основании коэффициен­ тов корреляции и детерминации ( 0,99) и более чувствительным методом - по гра­ фикам остатков, подтверждена линейная зависимость оптической плотности от концентрации азота для всех участников испытаний. Для участника № 4 первых ис­ пытаний графики остатков (рис.4) свидетельствовали о практической идентичности калибровочных графиков в трех определениях. Аналогичный вывод можно было сделать в результате изучения изменения оптической плотности на единицу изме­ нения содержания белкового азота и оценки коэффициента сдвига (рис.5). Этот факт объясняется тем, что исполнитель строил калибровочный график только в первой серии определений, а затем использовал полученный график для второй и третьей серии определений. Этим же объясняется наибольшая разница между результатами данного участника и нашими результатами обработки его первичных данных .

Таким образом, линейность калибровочного графика, как и следовало ожи­ дать для стандартизованных методов, показана для всех участников межлабораторных испытаний, применение графиков остатков позволило выявить отступление от процедуры построения калибровочного графика одним из участни­ ков испытаний .

Рисунок 4. Графики остатков для калибровочного графика при определении со­ держания белкового азота участником №4 .

0.017

–  –  –

Рисунок 5. Сравнение остаточных стандартных отклонений для точек калибро­ вочного графика при определении белкового азота в первых межлабораторных испытаниях участниками №№1-4 .

Проведение испытаний и представление результатов по разработанным нами программе и формам отчетности в соответствии с рекомендациями ГОСТ Р ИСО 5725 позволили оценить воспроизводимость изучаемой методики на межлаборатор­ ном уровне и выявить отклонения от некоторых позиций, которые могут быть след­ ствием нарушения регламентированной методики или допускаться аналитическими лабораториями из-за возможности неоднозначного понимания отдельных этапов вследствие недостаточно детального изложения процедуры. Указанные причины обусловили несогласованность результатов анализа между лабораториями. Для улучшения воспроизводимости методики разработана типовая стандартная операци­ онная процедура определения белкового азота, которая предоставляется слушателям курсов по GMP в ГИСК. Кроме того, очевидно, что для своевременного выявления отклонений от методики целесообразно периодическое проведение межлабораторных испытаний, так как регулярное инспектирование сотрудниками ГИСК им.Л.А.Тарасевича аналитических лабораторий предприятий -изготовителей МИБП в настоящее время не проводится .

На модели метода определения белкового азота в МИБП разработана методо­ логия валидации стандартизованных химических методик контроля МИБП, заклю­ чающаяся в оценке прецизионности в условиях получения независимых результатов (анализ не менее трех образцов в необходимом диапазоне концентраций, не менее, чем трехкратное /оптимально - пятикратное/ повторение анализа) и правильности методики при сравнении с аттестованным значением стандартного образца содержа­ ния белкового азота. Предложенный алгоритм обеспечивает число степеней свобо­ ды, необходимое для объективной оценки прецизионности .

Полученные результаты показали целесообразность для оценки линейности методики использовать анализ графиков остатков, что особенно важно для вновь разрабатываемых методик контроля качества МИБП .

Использование ОСО содержания белкового азота позволяет оценить правиль­ ность и стабильность проведения данного вида анализа в ГИСК им.Л.А.Тарасевича и на предприятиях по производству МИБП. Проведенные межлабораторные испыта­ ния показали, что для объективной оценки работы лабораторий целесообразно ис­ пользование не менее двух образцов с близким содержанием аттестуемой величины, чтобы, используя их в зашифрованном виде, исключить влияние субъективного фак­ тора .

1.2. Определение Ви-антигена в брюшнотифозной вакцине «Вианвак» .

1.2.1.Аттестация ОСО содержания Ви-антигена .

Одними из немногих вакцин, в которых определение специфической активно­ сти проводится химическими методами, являются бактерийные полисахаридные вакцины. Вакцина «Вианвак» производства ООО «Гритвак» представляет собой рас­ твор очищенного лиофилизированного полисахарида, полученного из Salmonella typhi. Специфическая активность обеспечивается содержанием 50 мкг/мл Виантигена, количество которого определяется РИЭФ. Метод предполагает использо­ вание калибровочного графика при каждом анализе. В качестве стандартного об­ разца используют одну из серий брюшнотифозной вакцины «Вианвак», аттестован­ ную как ОСО содержания Ви-антигена. Для аттестации ОСО используется очи­ щенный лиофилизированный Ви-полисахарид, являющийся субстанцией вакцины (раствор, приготовленный по точной навеске). Однако, разные серии полисахарида различаются между собой в пределах требований нормативной документации, а го­ товые серии вакцины отличаются по составу от субстанции, что может влиять на результаты определения содержания Ви-антигена методом РИЭФ в целом, и на ат­ тестацию ОСО в частности .

Было изучено влияние вышеуказанных различий на результат аттестации .

Для того, чтобы избежать эффекта множественных сравнений, на одном стекле ана­ лизировали 3 образца: кандидат в ОСО - вакцина «Вианвак» (серия 181), субстанция к этой серии и субстанция вакцины «Вианвак» произвольно выбранной серии. Для каждого образца использовали 4 концентрации 5,10,15 и 20 мкг/мл. Эксперимент повторяли 4 раза, меняя серию произвольной субстанции. В одном эксперименте, вместо производственной субстанции использовали вакцину «Тифим Ви», произ­ водство «Авентис Пастер» (Франция). С помощью программы Excel для каждого образца строили график зависимости «Концентрация Ви-антигена - высота «раке­ ты» и находили уравнение линейной регрессии. Для оценки значимости различий линий регрессии применяли регрессионный анализ, заключающийся в сравнении ко­ эффициентов наклона Ъ, коэффициентов сдвига а, сравнения двух линий в целом по F-критерию .

Результаты регрессионного анализа позволили сделать вывод о статистиче­ ской незначимости различий линий регрессии зависимости «Концентрация Виантигена - высота «ракеты» для субстанций, расположенных на одной электрофореграмме... .

Однофакторный дисперсионный анализ также свидетельствовал об отсутст­ вии статистически значимых различий между значениями содержания Ви-антигена в вакцине «Вианвак» серия 181, вычисленными по калибровочным графикам на ос­ нове разных субстанций. Отсутствие статистически значимых различий позволяет сделать вывод о возможности использования для аттестации ОСО содержания Виантигена любой субстанции, соответствующей требованиям НД, в том числе и суб­ станции, из которой приготовлен СО .

Вычисляли аттестованное значение как среднее арифметическое средних арифметических по выборкам и доверительный интервал для среднего арифметиче­ ского .

Содержание Ви-антигена составило 42,1+ 2,2 мкг/мл, в следующей серии ОСО содержания Ви-антигена аттестованное значение составило 44,7+ 2,4 мкг/мл (ОСО 42-28-383-2005). ' ', • Таким образом, для аттестации ОСО содержания Ви-антигена в ГИСК разра­ ботана схема, предусматривающая оценку значимости различий линий регрессий для субстанции кандидата ОСО, кандидата в ОСО и действующего ОСО; для повы­ шения достоверности предусмотрено участие в аттестации двух лабораторий .

1.2.2.Валидация методики ракетного иммуноэлектрофореза, применяемо­ го для определения содержания Ви-антигена в брюшнотифозной вакцине «Ви­ анвак» .

С целью установления линейности, предела обнаружения и предела количе­ ственного определения на 1 стекле располагали ОСО содержания Ви-антигена (се­ рия 200) в 4-х разведениях, по 3 повтора на каждое разведение (всего 12 образцов) (рисунок 6). Для определения показателей точности метода (правильности и пре­ цизионности) проводили эксперимент в двух лабораториях, повторяя процедуру не менее 3-х раз в каждой лаборатории, на одном и том же материале, получая тем са­ мым возможность оценки воспроизводимости метода .

Строили график зависимости высоты пика («ракеты») от содержания Виантигена, для оценки линейности использовали регрессионный анализ. Коэффициент корреляции составил 0,997, что свидетельствует о сильной прямой зависимости переменных .

,, ™_,__ ___.. рисунок 6. Типичная электрофореграмма при оценке линейности метода РИЭФ і, ; -І ! \ ; для определения содержания Ви-антигена 1 ** І I і | ц і% \\ і! | і \\ с использованием вакцины «Вианвак»

||| '1 ;1 И ' серия 200 (ОСО содержания Ви-антигена) .

:

'" " : • • • • •. 1-3 -концентрация Ви-антигена 5 мкг/мл;

4-6 - концентрация Ви-антигена 10 мкг/мл;

123 4 5 6 78 9 10 11 12 7-9-концентрация Ви-антигена 15 мкг/мл;

10-12-концентрация Ви-антигена 20 кг/мл В соответствии с документами International Conference on Harmonization (ICH) of Technical Requirements for the Registration of Pharmaceuticals for Human Use, Validation of analytical procedures: Methodology (ICH-Q2B), 1996, предел обнаруже­ ния (ПО) и предел количественного определения (ПКО) впервые в практике контро­ ля МИБП вычисляли по стандартному отклонению (Sx) для точки Х=0: ПО= Sx x 3,3;

ПКО = S х 10, получили следующие величины: Sx= 0,32 мкг/мл, ПО = 1,1 мкг/мл, ПКО= 3,2 мкг/мл .

Используя ОСО содержания Ви-антигена, оценили воспроизводимость мето­ да - стандартное отклонение воспроизводимости SR и предел воспроизводимости R в соответствии со схемой, разработанной для методики определения белкового азота .

Стандартное отклонение воспроизводимости изменялось от 1,8 до 7,6 мкг/мл в зависимости от разведения ОСО, наименьший разброс значений выявлен при раз­ ведении в 3,3 раза: SR = 1,8 мкг/мл. В связи с этим, данное разведение было выбрано для оценки содержания Ви-антигена при проведении анализа в дальнейшем. Предел воспроизводимости R для разведения в 3,3 раза составил 5,98 мкг/мл. Это означа­ ет, для того, чтобы быть уверенным, что содержание Ви-антигена в исследуемом образце соответствует требованиям нормативной документации (50+ 15 мкг/мл или 35 - 65 мкг/мл), полученные результаты должны находиться в пределах 35+6 X 65-6. т.е. 4 1 - 5 9 мкг/мл .

