WWW.MASH.DOBROTA.BIZ
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - онлайн публикации
 

«ТРОПОНИНОВЫЙ КОМПЛЕКС СЕРДЦА ЧЕЛОВЕКА. СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ И. А. КАТРУХА 8 2013 г. Кафедра биохимии биологического факультета Московского государственного университета ...»

Тропониновый комплекс сердцаУспехи биологической химии, т. 53, 2013, с. 149–194

человека. Структура и функции 149

ТРОПОНИНОВЫЙ КОМПЛЕКС СЕРДЦА

ЧЕЛОВЕКА. СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ

И. А. КАТРУХА

8 2013 г .

Кафедра биохимии биологического факультета

Московского государственного университета

им. М.В.Ломоносова, Москва

I. Введение. II. Особенности экспрессии белков, входящих в состав

тропонинового комплекса. III. Строение компонентов тропони­ нового комплекса сердца человека. IV. Роль тропонинового комп­ лекса в регуляции сердечного сокращения. V. Влияние посттрансля­ ционных модификаций компонентов тропонинового комплекса на регуляцию мышечного сокращения. VI. Тропониновый комплекс и заболевания сердца. VII. Заключение .

I. ВВЕДЕНИЕ Сокращение сердечной мускулатуры представляет собой сложный процесс, в котором стимуляция кардиомиоцита, происходящая при деполяризации мембраны клетки и последующем повышении внутри­ клеточной концентрации ионов кальция, сопряжена с развитием механического движения. Ключевую роль в регуляции сердечного сокращения играет один из компонентов тонкого актинового фила­ мента кардиомиоцита – тропониновый комплекс, состоящий из трех субъединиц: тропонина C (ТнС), способного связывать ионы Ca2+, тропонина Т (ТнТ), взаимодействующего с тропомиозином, и тропо­ нина I (ТнI), ингибирующего АТФазную активность актомиозино­ вого комплекса .



Сложные структурные изменения, происходящие Принятые сокращения: ИД – ингибиторный домен тропонина I; МД – мо­ бильный домен тропонина I; РД – регуляторный домен тропонина I; с/мсТнС – сердечная/медленная скелетная изоформа тропонина С человека; ТнI – тропонин I; ТнС – тропонин С; ТнТ – тропонин Т; чсТнI – сердечная изоформа тропонина I человека; чсТнТ – сердечная изоформа тропонина T человека; ЯМР – ядерно­ магнитный резонанс; cMyBP­C – сердечный связанный с миозином С­белок;

DCM – дилатационная кардиомиопатия; FRET – ферстеровский резонансный перенос энергии; HCM – гипертрофическая кардиомиопатия; PKA – протеин­ киназа А; PKC – протеинкиназа С; PP1, PP2 – протеинфосфатазы 1 и 2; RCM – рестриктивная кардиомиопатия; SDSL­EPR – сайт­направленная модификация ЭПР­метками (site­directed spin labeling EPR) .

Адрес для корреспонденции: katrukhai@gmail.com 150 И.А.Катруха в тропониновом комплексе при повышении внутриклеточной кон­ центрации ионов Ca2+, обеспечивают возможность АТФ­зависимого связывания миозина с актином и развитие мышечного сокращения .

Смена изоформ в процессе онтогенеза, альтернативный сплайсинг, а также особенности строения и различные посттрансляционные модификации белков, входящих в состав тропонинового комплекса, позволяют осуществлять тонкую регуляцию сокращения сердечной мускулатуры .

Тропониновый комплекс имеет важное медицинское значение .

Так, например, тропонин является мишенью для кардиотонических лекарственных средств, используемых при терапии сердечной недос­ таточности. Ряд мутаций в генах белков тропонинового комплекса приводит к развитию различных типов кардиомиопатий. Помимо этого, на протяжении последних 25 лет специфичные для сердечной ткани изоформы ТнI и ТнТ используются для диагностики патологий, связанных с некрозом кардиомиоцитов (инфаркт миокарда, травмати­ ческое повреждение миокарда и др.) .