Таким образом, проведена аттестация ОСО содержания Ви-антигена на осно­ ве опенки зависимости высоты ракет от концентрации Ви-антигена для различных серий очищенного полисахарида и вакцин, а также с участием двух исполнителей. С помощью регрессионного и дисперсионного анализов бьіло показано, что получен­ ные результаты могут рассматриваться как выборка из одной совокупности, что по­ зволило рассчитать аттестованную характеристику новой серии ОСО. С помощыо разработанного ОСО установили валпдациоппые характеристики метода РИЭФ для определения Ви-аптигсна, которые подтвердили возможность использования данно­ го метода для количественного определения Ви-аптигена. Установленный предел воспроизводимости является научно-обоснованной величиной для сравнения ре­ зультатов контроля в ГИСК и на предприятии по производству препарата .

2.МЕТОДОЛОГИЯ РАЗРАБОТКИ НОВЫХ ХИМИЧЕСКИХ И

ИММУНОХИМИЧЕСКИХ МЕТОДОВ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА МИБП И

ОЦЕНКИ ИХ ВАЛИДАЦИОННЫХ ХАРАКТЕРИСТИК .

2.1. Определение гетерологичных примесей в МИБП .

Культуральные вирусные вакцины могут содержать остаточные количества белков сыворотки крупного рогатого скота (СКРС), прежде всего БСА, обладающих аллергезирующими свойствами, в связи с чем их количество должно контролиро­ ваться. Для этих целей использовался метод двойной радиальной иммунодиффузии в агаре (ДРИД), чувствительность которого не высока - 10 мкг/мл БСА. Для опре­ деления содержания гетерологичных белков можно использовать более чувстви­ тельные иммунохимические методы: РИЭФ и одиночную радиальную иммунодиффузию (ОРИД). Эти методы сопоставимы по аналитической чувствительности, од­ нако по времени анализа и простоте выполнения РИЭФ обладает преимуществами, поэтому для дальнейшей работы был выбран данный метод .

2.1.1. Модификация и вялидация метода РИЭФ для определения БСА в культу ральных вирусных вакцинах .

Определение содержания различных антигенов с помощью РИЭФ широко ис­ пользуется в аналитической практике [Гааль Э., 1982, Остерман Л.А., 1983]. Для оп­ ределения БСА за основу была взята методика, используемая в ИПВЭ для определе­ ния альбумина человека в вирусных вакцинах в пределах 30 - 100 мкг/мл. В качест­ ве антигена на основании изучения свойств БСА различных производителей исполь­ зовали БСА для вирусологических исследований производства БелНИИЭМ с содер­ жанием БСА более 97 %. Кроличью сыворотку против БСА с титром не менее 1:500 получали по ФС 42-3874-99 .

Были оптимизированы условия анализа и установлены валидационные характеристики методики: линейность в диапазоне 0,5 - 5,0 мкг/мл, ПО и ПКО со­ ставили соответственно 0,25 мкг/мл и 0,5 мкг/мл БСА, коэффициент вариации при оценке внутрилабораторной воспроизводимости не превысил 20 %. С помощью ме­ тода добавок показано отсутствие влияния аминопептида, гидролизина, среды 199, желатина, а также других компонентов вакцины на выявление БСА .

Валидационные характеристики методики РИЭФ позволяют проводить кон­ троль инактивированньгх вирусных вакцин, содержание БСА в которых не должно превышать 0,5 мкг/мл. Отработанные условия РИЭФ позволили составить НД на ме­ тодику, включить ее в состав МУК 4.1/4.2.588-96, ФС 42-3874-99 и использовать при контроле культуральных вирусных вакцин: коревой, паротитной, герпетической, антирабической, клещевого энцефалита, гепатита А .

При внедрении методики было показано, что в препаратах коревой и паро­ титной вакцин (50 серий), контролирующихся на производстве в тесте анафилаксии, БСА методом РИЭФ не выявлялся. БСА также не выявлялся в очищенных концентрированных вакцинах клещевого энцефалита и антирабической вакцине производ­ ства ИПВЭ (40 серий). В антирабической вакцине, выпускаемой Уфимским ИВС (сейчас филиал ФГУП «НПО «Микроген»), в настоящее время благодаря улучше­ нию технологии производства БСА также не выявляется (20 серий) .

2.1.2. Разработка стандартного образца для определения содержания БСА методом РИЭФ .

При использовании разработанной нами методики РИЭФ содержание БСА в препарате оценивают по калибровочному графику, в качестве стандартного образца для которого применяют растворы БСА с концентрацией 0,5, 1,0, 1,5 и2,0мкг/мл .

Учитывая, что определение БСА проводится на пределе чувствительности метода, особое значение приобретает приготовление стандартных растворов для калибро­ вочного графика. В связи с этим совместно с БелНИИЭМ провели исследования, ко­ торые показали, что применение в качестве наполнителя пептона в концентрации 1обеспечивает стабильность в течение 5 лет лиофилизированного препарата с содержанием БСА 1-10 мкг в ампуле (розлив по 1 мл) .

Разработали также жидкую форму ОСО содержания белка, содержащую 1 мг/мл белка с использованием в качестве растворителя солевого раствора (0,15 % хлорида калия, 0,01 % щдрокарбоната натрия, рН 6,8) .

2. 1 3. Модификация и валидация методики РИЭФ с применением сыворотки против белков сыворотки рогатого скота (СРС) .

В связи с отсутствием отечественной коммерческой сыворотки против БСА изучили возможность использования сыворотки преципитирующей белки СКРС и СРС для судебно-медицинских целей (ЛенИВС). Исследования показали, что для выявления сывороточных белков в вирусных вакцинах целесообразно использовать сыворотку против СРС как более чувствительную .

Применение сыворотки против СРС позволяет выявлять помимо БСА другие белки сыворотки крупного рогатого скота, что является преимуществом по сравне­ нию с сывороткой против БСА, так как позволяет вести более информативный кон­ троль очистки культуральных вирусных вакцин .

Для определения содержания БСА использовали следующий прием: добавля­ ли в исследуемый образец БСА до конечной концентрации 2 мкг/мл, по увеличению высоты ракеты в образце с добавкой по сравнению с образцом без добавки иденти­ фицировали преципитат, соответствующий БСА. Типичные электрофореграммы представлены на рисунке 7, результаты определения — в таблице 3 .

Как видно из рисунка 7 и таблицы 3 анализируемые вакцины содержат белки СКРС, однако в вакцинах отсутствует БСА, так как отсутствует увеличение его кон­ центрации в пробе с добавкой БСА (лунки 6,8) .

–  –  –

В связи с заменой сыворотки против БСА на сыворотку против СРС изучили специфичность, линейность, пределы определения, прецизионность и правильность определения БСА методом РИЭФ при использовании указанной сыворотки .

Кроме того, в связи С прекращением работы предприятия БслНИИЭМ и вы­ пуска лиофилизированного ОСО содержания БСА, изучили возможность использо­ вания в качестве калибранта для построения калибровочного графика ОСО содер­ жания белка, представляющий собой раствор БСА. Для этого на одном стекле в верхнем и нижнем рядах лунок располагали ОСО и раствор БСА, приготовленный по точной навеске. Каждый из указанных препаратов ставили в 5-ти разведениях, измеряли высоту «ракет», строили график и находили уравнение линейной регрес­ сии .

Регрессионный анализ обеих линий зависимости «концентрация БСА - высо­ та «ракеты» показал отсутствие статистически значимых различий коэффициентов наклона (Ь) и сдвига (а) линий регрессии, а также отсутствие различий в случае использования в качестве калибровочного графика какой-либо линии регрессии в от­ дельности или объединенной линии регрессии .

Для оценки линейности использовали разные серии сыворотки преципитирующей белки СРС. Коэффициент корреляции, который в среднем составил 0,996, и коэффициент детерминации, равный в среднем 0,991, свидетельствуют о сильной прямой зависимости концентрация БСА - высота «ракеты» для ОСО БСА в случае применения сыворотки против белков СРС .

Вычисленные предел обнаружения и предел количественного определения составили: ПО = 0,15 мкг/мл, ПКО = 0,5 мкг/мл БСА .

Оценку правильности провели по МИ 2336-2002 «Показатели точности, пра­ вильности, прецизионности методик количественного химического анализа. Методы оценки»: критерий Стьюдента, рассчитанный для разности между средним значе­ нием результатов анализа -1,88 мкг/мл, и номинальным значением стандартного об­ разца - 2 мкг/мл, был ниже табличного, что свидетельствовало о незначимости сис­ тематической ошибки на фоне случайного разброса .

Промежуточную прецизионность оценивали с применением различных серий сыворотки против СРС и раствора БСА с концентрацией 2,0 мкг/мл. Коэффициент вариации составил 15 %, предел промежуточной прецизионности R„p составил 0,23 мкг/мл. С учетом прецизионности методики гарантировать, что содержание БСА в исследуемом образце меньше 0,5 мкг/мл (требование НД) можно при усло­ вии, что при единичном определении содержание БСА менее 0,27 мкг/мл. Примене­ ние сыворотки против белков СРС введено в проект методики для включения в ГФ XII .

Таким образом, нами модифицирован метод РИЭФ для определения БСА в вирусных вакцинах и при разработке методики установлены ее валидационные характеристики - специфичность, линейный диапазон, предел количественного оп­ ределения и предел обнаружения, правильность и прецизионность. Прецизионность методики устанавливали в условиях получения независимых результатов. Благодаря внедрению метода РИЭФ повысилось качество отечественных вирусных вакцин (герпетической, против клещевого энцефалита, гепатита А, антирабической): в 95 % серий, откоптролиропапных в ГИСК, белки СКРС не выявляются, БСА отсутствует или его содержание ниже предела обнаружения методики .

2.1.4. Валндацня ИФА тест-системі,і для определения БСА «Inimunocnzynictric Assay for the Measurement of BSA» («Cygnus Technologies, Inc.», США) .

В вакцинах коревой, краспушной и паротитпоіі, в соответствии с рекоменда­ циями ВОЗ, содержание БСА не должно превышать 50 иг (или 0,05 мкг ) в приви­ вочной дозе .

Для определения содержания БСА в таких количествах может быть использо­ ван иммуноферментный анализ, который обладает более высокой чувствительно­ стью по сравнению с РИЭФ - до нескольких нанограмм .

В настоящее время могут использоваться различные коммерческие тестсистемы для определения БСА. Применяя тест-систему, необходимо быть уверен­ ным в том, что ее характеристики и показатели точности позволяют использовать данную тест-систему для решения конкретных задач, т.е. провести ее валидацию .

Выбор критериев оценки пригодности тест-системы зависит от области ее применения и может охватывать более широкий спектр показателей, чем те, что ука­ заны производителем .

На Московском предприятии по производству бактерийных препаратов (фи­ лиал ФГУП «НПО «Микроген») для выявления содержания остаточного количества бычьего сывороточного альбумина в препаратах вирусных сборов и вакцин коревой, паротитной и паротитно-коревой культуральных живых сухих используют метод иммуноферментного анализа с применением тест-системы «Immunoenzimetric Assay for the Measurement of BSA» («Cygnus Technologies, Inc.», CatJ F030, США). Для подтверждения пригодности данной тест-системы для решения поставленной задачи совместно с производством была проведена ее валидация, в процессе которой оце­ нили характеристики тест-системы: специфичность, линейность, предел обнаруже­ ния, предел количественного определения, диапазон определяемых величин, пра­ вильность и прецизионность. Для оценки характеристик использовали схему, разра­ ботанную на модели методики определения белкового азота: пятикратное повторе­ ние блока анализов, блок состоит из анализа 9 образцов в рабочем диапазоне - по три образца в нижней, средней и верхней части диапазона .

Анализ проводили в соответствии с инструкцией по применению тестсистемы, используя 6 различных серий тест-системы в разные дни, разными опера­ торами. Всего было проведено 5 определений с паротитной вакциной и 3 определе­ ния с коревой и паротитно-коревой вакцинами. Последние 3 определения проводили через 1 год как ревалидацию тест-системы для подтверждения ее характеристик при анализе коревой и паротитно-коревой вакцин .

Для оценки специфичности и правильности использовали метод добавок .

Выявление в среднем составило для готовых серий вакцин 94 - 99,6%, а для полу­ фабрикатов вакцин - 86,5 - 97%, таким образом, специфичность и правильность тест-системы удовлетворительны .

Для оценки линейности с помощью программы Excel строили график зави­ симости «Концентрация БСА - оптическая плотность при 450 нм» с использовани­ ем стандартных образцов тест-системы (0,5-32 нг/мл), а также ОСО БСА (5-50нг/мл) и проводили регрессионный анализ .

Полученные значения коэффициентов корреляции (0,997) и детерминации (0,994) свидетельствуют о линейной зависимости оптической плотности от кон­ центрации БСА при использовании изучаемой тест-системы .

Изучение зависимости «концентрация БСА - оптическая плотность при 450 нм», полученных с применением калибрантов тест-системы и ОСО БСА с од­ ной стороны и калибрантов тест-системы и исследуемого препарата с другой пока­ зало параллелизм графиков. В качестве исследуемого препарата использовали паротитную вакцину с добавками БСА 5,10 и 20 нг и полуфабрикат паротитной вакцины с добавкой 32 нг. Аналогичные результаты получены при исследовании коревой вакцины .

Предел обнаружения и предел количественного определения, вычисленные на основании стандартного отклонения для нулевой концентрации, находились в пре­ делах 0,24-1,83 нг/мл для ПО и 0,72-5,55 нг/мл для ГОСО .

Полученные результаты несколько отличаются от данных производителя тест-системы, предполагающего использование для количественного определения БСА калибровочного графика с нижней концентрацией 0,5 нг/мл. Однако, примене­ нию данной тест-системы для выявления содержания остаточного количества БСА в паротитной, коревой и паротитно-коревой вакцинах и их вирусных сборах это не препятствует, поскольку предельное допустимое содержание БСА в готовом препа­ рате - 50 нг/доза - существенно выше установленных пределов .

Прецизионность тест-системы в инструкции по применению не была указана .

Мы установили данную характеристику по той же схеме, которую использовали для методик определения белкового азота и Ви-антигена. Предел промежуточной преци­ зионности для верхнего диапазона составил 15,3 нг/мл, т.е. гарантировать соответ­ ствие требованиям ( 50 нг/мл) при единичном определении можно при получении результата меньше разности (50 - 15,3) нг/мл = 35 нг/мл. Максимальный коэффици­ ент вариации для одной плашки составил 13%, что несколько превышает величину, указанную для тест-системы -10% .

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют об удовлетвори­ тельной правильности и прецизионности тест-системы и позволяют использовать ее для контроля коревой, паротитной и краснушной вакцин, содержание БСА в них не превышает 50 нг/доза .

Применение валидированной тест-системы для определения БСА в других культуральных вирусных вакцинах (герпетической, антирабической, против клеще­ вого энцефалита и др) показало, что содержание БСА в отечественных препаратах не превышает 50 нг/доза. Это дает основание ставить вопрос об изменении требова­ ний к содержанию БСА в отечественных культуральных вирусных вакцинах до 50 нг/доза и внедрению метода ИФА для его контроля .

2.2. Определение консервантов в МИБП .

Мертиолят применяют в качестве консерванта в сорбированных препаратах, а также в гриппозных вакцинах и бактериальных препаратах на основе лизатов услов­ но-патогенных бактерий. Его содержание в вакцинах регламентируется в пределах 35-65 и 80-120 мкг/мл. В настоящее время появились вакцины без консерванта, в ко­ торых остаточное количество мертиолята не превышает 2 мкг/мл .

Препараты антитоксических сывороток (противодифтерийная, противостолб­ нячная, противогангренозная, противобутулиническая, противозмеиные) содержат в качестве консерванта хлороформ, который относится к умеренно токсической груп­ пе препаратов (группа «Б»). Содержание его в препаратах не должно превышать 0,5%, однако данная величина была расчетной и определение его не проводилось .

Фенол применяют в качестве консерванта для ряда медицинских биологиче­ ских препаратов (неинфекционные аллергены, туберкулин, ряд вакцин). Фенол и его производные относятся к классу умеренно токсических веществ. Содержание его в различных препаратах находится в пределах 0,15 - 0,5 % и определяется спектрофотометрическим методом по ФС 42-3874-99 .

В мировой практике для анализа содержания фенола широко применяется ме­ тод ГЖХ. Метод является весьма чувствительным и очень быстрым в исполнении, что особенно ценно при анализе большого числа образцов, в связи с чем целесооб­ разно изучение возможности его применения для контроля МИБП .

С целью совершенствования методов контроля консервантов была поставлена задача с учетом современных требований к установлению валидационных характеристик разработать методики определения мертиолята в МИБП с использо­ ванием отечественного атомно-абсорбционного прибора KBAHT-Z.3TA, количест­ венного определения хлороформа в антитоксических сывороточных препаратах, оп­ ределения фенола с использованием метода ГЖХ .

2.2.1. Разработка и валидация методики определения содержания мер­ тиолята в анатоксинах, вирусных и бактерийных вакцинах с помощью атомноабсорбционного спектрометра KBAHT-Z.3TA .

В настоящее время в РФ определение мертиолята в вакцинах проводят трудо­ емким колориметрическим методом по ФС 42-3874-99. Для оценки правильности проведения анализа в двух диапазонах концентрации мертиолята нами были разра­ ботаны ОСО содержания мертиолята, результаты аттестации которых представлены в табл. 4 .

Таблица 4 .

Результаты аттестации ОСО содержания мертиолята в сорбированных МИБП колориметрическим методом по ФС 42-3874-99 .

ОСО 4 2 - 4 2 - 2 8 - 3 3 4 - 0 6 П ОСО 4 2 - 4 2 - 2 8 - 3 3 4 а - 0 6 Аттестованная характеристика - Аттестованная характеристика от 67,91 до 108,65 мкг/мл (п=18) от 42,84 до 56,48 мкг/мл (п=15) Среднее арифметическое - 88,28 мкг/мл Среднее арифметическое - 49,66 мкг/мл Стандартное отклонение - 9,7 мкг/мл Стандартное отклонение - 3,2 мкг/мл Коэффициент вариации - 11,0% Коэффициент вариации - 6,4 % Стандартная ошибка средиего-4,87мкг/мл Стандартная ошибка среднего - 1,8мкг/мл Доверительный интервал - 20,37 мкг/мл Доверительный интервал - 6,82 мкг/мл Согласно Европейской и Американской Фармакопеи, анализ мертиолята про­ водят в основном атомно-абсорбішоипой спектрометрией, который значительно со­ кращает время проведения анализа .

В России разработан метод атомно-абсорбшюппой спектрометрии с электро­ термической атомизацией на приборе KBA1IT-Z.3TA. Выла поставлена задача раз­ работать методику определения мертиолята в вирусных, бактерийных вакцинах и анатоксинах атомно-абсорбционным методом с использованием отечественного оборудования .

Разработка методики помимо отработки оптимальных условий пробоподготовки и анализа включала оценку валидационных характеристик методики .

Градуировку прибора провели совместно с разработчиками прибора, исполь­ зуя мертиолят фирмы «Serva», США .

Для оценки градуировки прибора анализировали в трех повторностях раство­ ры с концентрацией мертиолята 0,025, 0,25, 0,50, 0,75, 1,00, 1,25, 1,50 мкг/мл. От­ клонение полученной величины от номинальной для отдельных результатов достиг­ ло 10,6 %, для средних результатов отклонение не превысило 7,1 %. Предел количе­ ственного определения составил 0,005 мкг/мл .

На основании полученных результатов в методике предусмотрено использо­ вание трех повторностей, а также предусмотрена проверка градуировки прибора при каждом проведении анализа с помощью растворов мертиолята с концентрацией 0,5 — 1,25 мкг/мл, определяемое содержание мертиолята в этих растворах не должно от­ личаться от номинального более, чем на 8 % .

Для оценки правильности использовали сравнительное определение мертио­ лята в ОСО содержания мертиолята разработанной методикой и колориметрическим методом по ФС 42-3874-99, метод добавок, и определение мертиолята в ОСО и его разведениях .