Данный обзор обобщает существующую на сегодняшний день информацию о строении и свойствах компонентов тропонинового комплекса, и их роли в регуляции сократительной активности сердца .



II. ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ БЕЛКОВ,

ВХОДЯЩИХ В СОСТАВ ТРОПОНИНОВОГО КОМПЛЕКСА

ТРОПОНИН I

Тропонин I представлен в организме человека тремя изоформами:

быстрой и медленной скелетными изоформами, а также специфичной сердечной изоформой [1–3]. Гены всех трех изоформ ТнI располо­ жены в тандеме с генами ТнТ и являются паралогами, образованными путем трипликации локуса, содержащего родительскую пару генов ТнI/ТнТ [4, 5]. У человека в процессе эмбрионального развития быстрая и медленная скелетные изоформы ТнI экспрессируются во всех типах скелетной мускулатуры, однако во взрослом состоянии указанные изоформы представлены только, соответственно, в быст­ рых или медленных скелетных мышцах [6]. Медленная скелетная изоформа ТнI экспрессируется в сердечной мышце в процессе эмбрионального развития [7–9] и сменяется сердечной изоформой во взрослом состоянии. Сердечная изоформа ТнI экспрессируется исключительно в сердечной мускулатуре [10–12]. Ген сердечной изо­ формы ТнI (TNNI3) расположен в 19 хромосоме (19q13.4) и включает в себя восемь экзонов и семь интронов [3]. Экзон 3 отсутствует в генах Тропониновый комплекс сердца человека. Структура и функции 151 скелетных изоформ белка и кодирует основную часть уникальной N­концевой последовательности, характерной только для сердечной изоформы ТнI [3] .

Смена изоформ тропонина I в процессе онтогенеза В процессе онтогенеза в сердце многих животных и человека проис­ ходит смена изоформ ТнI [8, 13–16]. Во время эмбрионального разви­ тия в сердце преимущественно экспрессируется медленная скелет­ ная изоформа ТнI. В последние недели эмбрионального развития уровень экспрессии чсТнI усиливается [7, 9], и к девятому месяцу жизни в сердце человека происходит полная замена медленной скелетной на сердечную изоформу белка [9]. Механизм регуляция смены изоформ ТнI в процессе развития сердца не до конца изучен .

Ингибирование экспрессии медленной скелетной формы ТнI в кардиомиоцитах может проходить как на стадии транскрипции, так и на посттранскрипционном уровне. В экспериментах на миобластах мыши было показано, что в ингибировании активности промотера гена медленной скелетной изоформы ТнI может принимать участие транскрипционный фактор Yin Yang 1 [17]. В другой серии экспе­ риментов, выполненных на эмбриональном миокарде крыс, было обнаружено увеличенное количество антисмысловой РНК, препятст­ вующей трансляции сердечной изоформы ТнI, при этом количество указанной антисмысловой РНК уменьшалось по мере взросления организма [18] .

Эксперименты на миоцитах мышей [19, 20], крыс [21, 22] и крол­ иков [23, 24] показали, что медленная скелетная изоформа тропонина I, встроенная в состав тропонинового комплекса, обеспечивает более высокое сродство к ионам Ca2+ и меньшую чувствительность к ацидозу, чем аналогичная сердечная изоформа этого белка. Таким образом, экспрессия медленной скелетной изоформы ТнI в эмбриональных миоцитах делает сердечную мышцу более устойчивой к гипоксии и ацидозу, которые могут возникать в процессе эмбрионального разви­ тия и при родах .





ТРОПОНИН T

Тропонин Т представлен в организме человека также тремя генами, кодирующими соответственно быструю и медленную скелетную, а также сердечную изоформы белка. Ген сердечной изоформы ТнТ (TNNT2) расположен в хромосоме 1 (1q32.3) [25, 26], имеет длину 17 kb и состоит из 17 экзонов и 16 интронов [27]. Для различных животных и человека было показано, что помимо кардиомиоцитов 152 И.А.Катруха сердечная изоформа ТнТ в небольшом количестве экспрессируется в скелетных мышцах во время эмбрионального развития [28–31] .

Альтернативный сплайсинг и смена изоформ cТнТ в процессе онтогенеза В нескольких работах, посвященных исследованию экспрессии изо­ форм ТнТ в процессе эмбрионального развития сердечной мышцы мышей [32, 33] и крыс [34], наблюдалось кратковременное увеличе­ ние количества мРНК, кодирующей медленную скелетную изоформу белка. Повышенный уровень мРНК, кодирующей данную изоформу ТнТ, был отмечен в эмбриональной сердечной мышце здоровых людей, а также в сердцах больных с терминальной стадией сердечной недостаточности [34]. Впрочем, следует отметить, что в указанных работах не было приведено убедительных доказательств трансляции этой мРНК в сердечной мускулатуре. Отсутствие скелетных изоформ ТнТ в сердечной мышце на разных этапах ее развития установлено в целом ряде исследований [30, 35–37], и это позволяет утверждать, что в кардиомиоцитах экпрессируется исключительно сердечная изоформа ТнТ, кодируемая геном TNNT2 .

В сердечной мышце птиц [38] и млекопитающих [39–43] при­ сутствует несколько форм ТнТ, получаемых в результате альтерна­ тив ного сплайсинга. Продуктами гена TNNT2 человека также являются несколько изоформ белка, получаемые при альтернативном сплайсинге экзонов 4, 5 и 13 [25, 26, 30, 38, 42, 44, 45]. Показано, что у птиц и млекопитающих аминокислотная последовательность, кодируемая экзоном 5, представлена только в эмбриональной форме и отсутствует в структуре тропонина Т сердца взрослого организма [13, 30, 38, 43, 45]. Экзоны 4 и 13 могут подвергаться альтернатив­ ному сплайсингу независимо от стадии развития [28, 42, 45, 46]. У мышей и крыс эмбриональная сердечная изоформа ТнТ перестает экспрессироваться соответственно к 5 и 14 дню постнатального развития [28]. Время окончания экспрессии эмбриональной сердеч­ ной изоформы ТнТ человека точно не известно, но к девятому месяцу после рождения ТнТ представлен только в виде «взрослой»

сердечной изоформы, в которой последовательность, кодируемая 5 экзоном, отсутствует [26]. В сердце здорового человека тропонин Т преимущественно представлен в виде изоформы ТnТ3, содержащей 287 аминокислотных остатков (без учета первого остатка метионина, отщепляемого в процессе трансляции) и включающей в свой состав последовательности, кодируемые экзонами 4 и 13 [30, 46] .

Тропониновый комплекс сердца человека. Структура и функции 153 Участок аминокислотной последовательности, кодируемый экзо­ ном 5 (EEEDWREDED), несет большой отрицательный заряд. Таким образом, альтернативный сплайсинг, происходящий при взрослении организма, приводит к уменьшению длины белка и смене более кислой изоформы на менее кислую, что может влиять на функцио­ нальные свойства тропонина. Было показано, что экспрессия эмбрио­ нальной изоформы ТнТ усиливает максимальную силу сокращения миофибрилл и чувствительность миоцитов к ионам Ca2+ [47–49] .

Сплайсинг 4 экзона также может иметь функциональное значение .

Экспрессия белка, в котором отсутствовал участок, кодируемый 4 экзоном, активировалась в сердцах больных с терминальной стадией сердечной недостаточности [30, 46] .