При использовании метода добавок полученные результаты практически совпали с расчетными, различие не превысило 3,8 % .

Отклонение результатов от номинальной величины разведений ОСО не пре­ высило 8 %, принтом коэффициент наклона графика зависимости выявленной кон­ центрации от расчетной был близок к 1. Таким образом, правильность методики удовлетворительна .

Оценка повторяемости и промежуточной прецизионности (внутрилабораторной воспроизводимости) разработанной методики проведена с использованием ОСО содержания мертиолята и 3-х серий различных сорбированных препаратов. Все образцы анализировали в трех повторностях трижды в разные дни (для каждого об­ разца п=9). Колебания результата определения мертиолята в параллельных пробах при анализе сорбированных препаратов незначительно превышают колебания ре­ зультатов при анализе чистого раствора мертиолята. Таким образом, трехкратное определение мертиолята в каждом образце достаточно и для сорбированных препа­ ратов. Стандартное отклонение полученных результатов колебалось в пределах от 0,57 до 5,56 мкг/мл, коэффициент вариации не превышал 8,26 % .

В соответствии с отработанной методикой провели определение консерванта в 200 сериях сорбированных препаратов отечественного и зарубежного производст­ ва, а также остаточное количество мертиолята в 6 сериях вакцины гепатита В отече­ ственного и зарубежного производства. Полученные результаты совпадают с пас­ портными данными в пределах воспроизводимости методики .

Таким образом, нами разработана и валидирована методика определения мертиолята с использованием отечественного атомно-абсорбционного спектрометра KBAHT-Z.3TA, что сократило время анализа в 5 раз и позволило определять оста­ точные количества мертиолята. Валидационные характеристики методики (линей­ ность, правильность, прецизионность, предел количественного определения) позво­ ляют рекомендовать ее для количественного определения мертиолята в анатокси­ нах, сорбированных вакцинах и в бактерийных препаратах на основе лизатов услов­ но-патогенных культур, а также для определения остаточного количества мертиоля­ та в вакцинах без консерванта. Контроль более 200 серий сорбированных препара­ тов показал, что различие между результатами ГИСК и паспортными данными не превышает прецизионности методики .

На методику разработана типовая стандартная операционная процедура и проект общей фармакопейной статьи для ГФ XII .

2.2.2. Разработка и валидация методики количественного определе­ ния хлороформа в антитоксических сыворотках .

На основе способности хлороформа образовывать с резорцином в щелочной среде соединение хиноидной структуры, окрашенное в малиновый цвет - метода, принятого в судебной медицине для качественной реакции на хлороформ, отработа­ ли оптимальные условия для количественного определения хлороформа. Метод прост в исполнении и не требует дополнительного дорогостоящего оборудования .

Количественное определение хлороформа в антитоксических сыворотках проводили по стандартному раствору хлороформа, в качестве которого использова­ ли реактив фирмы «Сигма» (США). Показана линейность методики в диапазоне 0,1 предел количественного определения - 0,1 % .

Провели оценку правильности результатов количественного определения хлороформа с помощью метода добавок. Процент выявления хлороформа составил от 92 % до 100 % .

При оценке внутрисерийной сходимости метода (10 проб из одной ампулы препарата) коэффициент вариации составил 2,6 %. При оценке повторяемости (че­ тыре определения в день в течение восьми дней) коэффициент вариации для середи­ ны диапазона составил 4,8 %, для предела количественного определения не превы­ сил 12 % .

Результаты определение хлороформа в 60 сериях антитоксических сывороток показали, что содержание хлороформа находилось в пределах от 0,05 % до 0,3 % .

Поскольку использование хлороформа в качестве консерванта при низких концентрациях вызывает сомнение, ГИСК им.Л.А.Тарасевича рекомендовал пред­ приятиям, выпускающим антитоксические сыворотки, исключить использование хлороформа в качестве консерванта. Хлороформ используют для очистки препарата от липопротеидов, в связи с этим разработанный метод включен в Фармакопейные статьи на антитоксические сыворотки для определения остаточного содержания хлороформа, содержание которого не должно превышать 0,1 %. Метод используется при контроле 5 наименований антитоксических сывороток и внедрен на 3 производствах .

2.2.3. Изучение возможности применения методики определения фенола в МИБП с помощью газо/Кіідкостноп хроматографии В качестве внутреннего стандарта выбрали бензиловый спирт - соединение, наиболее близкое по структуре к анализируемому веществу .

Для совместной хроматографии фенола и бензилового спирта была использо­ вана капиллярная колонка с неполярным силиконовым каучуком в качестве непод­ вижной фазы. Подобранные параметры хроматографии обеспечили приемлемое вза­ имное деление компонентов смеси с одной стороны, и полное отделение от пика растворителя, с другой стороны .

Нами были установлены критерии пригодности хроматографической систе­ мы: время полного разделения пика внутреннего стандарта и пика фенола не должно превышать 10 минут; число теоретических тарелок/м (ступень разделения, на кото­ рой устанавливается сорбционное равновесие) должно быть не менее 700-900 .

Установленные валидационные характеристики методики: ПКО - 50 мкг/мл фенола; выявление от 98,7 % до 102,3 % добавленного фенола и сопоставимость с результатами определения фенола стандартизованным методом; коэффициент ва­ риации при оценке повторяемости не более 1,6 %, - свидетельствуют о возможности применения разработанных условий ГЖХ для определения фенола в аллергенах и вакцинах .

3. РАЗРАБОТКА СТАНДАРТНЫХ ОБРАЗЦОВ ДЛЯ ХИМИЧЕСКИХ II

ИММУНОХИМИЧЕСКИХ МЕТОДОВ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА МІІБП .

При контроле МИБП используется около 30 унифицированных химических, физико-химических и иммунохимических методик по ФС 42-3874-99. Метрологиче­ ское обеспечение методик требует создания стандартных образцов как меры сравне­ ния и для контроля правильности проведения анализов .

При производстве и контроле МИБП используются в качестве меры сравне­ ния различные биологические стандартные образцы. До середины 70-х годов про­ шлого века ОСО при выполнении химических анализов МИБП не применялись .

Основной вопрос при аттестации ОСО - это установление аттестованной ха­ рактеристики в отсутствии эталонных образцов. Единого алгоритма для этого нет, а подход ГОСТ 8.532 для МИБП не может использоваться из-за небольшого количе­ ства квалифицированных лабораторий. В связи с этим была поставлена задача раз­ работать ОСО как меры сравнения для методов определения белка с биуретовым ре­ активом, Ви-антигена и БСА методом РИЭФ, а также ОСО для внутрилабораторного контроля качества аналитической работы при определении белкового азота, мертиолята и ионов алюминия. Разработка ОСО для определения Ви-антигена, БСА, белко­ вого азота и мертиолята изложена в соответствующих разделах .

3.1.Разработка стандартного образца для определения содержания белка в препаратах иммуноглобулина .

Препараты иммуноглобулина в настоящее время выпускаются 7 предпри­ ятиями РФ и являются препаратами массового применения. Иммуноглобулины стандартизуются по содержанию белка, определяемому с биуретовым реактивом [Гавриленкова В.Ю. с соавт., 1971] .

С целью разработки стандартного образца содержания белка в препарате им­ муноглобулина нами проведено определение белка в кандидате в ОСО наиболее объективным методом - по белковому азоту с реактивом Несслера с последующим пересчетом на белок. В работе участвовало 4 оператора, каждый провел 10 опреде­ лений. На основе полученных результатов рассчитали аттестованную характеристи­ ку как среднее арифметическое и доверительный интервал. Аттестованная характе­ ристика составила (9,52+0,27) % белка при доверительной вероятности 0,95, стан­ дартная ошибка среднего составила 0,135 %. У четырех операторов Хер отличались менее, чем на 0,2 %, стандартное отклонение каждого оператора не превышало 0,2% .

Содержания белка в кандидате ОСО было подтверждено с биуретовым реак­ тивом. В ГИСК Хер составило 9,47 %, стандартное отклонение - 0,086 %, результа­ ты двух лабораторий ОКК предприятий, выпускающих препараты иммуноглобули­ нов, свидетельствовали об отсутствии статистически значимых различий с резуль­ татами ГИСК .

С разработанным ОСО проведена оценка воспроизводимости методики опре­ деления белка с биуретовым реактивом, изложенной в ФС 42-3874-99 - стандартное отклонение не превысило 0,085 %. Стандартное отклонение средних составило 0,13 %. Это означает, что при доверительной вероятности 0,95 возможные колебания средних результатов будут находиться в интервале до + 0,26 %. Предел воспроизво­ димости составил 0,36 % .

Анализ результатов контроля более 200 серий препаратов иммуноглобулина на содержание белка в ГИСК показал, что различие между результатами контроля в ГИСК и на производстве в 90 % серий не превышало 0,26 %. Таким образом, разра­ ботан порядок аттестации новых и последующих серий ОСО содержания белка в иммуноглобулинах с использованием межлабораторных испытаний. С помощью ОСО оценена воспроизводимость методики определения белка с биуретовым реак­ тивом, на основе которой проводится сравнительный анализ результатов в ГИСК и на производствах .

3.2. Разработка стандартного образца для калибрования хроматографической колонки при определении молекулярного состава иммуноглобулинов методом гель-фильтрации .

Препараты иммуноглобулинов (IgG) получают из донорской крови по методу Кона. Качество сырья, степень его очистки, возможные нарушения технологическо­ го процесса получения и хранения иммуноглобулина сказываются на его качестве. В результате могут наблюдаться процессы агрегации и фрагментации молекул иммуноглобулина G. Допустимое количество агрегатов и фрагментов ограничено в соот­ ветствии с требованиями на препарат и рекомендациями ВОЗ. Молекулярный состав иммуноглобулинов определяется методом гель-фильтрации по ФС 42-3874-99. При фракционировании препаратов иммуноглобулина может быть выявлено до 6 фрак­ ций (полимеры, димеры, мономеры, Fab и Fab2 фрагменты, низкомолекулярные пептиды). При определении молекулярных масс фракций иммуноглобулина для ка­ либровки колонки требуется 6-7 калибрантов .