Молекулярный механизм регуляции альтернативного сплайсинга ТнТ остается не вполне понятным. В настоящее время в наибольшей степени изучены факторы, оказывающие влияние на сплайсинг 5 экзона ТнТ. Установлено, что связывание факторов CUG­BP и ETR­ 3 с UG­богатым участком интронной последовательности, распо­ ложенной ниже экзона 5, приводит к включению данного экзона в последовательность кодирующей РНК [50]. Экспрессия CUG­BP и ETR­3 снижается в процессе онтогенеза [51]. Антагонистами данных факторов являются белки PTB и MBNL, связывающиеся с участками интронных последовательностей, расположенных как выше, так и ниже экзона 5, и препятствующие его встраиванию в кРНК [52] .

ТРОПОНИН С

Тропонин С представлен в организме человека двумя генами: геном (TNNC1), расположенным в хромосоме 3 (3p21.1) и кодирующим сердечную/медленную скелетную изоформу ТнС (с/мсТнС) [53], и геном быстрой скелетной изоформы ТнС (TNNC2), расположенным в 20 хромосоме (20q12) [54, 55]. TNNC1 состоит из 6 экзонов и 5 интронов [56] и экспрессируется в сердечной и медленной скелетной мускулатуре [57]. В экспериментах на цыплятах было показано, что ген TNNC1 экспрессируется также на эмбриональной стадии развития быстрой скелетной мускулатуры [58, 59]. Ген TNNC2 экспрессируется исключительно в быстрой скелетной мускулатуре независимо от стадии развития организма [57] .

154 И.А.Катруха

III. СТРОЕНИЕ КОМПОНЕНТОВ ТРОПОНИНОВОГО КОМПЛЕКСА СЕРДЦА ЧЕЛОВЕКА

ТРОПОНИН I

Продукт трансляции мРНК сердечной изоформы тропонина I состоит из 210 аминокислотных остатков; в процессе синтеза белка первый остаток метионина отщепляется, а следующий за ним аланин под­ вергается ацетилированию [60, 61]. Зрелая молекула белка состоит из 209 аминокислотных остатков и имеет молекулярную массу 24 кДа .

Сердечная изоформа тропонина I состоит из 5 доменов: N­концевого домена, IT­руки, ингибиторного домена, регуляторного домена и С­концевого мобильного домена (рис. 1Б) .

N­концевой домен (остатки 2–32*) специфичен для сердечной изоформы белка и играет важную роль во взаимодействии ТнI с ТнС и регуляции мышечного сокращения. Данный домен состоит из кислого N­концевого участка (остатки 2–11), Xaa­Pro мотива (остатки 12–18) и участка, содержащего два остатка серина (S23, S24), способ­ ных подвергаться фосфорилированию (остатки 19–32) [60, 62]. С использованием методов дот­блоттинга [63] и ЯМР [62, 64–66] уста­ новлено, что N­концевой фрагмент дефосфорилированного чсТнI спо­ собен взаимодействовать с N­концевым глобулярным доменом ТнС (рис. 1А). В этом взаимодействии участвуют аминокислотные остатки, расположенные во фрагменте, ограниченном остатками 19–33 чсТнI [63, 65]. Фосфорилирование остатков S23 и S24 приводит к образо­ ванию нового ­спирального участка (остатки 21–30) [62]. Данное структурное изменение нарушает взаимодействие ТнI с N­концевым доменом ТнС и приводит к смещению кислого N­концевого участка ТнI. Предполагается, что в бифосфорилированной молекуле ТнI кислый N­концевой участок взаимодействует с положительно заря­ женным ингибиторным доменом ТнI, и такое взаимодействие ока­ зывает значительное влияние на Ca2+­зависимую регуляцию мышеч­ ного сокращения [62] .

За N­концевым доменом следует так называемая IT­рука (остатки 42–136), состоящая из двух ­спиралей (H1 (остатки 43–79) и H2 (остатки 90–135)), соединенных гибким линкером [67]. Данный участок молекулы является наименее подвижной частью тропонинового комп­ лекса и выполняет структурную функцию, обеспечивая контакт с тропонинами С и Т и отвечая за пространственную ориентацию * Все номера аминокислотных остатков соответствуют продуктам экспрессии генов тропонина I и Т человека, то есть приводятся с учетом первого отщепляе­ мого метионина, если не указано иначе .

Тропониновый комплекс сердца человека. Структура и функции 155 Рис. 1. Структура сердечной изоформы ТнI человека .

А – расположение ­спиралей H1–H4 в молекуле чсТнI согласно [67]. Струк­ тура N­концевого домена ТнI изображена согласно модели, предложенной в [62], структура мобильного домена – согласно модели, предложенной в [86]. Волнообразной линией обозначен Xaa­Pro участок ТнI (остатки 12–18), образующий пролиновую спираль. Стрелками обозначены короткие ­участки 1 и 2. В овалах указаны белки тонкого филамента, с которыми взаимодействуют соответствующие участки молекулы ТнI [62, 63, 65, 67, 88]. N­ТнС и C­ТнС, соответственно, N­ и С­концевые домены ТнС, Тм – тропомиозин .

Б – доменная организация чсТнI [67]. ИД – ингибиторный домен, РД – регуляторный домен .

ТнI в тропониновом комплексе. Амфифильная часть H1 ­спирали (43–65 остатки) контактирует с С­концевым доменом ТнС [67, 68] .

С­концевая часть ­спирали H1 (остатки 66–79) взаимодействует с H2 ­спиралью ТнТ [67, 69]. Участок тропонина I, ограниченный остатками 80–89, образует гибкий линкер между ­спиралями H1 и H2. Указанный участок богат гидрофобными аминокислотными остатками и вместе с отдельными аминокислотными остатками из H2 ­спирали ТнТ образует гидрофобную область. H2 ­спираль чсТнI образует параллельную суперскрученную спираль с H2 ­спиралью тропонина Т (остатки 226–271 чсТнТ) [67, 70, 71] .

За IT­рукой следует ингибиторный домен (остатки 137–148) [67, 72] (в работах Lindhout & Sykes [73] и Brown et al [74], указы­ ваются несколько другие границы ингибиторного домена – остатки 129–148). В отсутствие ионов Ca2+ 138–148 аминокислотные остатки ингибиторного домена взаимодействуют с актином [72, 75] и, сме­ щая молекулу тропомиозина, препятствуют образованию акто­ миозинового комплекса [76, 77]. В различных работах приводится несколько вариантов структуры ингибиторного домена чсТнI. Так, в исследовании Brown et al [74], проведенном на сердечной изоформе ТнI мыши, с/мсТнС курицы и cТнТ быка, методом SDSL­EPR (site­ directed spin labeling, сайт­направленной модификации и электронного парамагнитного резонанса) показано, что участок, ограниченный остатками 138–145, не имеет устойчивой вторичной структуры. Дан­ ные результаты подтверждались в работе Takeda et al [67], в которой попытки закристаллизовать фрагмент, содержащий остатки 137–148 156 И.А.Катруха не увенчались успехом, что косвенно свидетельствует о высокой под­ вижности и неупорядоченности указанного фрагмента. В то же время данные Lindhout & Sykes [73] свидетельствуют о том, что в присутст­ вии ионов Ca2+ участок, ограниченный остатками 132–135 чсТнI, взаимодействует с гидрофобной областью на поверхности С­домена с/мсТнС, в результате чего следующий за этим участок тропонина I (остатки 135–140) принимает конформацию ­спирали, образуя гидрофобные связи с E­ и H­спиралями С­концевого домена ТнС. При этом участок, ограниченный остатками 141–148, остается в неупоря­ доченном состоянии [73]. Однако в ряде других исследований приво­ дятся доказательства того, что ингибиторный домен может иметь вто­ ричную структуру. Например, данные ферстеровского резонансного переноса энергии (FRET) свидетельствуют о том, что в отсутствие Ca2+ участок сердечной изоформы ТнI курицы, ограниченный остат­ ками 138–149 (остатки 137–148 чсТнI), взаимодействует с актином и при этом принимает более компактную конформацию [75]. Повы­ шение концентрации Ca2+ приводит к изменению конформации ингибиторного домена ТнI и к образованию продолжительной квази­­спирали, взаимодействующей с линкерным участком моле­ кулы ТнС [75, 78]. Возможность образования ингибиторным доме­ ном вторичной структуры в присутствии ионов Ca2+ также была подтверждена методом H/D масс­спектрометрии [79] .