Разработка ОСО иммуноглобулина для калибровки хроматографической ко­ лонки позволит заменить импортные белки-калибранты и сократить время проведе­ ния калибрования колонки .

В связи с этим была изучена возможность применения одной из серий препа­ рата иммуноглобулина в качестве стандартного образца для калибровки колонки .

Методом гель-фильтрации в образце выявлено 4 фракции. Изучение стабиль­ ности препарата показало постоянство его фракционного состава в течение 3 лет хранения. Несмотря на увеличение содержания Fab-фрагментов с 9,32 % до 16,17 %, что связано с деградацией молекул IgG под действием остаточного количе­ ства протеолитических ферментов, процесс фрагментации не изменил количество фракций иммуноглобулина. Было показано, что аттестуемой характеристикой для каждой фракции IgG может служить коэффициент распределения - Ка .

ОСО иммуноглобулина используется на предприятиях РФ, выпускающих препараты иммуноглобулинов, для калибрования хроматографической колонки при проведении контроля молекулярного состава препарата методом гель-фильтрации .

Его применение позволило помимо калибрования колонки оценивать пригодность хроматографической системы для контроля, тем самым способствовало повышению качества данного вида анализа на предприятиях и стандартности продукции .

В настоящее время для контроля молекулярного состава препаратов иммуног­ лобулинов широко используется метод высокоэффективной жидкостной хромато­ графии (ВЭЖХ), рекомендованный Европейской Фармакопеей. В связи с этим изу­ чили разработанный ОСО методом ВЭЖХ. Фракции характеризовали по времени удерживания на колонке. Были выявлены те же основные фракции, которые выяв­ лялись методом гель-фильтрации, а также три фракции низкомолекулярных фраг­ ментов, которые не разделялись методом гель-фильтрации. Таким образом, характе­ ристика ОСО может быть дополнена результатами ВЭЖХ и использоваться для оценки пригодности хроматографической ВЭЖХ системы по количеству выявляемых фракций .

3.3. Разработка стандартных образцов и прецизионность комплексонометрического метода определения ионов алюминия .

Комплексонометрический метод определения алюминия в сорбированных препаратах - анатоксинах, вакцине АКДС, клещевого энцефалита, гепатита В и ге­ патита А - был отработан в ГИСК и внедрен в практику контроля МИБП в соответ­ ствии с рекомендациями ВОЗ в начале 80-х годов прошлого века (МУ 1982 г.). В связи с тем, что определение ионов алюминия в сорбированных препаратах проводится после минерализации исходного образца, для оценки правильности проведе­ ния всего анализа был разработан стандартный образец на основе сорбированного столбнячного анатоксина, с помощью которого проведена оценка прецизионности комплексонометрического метода в межлабораторных испытаниях .

Межлабораторные испытания были проведены с участием 7 предприятий по производству МИБП, в каждом испытании участники проводили 10-кратное одно­ моментное определение ионов алюминия. Межлабораторные испытания показали, что коэффициент вариации результатов участников не превышал 9,9 % .

В связи с тем, что в вакцине гепатита В содержание ионов алюминия меньше, чем в анатоксинах, и находится в пределах 0,35 - 0,65 мг/мл, в 2006 г. разработали дополнительный ОСО с меньшим содержанием ионов алюминия. В настоящее время используются два стандартных образца содержания ионов алюминия, результаты аттестации которых представлены в таблице 5 .

Таблица 5 .

Результаты аттестации стандартных образцов с высоким и низким содержа­ нием ионов алюминия ОСО 4 2 - 4 2 - 2 8 - 3 3 3 - 0 6 П ОСО 4 2 - 4 2 - 2 8 - 3 3 3 а - 0 6 Аттестованная характеристика - Аттестованная характеристика от 0,67 до 0,87 мг/мл (п = 23) от 0,30 до 0,46 мг/мл (п = 28) Среднее арифметическое - 0, 77 мг/мл Среднее арифметическое - 0,38 мг/мл Стандартное отклонение - 0,05 мг/мл Стандартное отклонение - 0,04 мг/мл Коэффициент вариации - 6,49 % Коэффициент вариации -10,5 % Доверительный интервал - 0,10 мг/мл Доверительный интервал - 0,082 мг/мл Анализ результатов применения разработанных ОСО содержания алюминия на предприятиях по производству МИБП показывает, что при его использовании стандартное отклонение результатов не превышает установленного при аттестации ОСО. Однако, сравнение результатов определения ионов алюминия в ГИСК с дан­ ными паспорта за последние 3 года показывает, что, хотя препараты соответствуют требованиям НД, различие с паспортными данными не превышает двух стандартных отклонений (S) только при контроле вакцины гепатита В, при контроле анатоксинов различие превышает + 2 S в 20 % отконтролированных в ГИСК серий. В связи с этим требуется уточнение прецизионности комплексонометрического метода опре­ деления ионов алюминия, целесообразно проведение на регулярной основе межлабораторных испытаний для оценки воспроизводимости методики с одной стороны, с другой стороны возникшая ситуация свидетельствует о целесообразности возобновления регулярного инспектирования лабораторий ОКК сотрудниками ГИСК им.Л.А.Тарасевича МИБП для своевременного выяснения возможных источ­ ников расхождения результатов с целью недопущения выпуска некачественной про­ дукции .

4. ВАЛИДАЦИЯ ПЦР ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО

ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДНК ВИРУСА ГЕПАТИТА В .

4.1. Разработка стандартного образца содержания ДНК гена HBsAg вируса гепатита В .

В настоящее время в России разрабатывается большое количество тестсистем для диагностики инфекционных заболеваний на основе полимеразной цеп­ ной реакции (ПЦР), в том числе для выявления ДНК вируса гепатита В .

С целью создания системы контроля качества отечественных тест-систем на основе полимеразной цепной реакции была поставлена задача создания отраслевого стандартного образца содержания ДНК НВ. Поскольку все изучаемые тестсистемы для выявления ДНК НВ использовали праймеры к области гена HBsAg вируса гепатита В, стандартный образец разрабатывали на основе рекомбинантной плазмиды рВН320, несущей вставку участка ДНК генома вируса гепатита В, коди­ рующего области HBsAg и HBcAg вируса гепатита В. Проведенная нами оценка чистоты выделенной в препаративных количествах рекомбинантной плазмиды рВН320 и ее подлинности показала, что препарат соответствовал данным, получен­ ным авторами. Поскольку первоначально наборы реагентов для количественного определения ДНК были недоступны, для оценки числа копий ДНК рекомбинантной плазмиды рВН320 использовали двустадийную полимеразную цепную реакцию с двумя парами праймеров к области HBsAg HBV и метод лимитирующих разведений [Taswell С, 1981, Rodrigo A.G. et al. 1997]. По количеству положительных результа­ тов ПЦР из общего количеству исследованных ПЦР реакций программа QUALITY рассчитывает количество копий ДНК в исходном образце в объеме пробы (в данном случае - 10 мкл), а также %2 (критерий Пирсона), стандартную ошибку и вероятность появления данного значения %. Затем проводили пересчет количества ГЭ на 1 мл исследуемого образца. Концентрация ОСО составила 1,5 х10б + 0,4 ГЭ/мл или ко­ пий/мл .

Для подтверждения установленной концентрации провели одновременное определение наличия ДНК НВ в разведениях ОСО и первого Международного стандартного образца ДНК НВ, предварительно выровняв растворы по концентра­ ции. Для обоих образцов последнее разведение, в котором был получен положи­ тельный результат, было одинаковым .

Раствор ОСО ДНК стабилен в течение 8 лет хранения при температуре не выше минус 68 °С (срок наблюдения) .

4.2. Валндацпп тест-системы «АмплиСенс HBV Монитор FRT» (ФГУН ЦНІШЭ Роспотрсбпадзора) для количественного определения ДНК вируса гепатита В с гпбрндизацнонно-флуоресцентной детекцией результатов амплификации в режиме «реального времени» .

ПЦР тест-системы для выявления ДНК/РНК возбудителей инфекционных за­ болеваний представляют собой комплекты всех необходимых реагентов для опреде­ ления целевых ДНК или РНК. Тест-системы для выявления возбудителей инфекционных заболеваний (неколичественные), в том числе и на основе ПЦР, оце­ ниваются по специфичности, пределу обнаружения, диагностической эффективно­ сти, которая включает специфичность, чувствительность и воспроизводимость в испытаниях на клинических образцах. ПЦР тест-системы для количественного оп­ ределения ДНК/РНК возбудителей инфекционных заболеваний (в основном вирусных), как правило, применяются уже после выявления возбудителя, т.е. они предназначены не для диагностики, а прежде всего для оценки вирусной нагрузки. В связи с этим по нашему мнению к ним должны предъявляться требования, анало­ гичные требованиям к количественным аналитическим методикам. Это побудило нас применить разработанные нами методические основы валидации количествен­ ных аналитических методик к испытаниям количественных ПЦР тест-систем .

Данные тест-системы основаны на гибридизационно-флуоресцентной детек­ ции результатов амплификации в режиме «реального времени», содержание нуклеи­ новых кислот пропорционально показателю С,, характеризующего количество цик­ лов, необходимых для появления сигнала .

Работу провели на примере тест-системы для количественного определения ДНК вируса гепатита В «АмплиСенс НВ Монитор FRT» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора), которая состоит из двух комплектов реагентов: комплект для выделе­ ния ДНК из клинического материала и комплект для проведения ПЦР с одновре­ менной детекцией продуктов амплификации в режиме «реального времени» (FRT) .

Расчет количества копий ДНК в исследуемом образце проводится автоматически по калибраторам тест-системы, полученный результат пересчитывается относительно внутреннего контрольного образца, который добавляется во все образцы .

Специфичность тест-системы подтвердили на образцах плазмы крови доноров с отрицательными результатами ИФА на наличие HBsAg и отрицательными резуль­ татами ПЦР на наличие ДНК НВ. Исследовано 12 образцов плазмы донорской крови при помощи изучаемой тест-системы. Во всех 12 образцах получены отрица­ тельные результаты (Ct в исследуемых образцах не определяется) .