Регуляторный домен чсТнI (остатки 149–163) включает в себя короткую H3 ­спираль (остатки 150–159) [67]. При повышении концентрации Ca2+ данный домен взаимодействует с гидрофобным участком на поверхности N­концевого домена ТнС, формируя третью область связывания чсТнI с ТнС [80]. Взаимодействие регуляторного домена с ТнС приводит к диссоциации ингибиторного домена ТнI от актина и смещению тропомиозина, что делает возможным обра­ зование актомиозинового комплекса [69, 80, 81] .

Мобильный домен чсТнI (остатки 163–210) содержит длинную Н4 ­спираль (остатки 164–188) и С­концевой участок молекулы (остатки 190–210), структура которого до конца не выяснена. В работе Takeda et al [67], в которой тропониновый комплекс был закристаллизован в насыщенном Ca2+ состоянии, не удалось определить структуру последовательности, ограниченной остатками 192–210 ТнI, что, по мнению авторов, говорит о высокой подвижности данного участка в присутствии Ca2+ [67]. В работах, посвященных исследованию структуры тропонина I скелетных мышц, было предложено несколько вариантов строения С­концевого участка молекулы, имеющего высокую степень гомологии с С­концевым участком сердечной Тропониновый комплекс сердца человека. Структура и функции 157 изоформы белка. Исследования с помощью метода ЯМР­спектроско­ пии комплекса, собранного in vitro из рекомбинантных ТнI и ТнС и фрагмента ТнТ [82], или химерных белков [83] показали, что данный участок скелетной изоформы ТнI находится в неупорядоченном состоянии. В то же время данные группы King et al [84], полученные методом малоуглового нейтронного рассеивания, говорят о том, что в присутствии Ca2+ С­конец скелетной изоформы ТнI цыпленка может принимать компактную конформацию, образованную, предпо­ ложительно, ­спиралями, а при низких концентрациях кальция образует удлиненную суперскрученную спираль. В другой работе методом ЯМР­спектроскопии было показано, что С­конец ТнI из скелетной мускулатуры цыпленка имеет вторичную структуру, состоящую из ­спирали, двух коротких анти­параллельных ­слоев и следующих за ними двух ­спиралей [85]. Аналогичная вторичная структура была предложена недавно и для рекомбинантного чсТнI в работе Wang et al [86], выполненной с использованием метода FRET .

Наконец, в работе Zhou et al [87], проведенной с использованием сердечной изоформы ТнI крысы, предполагается, что в отсутствие Ca2+ С­конец ТнI имеет оформленную вторичную структуру, однако при повышении концентрации кальция переходит в подвижное неупо­ рядоченное состояние .

В работах с рекомбинантным скелетным тропонином курицы [85], рекомбинантным сердечным ТнI крысы [87], рекомбинантными фрагментами (остатки 131–210) [88] и (остатки 1–192) [89] сердечной изоформы ТнI человека, было показано, что в отсутствие ионов Ca2+ мобильный домен ТнI взаимодействует с C­концевой частью актина и тропомиозином. Считается, что данные взаимодействия играют важную роль в регуляции Сa2+­зависимого сокращения и стабилизации тропонинового комплекса на поверхности тонкого филамента [88, 89] .

ТРОПОНИН T

Тропонин T играет основную роль в закреплении тропонинового комплекса на тонком филаменте, обеспечивает организацию белков в тропониновом комплексе и участвует в регуляции мышечного сокращения [90, 91]. Как говорилось выше, в сердечной мышце здорового взрослого человека экспрессируется преимущественно одна изоформа тропонина Т, имеющая молекулярную массу 35,9 кДа .