Для определения линейного диапазона использовали ОСО ДНК гена HBsAg, стандартный образец предприятия (СОПр) ДНК НВ на основе плазмы крови и клинический образец - плазма крови больного гепатитом В. Анализ стандартных образцов проводили с использованием исходной концентрации и разведений в со­ отношении 1:5; 1:25; 1:125; 1:625 и 1:3125, для клинического образца использовали десятикратные разведения. ОСО разводили ТЕ-буферным раствором, остальные об­ разцы - сывороткой крупного рогатого скота .

Графики зависимости концентрации ДНК НВ (lg копий/мл) от логарифма разведения и расчет уравнения линии регрессии представлены на рисунке 8 .

Коэффициент детерминации более 0,99 свидетельствует о линейности тестсистемы в диапазоне lg концентрации от 5х102 до 10 копий/мл ДНК вируса гепатита В. Однако, если рассчитать исходную концентрацию с учетом разведения, более, чем 25-кратное разведение, приводит к завышению результатов в 1,5 раза и более (таблицы б и 7, завышенные результаты выделены жирным шрифтом), что свидетельствует о непостоянстве коэффициента при разведении образцов. Это следует учитывать при проведении пробоподготовки, в случае необходимости целесообраз­ но использовать разведение не более, чем в 25 раз .

–  –  –

Рисунок 8. График зависимости концентрации ДНК НВ (lg копий/мл) от lg разведения при исследовании ОСО .

DHKHBsAg, СОПр ДНК НВ и клинического об­ разца. Уравнения линии регрессии: у0со = - 0,9887х + 6,8059 R2 = 0,9969 Усопр = - 0,7395х + 5,1845 R2 = 0,989 УКЛИНОБР- = -1,0037х + 8,7813 R2 = 0,9963 Изучение прецизионности проводили с СОПр ДНК НВ в исходной концен­ трации и его 5-кратных разведений, а также с использованием клинического образ­ ца и его десятикратных разведений. Все образцы были зашифрованы. Номера шиф­ ров не повторялись. Каждую концентрацию исследовали три оператора в двух по­ вторах в один день, в течение трех дней. Результаты статистической обработки представлены в таблицах 6 и 7 .

Как видно из таблиц 6 и 7, стандартное отклонение увеличивается с увеличени­ ем концентрации, коэффициент вариации не превышает 86 %, что является удовле­ творительным для данного вида анализа, по существу, заменяющего микробиологиче­ ские или вирусологические тесты. Однако это требует особой тщательности и внима­ ния при работе с образцами на пределе количественного определения .

Провели оценку воспроизводимости изучаемой тест-системы с помощью об­ разцов, содержащих ДНК НВ на пределе количественного определения, путем 8кратного исследования разными исполнителями ОСО ДНК НВ, разведенного до концентрации 5х102 копий/мл, а также исходного ОСО .

Стандартное отклонение (S) воспроизводимости изучаемой тест-системы для нижнего диапазона концентраций концентрации ДНК НВ (5x102 копий/мл) состави­ ло 6,9 хі О2 копий/мл, коэффициент вариации (С)-112%, для верхнего диапазона концентрации ДНК НВ (105 копий/мл) стандартное отклонение составило 4,96 х 104 копий/мл, С - 35 % .

–  –  –

Для оценка правильности провели сравнительное определение содержания ДНК НВ в клинических образцах исследуемой и референтной тест-системой «Cobas Amplicor HBV Monitor test», «Хоффманн Ла-Рош» (Швейцария), в которой используется гибридизация продуктов амплификации со специфическими олигонуклеотидными зондами и детекция полученного продукта с помощью ИФА .

Определение концентрации ДНК НВ проводили на образцах от пациентов с положительными результатами ИФА на наличие HBsAg и положительными резуль­ татами ПЦР на наличие ДНК НВ. Всего было изучено 10 образцов. В 6 из 10 изученных образцов концентрация ДНК НВ были выше верхнего предела опре­ деления тест-системы сравнения. В связи с тем, что тест-система сравнения имеет более узкий диапазон линейности (от 200 до 200000 копий/мл) определить коэффи­ циент корреляции не удалось, в остальных 4 образцах результаты различались не более, чем на 0,21 lg. С учетом авторских испытаний, различие результатов не пре­ вышало 0,3 lg, что свидетельствует об удовлетворительной правильности изучаемой тест-системы .

Установленные характеристики тест-системы: специфичность, линейность в диапазоне от 5x102 до 107 копий/мл, воспроизводимость + 0,3 lg и правильность в пределах 0,3 lg, позволяют использовать тест-систему для количественного опреде­ ления ДНК НВ .

Определение вирусной нагрузки в клинических образцах от 8 пациентов, до начала противовирусной терапии и через 4 недели после начала лечения, показало возможность оценки эффективности проводимой противовирусной терапии. У шес­ ти пациентов вирусная нагрузка снизилась на 2 lg и более, у одного - на 1,57 lg, у од­ ного пациента осталась без изменения - снижение на 0,17 lg .

Таким образом, на основе методологии валидации аналитических мето­ дов контроля МИБП с помощью разработанного ОСО содержания ДНК гена HBsAg вируса гепатита В проведена валидация количественной ПЦР тест-системы для вы­ явления вируса гепатита В. Линейность, диапазон определяемых величин, предел ко­ личественного определения, воспроизводимость и правильность тест-системы позво­ ляют использовать ее для количественного определения ДНК вируса гепатита В в плазме и сыворотке крови .

При разработке, производстве и контроле качества МИБП широко использу­ ются химические и иммунохимические методы (определение белка, консервантов, сорбента, гетерологичных примесей) .

Особенностью МИБП является вариабельность состава и отсутствие эталон­ ной базы. В связи с этим ответственность за создание и поддержание определенного уровня измерений ложится на разработчика методик». Наши исследования показы­ вают, что именно при разработке аналитической методики необходимо устанавли­ вать ее валидациопные характеристики, а также процедуру их подтверждения в дальнейшем .

Другой особенностью МИБП п отсутствие эталонной базы является то, что сама аналитическая методика становится основой для создания стандартных образ­ цов. Это обуславливает чрезвычайную важность подробного описания методики, условий ее проведения и объективного установления валидациопных характеристик .

Нами определен оптимальный комплекс факторов, лежащий в основе систе­ мы контроля МИБП химическими и иммунохимическими методами .

В результате проведенных исследований предложена методология оценки валидациопных характеристик аналитических методов. Установлена прецизион­ ность методик, включенных в нормативные документы па МИБП и вновь разработайных. Показана возможность использования методологаи оценки валидационных характеристик при изучении и стандартизации ПЦР тест-системы для количествен­ ного определения ДНК вируса гепатита В .

Для получения объективной информации о состоянии аналитической работы при контроле ряда основных химических показателей вакцин календаря прививок нами разработаны стандартные образцы содержания белкового азота, мертиолята, ионов алюминия. Использование данных образцов при организации межлабораторных испытаний может быть дополнением к системе контроля МИБП, которая предусматривает контроль на производстве и ГИСК им.Л.А.Тарасевича, а также альтернативой инспекционным проверкам аналитических лабораторий, регу­ лярное проведение которых в настоящее время не регламентировано .

Проведение контроля качества МИБП с использованием методик, разработан­ ных или охарактеризованных в соответствии с предложенной методологией валидации, будет способствовать получению объективных результатов и недопущению недоброкачественных препаратов в практику здравоохранения, что является основой политики в области контроля качества как производителей МИБП, так и ФГУН ГИСК им.Л.А.Тарасевича, курирующего данные препараты .

ВЫВОДЫ

1. Определен оптимальный комплекс факторов, являющихся основой сис­ темы контроля качества МИБП химическими, физико-химическими и иммунохимическими методами:

- стандартизированные методики контроля с установленными валидационными характеристиками;

- стандартные образцы для определения показателей качества и для внутрилабораторного контроля качества аналитической работы, аттестованные валидированными методами;

- составление методики в соответствии с требованиями к написанию стан­ дартной операционной процедуры, предусматривающее указание критериев пригод­ ности полученных результатов;

- критерии пригодности использующегося оборудования

- критерии достаточной квалификации персонала .

- соответствующие помещения, условия окружающей среды, реагентная база .

2. Установленные валидационные характеристики стандартизованных (определение белкового азота, Ви-антигена) и вновь разработанных (определение БСА, мертиолята, хлороформа, фенола) химических и иммунохимических методов анализа МИБП обеспечивают получение объективных результатов. Для стандартизованных методов устанавливают прецизионность и правильность; для вновь разрабатываемых методов устанавливают линейность, прецизионность, пра­ вильность, предел обнаружения, предел количественного определения в зависимо­ сти от назначения методики .

3. Впервые в отечественной практике контроля МИБП на модели методи­ ки определения белкового азота проведены испытания по оценке прецизионности на межлабораторном уровне. Испытания и анализ полученных результатов, проведен­ ные в соответствии с рекомендациями ГОСТ Р ИСО 5725 с привлечением специа­ листов в области математической статистики и метрологии, позволили идентифици­ ровать источники расхождения результатов участников .

4. Предложенный алгоритм оценки прецизионности: получение независимых результатов с использованием не менее 3 образцов в необходимом диапазоне концентрации и не менее, чем трехкратное повторение анализа (опти­ мально - пятикратное), - позволяет обеспечить объективную оценку показателя .

При проведении оценки целесообразно использование зашифрованных образцов .

5. Проведенная оценка прецизионности химических и иммунохимических методик контроля качества МИБП позволяет впервые в отечественной практике ис­ пользовать данную характеристику для научно-обоснованного сравнения результа­ тов контроля в ГИСК им.Л.А.Тарасевича с результатами предприятийизготовителей МИБП при определении Ви-антигена методом РИЭФ (С = 8 %), белкового азота с реактивом Несслера (С = 7 - 1 6 %), белка с биуретовым реакти­ вом (С = 1,4 %), БСА методами РИЭФ (С = 16 %) и ИФА (С = 8 %), мертиолята атомно-абсорбционным методом (С = 8-10 %), хлороформа колориметрическим методом (С = 12 %), ионов алюминия комплексонометрическим методом (С = 10,5%) .

6. Впервые в практике контроля МИБП разработанные ОСО содержания белкового азота, мертиолята и ионов алюминия, предназначенные для оценки пра­ вильности проведения соответствующих анализов, позволяют предприятиям по производству МИБП оценивать стабильность результатов определения белкового азота в полуфабрикатах анатоксинов, мертиолята и ионов алюминия в сорбированных препаратах .

7. Разработана и унифицирована методика определения БСА в культуральных вирусных вакцинах с использованием метода РИЭФ, которая позволила достоверно определять отсутствие не только БСА, но и других белков СКРС в культуральных вирусных вакцинах .

8. Разработанная чувствительная методика определения консерванта мертиолята в вакцинах, анатоксинах и лизатах бактериальных культур с помощью отечественного атомно-абсорбционного спектрометра KBAHT-Z.3TA позволяет оп­ ределять содержание мертиолята и его остаточные количества .

9. Разработка и внедрение методики количественного определения хлоро­ форма в антитоксических сыворотках позволили определять остаточное содержание хлороформа в антитоксических сыворотках, которое не должно превышать 0,1 % .

10. Разработанный отраслевой стандартный образец содержания ДНК гена HBsAg вируса гепатита В позволил провести валидацию и унифицировать методы контроля воспроизводимости и аналитической чувствительности количественной тест-системы для выявления ДНК НВ методом полимеразной цепной реакции .

Практические рекомендации

1. Разработанную методологию валидации аналитических методов целесообраз­ но использовать предприятиям по производству МИБП при валидации стандартизованных методов для оценки прецизионности и правильности, а также при установлении валидационных характеристик вновь разрабатываемых методов .

2. Рекомендуется с помощью разработанных стандартных образцов проведение внугрилабораторного контроля качества аналитической работы при определении основных химических показателей вакцин календаря прививок - белкового азота, мертиолята и ионов алюминия .

3. Рекомендуется на регулярной основе проводить межлабораторные испытания по основным видам анализа химических показателей (белковый азот, мертиолят, ио­ ны алюминия) с целью мониторинга воспроизводимости данных методов в ГИСК им.Л.А.Тарасевича и на предприятиях по производству МИБП .

Список опубликованных печатных работ по теме диссертации .

1. Волкова, Р.А. Применение метода ракетного иммуноэлектрофореза для анализа вирусных вакцин / Р.А.Волкова, Т.А. Седова // Сборник трудов ГИСК .

-Москва, 1989.-С. 116-122 .

2. Волкова, Р.А. Методы очистки и концентрирования инактивированных вирусных вакцин. Адьюванты. // В кн. Актуальные проблемы создания и примене­ ния иммунобиологических препаратов для диагностики и профилактики инфекционных болезней. - Пермь, 1993. - Т. 1. - С.79 - 93 .

3. Рунова, О.Б. Методы качественного и количественного определе­ ния фенола и его производных в биологических средах / О.Б. Рунова, Р.А. Вол­ кова // Клиническая лабораторная диагностика. -1996. - № 5. - С. 15-19 .

4. Волкова, Р.А. Разработка стандартных образцов для анализа химических и физических показателей качества МИБП / Р.А. Волкова, В.Г. Гаври­ ленкова, Т.М. Каргина // Материалы VII съезда Всероссийского научнопрактического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - М., 1997. - Т. 1.-С. 426-427 .

5. Волкова, Р.А. Совершенствование методов контроля химических пока­ зателей качества МИБП. Определение белка в сорбированных препаратах. Опреде­ ление протеолитической активности плазмина в иммуноглобулине до и после акти­ визации плазминогена / Р.А. Волкова, В.Г. Гавриленкова, Т.М. Каргина // Материа­ лы VII съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, мик­ робиологов и паразитологов. - М., 1997. - Т. 1. - С. 430 - 431 .

6. Каргина, Т.М. Препарат иммуноглобулина в качестве калибранта для метода гель-фильтрации / Т.М. Каргина, Р.А. Волкова, В.Ю. Гавриленкова // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2000. - № 1. - С. 84

-86 .

7. Рунова, О.Б. Количественное определение фенола в аллергенах и вакцинах методом газожидкостной хроматографии / О.Б. Рунова, Р.А. Волкова // Клиническая лабораторная диагностика. — 2000. - № 7. — С. 12 - 1 4 .

8. Волкова, Р.А. Молекулярно-генетическая диагностика гепатита В / Р.А .

Волкова, Е.В. Эльберт, Н.В. Шалунова, В.Г. Петухов, Асади Мобархан А.Х., СМ., Беглова В.В., Покровский Г.А., Шипулин, О.Ю., Шипулина, Г.О. Шайхаев, А.Б.Комаров, Г.В.Спирина, М.Ю.Кириллов// Генодиагностика в современной меди­ цине: сб. тезисов III Всероссийской науч. - практ. конф. - Москва, 2000. - С. 208Волкова, Р.А. Тест-системы для выявления ДНК вируса гепатита В ме­ тодом полимеразной цепной реакции / Р.А. Волкова, Е.В. Эльберт, Н.В. Шалунова // Биопрепараты. - 2001. - № 2. - С. 14 - 18 .

10. Волкова, Р.А. Стандартизация и сертификация ПЦР тест-систем / Р.А .

Волкова, Т.А. Бектимиров // Генодиагностика инфекционных заболеваний: сб. тези­ сов IV Всероссийской науч. - практ. конф. - Москва, 2002. - С.402-403 .

И. Гринэ, М.М. Сравнительный ретроспективный анализ алгоритмов обра­ ботки данных, полученных при аттестации отраслевого стандартного образца (ОСО) содержания белкового азота / М.М. Гринэ, Т.М. Конакова, Р.А. Волкова, Г.Е Фролова // Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диаг­ ностики и лечения актуальных инфекций: материалы I Всероссийской конф. по вакцинологии. - Москва, 2004.-С. 17 .

12. Устинникова, О.Б. Аттестация отраслевого стандартного образца со­ держания Ви-антигена в брюшнотифозной вакцине / О.Б. Устинникова, Р.А. Волко­ ва, Н.П. Ванеева // Медицинские иммунобиологические препараты для профилакти­ ки, диагностики и лечения актуальных инфекций: материалы I Всероссийской конф .

по вакцинологии. - Москва, 2004. - С. 72 - 73 .

13. Безруков, В.М. К оценке диагностической ценности ПЦР тестсистем по результатам Государственных испытаний / В.М. Безруков, Р.А. Вол­ кова, Е.В. Эльберт, Т.С. Шобухова // Журнал эпидемиологии, микробиологии и иммунологии. - 2005. - № 2. - С. 53 - 55 .

14. Устинникова, О.Б. К вопросу об аттестации отраслевого стандартного образца содержания Ви-антигена в брюшнотифозной вакцине / О.Б. Устинникова, Р.А. Волкова, Н.П. Ванеева // Биопрепараты - 2005. - № 1(17). - С. 24 - 26 .

15. Устинникова, О.Б. К вопросу о валидации ИФА-тест-системы / О.Б. Ус­ тинникова, Р.А. Волкова, А.Ю. Звонарев, М.Н. Кулякина // Молекулярная медицина и биобезопасность: сб. тезисов Второй конф. с междунар. участием. - Москва, 2005. - С. 271 .

16. Бектимиров, Т.А. Стандартизация ПЦР тест-систем / Т.А. Бектимиров, Р.А. Волкова // Биопрепараты. - 2005. - № 2 (18). - С.29-31 .

17. Медуницын, Н.В. О программе проведения государственных испытаний диагностических медицинских иммунобиологических препарпатов при регистрации в Российской Федерации / Н.В. Медуницын, В.М. Бондаренко, Р.А. Волкова, В.Г .

Жуховицкий, В.М. Безруков, А.В. Шобухов // Биопрепараты. - 2006. - № 1(25). С.23-26 .

18. Эльберт, Е.В. Разработка ОСО содержания ДНК вируса гепатита В на основе рекомбинантной плазмиды рВН320 / Е.В. Эльберт, Р.А. Волкова, Г.А. Шипулин, О.Ю. Шипулина // Медицинские иммунобиологические препараты для профи­ лактики, диагностики и лечения актуальных инфекций: сб. тезисов Всероссийской науч. - практ. конф. - Москва, 2006. - С. 112 .

19. Устинникова, О.Б. Применение ИФА тест-системы для определения БСА в препаратах вирусных сборов и вакцин коревой, паротитной и паротитнокоревой культуральных живых сухих / О.Б. Устинникова, Р.А. Волкова, А.Ю. Звона­ рев, М.Н. Кулякина // Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний: сб. материалов конф. - Нижний Новгород, 2006.-С. 134 .

20. Волкова, Р.А. Валидация метода ИФА с использованием тест-системы «Immunoenzymetric assay for the measurement of BSA" для определения БСА в препа­ ратах вирусных сборов и готовой продукции коревой, паротитной и паротитнокоревой вакцин / Р.А. Волкова, О.Б. Устинникова, А.Ю. Звонарев, М.Н. Кулякина // Вакцинология - 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профи­ лактики, диагностики и лечения инфекционных болезней: сб. тезисов Всероссийской науч. - практ. конф. - Москва, 2006. - С. 29 - 30 .

21. Устинникова, О.Б. Оценка характеристик метода определения содержа­ ния БСА в паротитной вакцине и вирусных сборах с помощью иммуноферментного анализа / О.Б. Устинникова, Р.А. Волкова, А.Ю. Звонарев, М.Н. Кулякина // Биопре­ параты. - 2006. - № 3 (23). - С. 24 - 27 .

22. Каргина, Т.М. Применение атомно-абсорбционного спектрометра с электротермическим атомизатором для анализа мертиолята в сорбированных вирус­ ных, бактерийных вакцинах и анатоксинах / Т.М. Каргина, Ю.М. Садагов, Л.Л. Ко­ роли, Р.А. Волкова // Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологиче­ ских средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней: сб. те­ зисов науч. - практ. конф.. - Москва, 2006. - С.47 .

23. Гринэ, М.М. Валидация количественных аналитических методик. Опыт применения концепции международного стандарта ИСО 4259 в исследовании мет­ рологических возможностей методики определения химических показателей имму­ нобиологических препаратов / М.М. Гринэ, Т.М. Конакова, Р.А. Волкова, Г.Е. Фро­ лова // Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств про­ филактики, диагностики и лечения инфекционных болезней: сб. тезисов науч. практ. конф. - Москва, 2006. - С.36-37 .

24. Волкова, Р.А. Опыт применения МУ 3.3.2.1886-04 / Р.А. Волкова, Т.А .

Бектимиров // Биопрепараты. - 2006. - № 4 (24). - С.25-26 .

25. Волкова, Р.А. Валидация метода ракетного нммуноэлектрофореза для определения БСА в вирусных вакцинах / Р.А. Волкова, О.Б. Устинникова // Клиническая лабораторная диагностика. -2007. - № 9. - С. 70 - 7 1 .

26. Волкова, Р.А. Современные препараты для выявления генетического материала возбудителей инфекционных заболеваний методом полимеразной цепной реакции / Р.А. Волкова, Е.В. Эльберт // Генодиагностика инфекционных болезней сб. науч. трудов VI Всероссийской науч. - практ. конф. - Москва, 2007. - Т. 1 .

- С. 11-12 .

27. Эльберт, Е.В. Результаты испытаний препарата «Амплисенс НВ Монитор-FRT» тест-системы для количественного определения ДНК вируса гепатита В методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» / Е.В. Эльберт, Р.А. Волкова, В.Г. Петухов, B.C. Зайцев, Г.А .

Михайловская, Е.В. Богословская, Г.А. Шипулин // Генодиагностика инфекционных болезней - 2007: сб. науч. трудов VI Всероссийской науч. - практ. конф. - Москва, 2007. - Т. 1.-С. 325-326 .

28. Волкова, Р.А. Валидация методов контроля микробиологических препаратов / Р.А. Волкова, ТА. Бектимиров // Фармация. — 2008. — №5. - С. 12 — 15 .

29. Пустошилова, Н.М. Проблемы определения белка в биопрепаратах / Н.М. Пустошилова, Л.В. Шуленина, О.Б. Рунова, Р.А. Волкова // Фармация. — 2008. - № 5. - С. 1 5 - 1 8 .

30. Волкова, РА. Определение показателей точности тест-системы для оценки паротитной и коревой вакцин / Р.А. Волкова, О.Б. Устинникова, А.Ю .

Звонарев, М.Н. Кулякина, В.М. Колышкин // Фармация. - 2008. - № 6. - С. 5 — 7 .

31. Творогова, М.Г. Результаты оценки качества выявления нуклеиновых кислот вирусов гепатита В и С методом ПЦР по данным ФСВОК в 2007-2008 годах / М.Г. Творогова, В.П. Чуланов,Р.А. Волкова, А.Б. Судариков, М.И. Михайлов, В.Н .

Малахов // Вирусные гепатиты в Российской Федерации. Справочник / Под. ред .

Г.Г. Онищенко, А.Б. Жебруна. - С - Пб., 2009. - С. 70-73 .

32. Волкова Р.А. К вопросу о валидации аналитических методов .

/Р.А.Волкова// Справочник заведующего КДЛ. - 2009. - № 4. - С. 44-49 .

33. Бектимиров, Т.А. Методы контроля медицинских биологических пре­ паратов, вводимых людям. / Т.А. Бектимиров, В.В. Блоха, Р.А. Волкова, В.Ю. Гав­ риленкова, Т.Е. Елизарова, Т.М. Каргина, Д.Т. Леви, Н.И. Лонская, Н.В. Медуницын, Л.В. Минакова, Н.А. Озерецковский, В.Г. Петухов, В.Ф. Рунова, Т.А. Седова, И.В .

Черняховская, Н.В. Шалунова, СМ. Штанчаева, Е.В. Эльберт // Методические ука­ зания. МУК 4.1/4.2.588-96. - Москва, 1996. - 98 с .

34. Волкова, Р.А. Физико-химические, химические, физические и иммунохимические методы контроля медицинских иммунобиологических препара­ тов / Р.А. Волкова, В.Ю. Гавриленкова, Т.М. Каргина, СМ. Штанчаева, Э.И. Конду, Е.В. Эльберт, В.Ф. Рунова, В.В. Блоха, И.В. Черняховская // Фармакопейная статья ФС 42-3874-99. - Москва, 1999. - 77 с .

35. Бектимиров, Т.А. Составление, рассмотрение, введение в действие стандартных операционных процедур / Т.А. Бектимиров, Р.А. Волкова, Д.Т. Леви, Н.В. Медуницын, А.А. Мовсесянц, В.Г. Петухов // Методические рекомендации №11-3/11-09.-Москва,2003.-19 с .

36. Бектимиров, Т.А. Валидация методов контроля химических и физикохимических показателей качества МИБП: организация, порядок проведения и пред­ ставления результатов / Т.А. Бектимиров, Р.А. Волкова, Н.В. Медуницын, А.А .

Мовсесянц, В.Г. Петухов, Т.М. Каргана, В.Ю. Гавриленкова, О.Б. Устинникова, В.И .

Малкова, Е.В. Эльберт // Методические указания 3.3.2.1886-04. - Москва, 2004. с .

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ

АС - Анатоксин столбнячный АД - Анатоксин дифтерийный АДС - Анатоксин дифтерийно-столбнячный АКДС - Вакцина коклюшная с дифтерийно-столбнячным анатоксином БСА - Бычий сывороточный альбумин ГЖХ - Газо-жидкостная хроматография ГИСК - ФГУН ГИСК им.Л. АТарасевича Роспотребнадзора ИФА - Иммуноферментный анализ МИБП - Медицинские иммунобиологические препараты МУ - Методические указания ОКК - Отдел контроля качества ОСО - Отраслевой стандартный образец ПКО -Предел количественного определения ПО - Предел обнаружения ПЦР - Полимеразная цепная реакция РИЭФ - Ракетный иммуноэлектрофорез СП - Санитарные правила СОП - Стандартная операционная процедура СОПр - Стандартный образец предприятия СРС - Сыворотка рогатого скота СКРС - Сыворотка крупного рогатого скота ТХУ - Трихлоруксусная кислота ФВК - Фосфорновольфрамовая кислота Подписано в печать 05.11.2009 .

Формат 60x84/32. Гарнитура «Тайме» .

Печать цифровая. Усл. печ. л 12 Тираж 100 экз. Заказ 165 .

Отпечатано в ООО «Реглет»

661-60-89; 790- 47-77 www.rcglct.ru






Похожие работы:

«ПАО МТС Тел. 8-800-250-0890 www.mts.ru Наш Smart 30 ГБ, 1500 минут и 1500 SMS для всей семьи Федеральный номер / Городской номер всего за 750 рублей в месяц Авансовый метод расчетов Тариф открыт для подключения с 03.04.2018 Тариф открыт для перехода с 03.04.2018 Пакеты минут и интернета действуют на территории всей Ро...»

«ПАРАЗИТОЛОГИЯ XII, 4, 1978 УДК 576.895.122 О ЦЕРКАРИИ DIPLOSTOMUM COMMUTATUM (DIESING, 1850) DUBOIS, 1937 (TREMATODA : DIPLOSTOMATIDAE) Г. И. Андреюк Сибирский научно-исследовательский и п...»

«Московский Государственный Университетим. М. В. Ломоносова5 Биологический факультет5 Отчет по циклу задач учебно-произвоственной практики: метод молекулярного моделирования5 Подготовил студент 5 кафедры биофизи...»

«gdz_po_algebre_yazyku_9_klass_makarychev_2016.zip Каковский решебник ощетинит ходоку притворно засинить решётку нате откалывая зазывный день за тормозами и ужель выпрыгивая стрессу. Необычно дерюж...»

«Тарасова Виктория Николаевна СТРУКТУРА И ДИНАМИКА ЭПИФИТНОГО МОХОВОЛИШАЙНИКОВОГО ПОКРОВА В СРЕДНЕТАЕЖНЫХ ЛЕСАХ СЕВЕРО-ЗАПАДА ЕВРОПЕЙСКОЙ ЧАСТИ РОССИИ 03.02.08 – "Экология (в биологии)" Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Санкт-Петербург Работа выполнена в Фед...»

«Daser Общая демонология. Содержание. Введение. Общая информация. Раздел первый. Энергетика демона. · Происхождение демонов. Краткий обзор классификации. Строение демона. Внешнее строение. Внутреннее строение демона. Строение ко...»

«Обзор СМИ 20.09.2018 – 27.09.2018 (органика) Оглавление Россия Приглашаем на панельную сессию "Россия на мировом рынке органической продукции" Национальный органический союз завершает прием заявок на BIOFACH2019.3 Дмитрий Патрушев: аграрии накормят россиян экологичными продуктами (...»

«ВАСИЛЬЕВА Ольга Юрьевна ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА, СТАНДАРТИЗАЦИЯ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА НОВОГО БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО ВЕЩЕСТВА ШУНЛИТ 14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия Автореферат ди...»

«Самоанализ Муниципального автономного дошкольного образовательного учреждения "Детский сад № 66 общеразвивающего вида" г. Сыктывкара за 2012-2013 учебный год Организационно-правовое обеспечение деятельности Муниципальное автономное дошкольно...»

«Биология 21. Deng S., Hiruki C. Amplification of 16S rRNA genes from culturable and nonculturable Mollicutes // J. Microbiol. Methods.1991. Vol . 14. P. 53–61.22. Lorenz K. H., Schneider B., Ahrens U., Seemuller E....»

«Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова Биологический факультет Кафедра микологии и альгологии Звенигородская биологическая станция им. С.Н. Скадовского Материалы VIII всероссийской микологической школы-конференции с международным участием "КОНЦЕПЦИИ ВИДА У ГРИБОВ: НОВЫЙ ВЗГЛЯД НА СТАРЫЕ ПРОБЛЕМЫ" Посвящается...»

«WWW. MEDLINE.RU ТОМ 18, КЛИНИЧЕСКАЯ ТОКСИКОЛОГИЯ, 26 СЕНТЯБРЯ 2017 РЕПРОДУКТИВНАЯ ТОКСИЧНОСТЬ МОРФИНА Белякова Н.А., 3Бонитенко Е.Ю., 1Носов А.В., 4Фахардо А.Ф., 2Котельникова И.Г....»




 
2019 www.mash.dobrota.biz - «Бесплатная электронная библиотека - онлайн публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.