N­концевой метионин в процессе созревания белка отщепляется, а следующий за ним остаток серина подвергается ацетилированию .

Таким образом, зрелая молекула белка состоит из 287 аминокислотных 158 И.А.Катруха остатков. На данный момент удалось получить кристаллическую структуру только некоторых участков молекулы чсТнТ [67], поэтому основная информация о структуре данной молекулы получена путем анализа ее фрагментов .

Молекула чсТнТ имеет вытянутую форму и располагается вдоль тонкого филамента [88, 92]. Данный белок состоит из N­концевого вариабельного домена (остатки 2–68) и консервативных центрального (остатки 69–200) и С­концевого доменов (остатки 201–288) (рис. 2 Б) .

Строение N­концевого домена сильно отличается у различных изо­ форм ТнТ [93]. В N­концевом домене чсТнТ, как и в случае с чсТнI, присутствует уникальная для сердечной изоформы белка аминокис­ лотная последовательность, кодируемая преимущественно экзоном 6 и имеющая длину ~32 аминокислот [94]. Данный участок крайне полярен и отрицательно заряжен, поскольку более чем на половину состоит из остатков глутаминовой кислоты. Ранние исследования, проведенные на коротком изолированном N­концевом фрагменте ТнТ, показали, что этот участок не имеет сайтов взаимодействия с белками тонкого филамента [95, 96]. Впрочем, существуют работы, в которых предполагается, что первые 40 аминокислотных остатков ТнТ все­таки могут непосредственно взаимодействовать с другими компонентами тропонинового комплекса и тропомиозином [97]. Согласно работам, проведенным с использованием различных химерных бел ков и делеционных мутантов ТнТ, N­концевая часть ТнТ оказывает влияние на конформацию молекулы [98–100], взаимодействие тропонинового комплекса с актином и тропомиозином [100, 101], чувствительность сердечной мышцы к ионам Ca2+ [94, 102, 103], а также на развитие максимальной силы сокращения [103, 104] .

В центральном домене чсТнТ находится первый участок (T1) взаимодействия с тропомиозином (остатки 98–136 чсТнТ) [105]. T1 связывается в области контакта двух соседних молекул тропомиозина [92, 106], при этом прочность взаимодействия практически не зависит от концентрации Ca2+ [107]. Точная структура Т1 не ясна, но предпо­ лагается, что данный участок имеет преимущественно ­спиральную структуру [108, 109]. Следующий за T1 участок (остатки 183–200 чсТнТ) является подвижным линкером, соединяющим центральный и С­концевой участки молекулы чсТнТ [67, 109] .

C­концевой участок чсТнТ содержит ­спирали H1 (остатки 204–220) и H2 (остатки 226–271) [67]. H2­спираль участвует во взаимо­ действии с ТнI, формируя с H2­спиралью последнего суперскручен­ ную спираль [67, 70]. Своим С­концом (остатки 256–270) H2­спираль Тропониновый комплекс сердца человека. Структура и функции 159 Рис. 2. Структура сердечной изоформы ТнТ человека .

А – расположение ­спиральных участков H1 и Н2 в молекуле чсТнТ [67] .

В овалах указаны белки тонкого филамента, с которыми взаимодействуют соот­ ветствующие участки молекулы ТнТ [67, 105, 113]. Т1 и Т2 – участки взаимо­ действия с тропомиозином .



Б – доменная организация молекулы чсТнТ .

В – расположение экзонов, кодирующих соответствующие участки молекулы чсТнТ [91, 93]. Серым цветом отмечены экзоны 4 и 13, подвергающиеся альтер­ нативному сплайсингу. Черным цветом отмечен экзон 5, присутствующий только в эмбриональной форме белка .

ТнТ взаимодействует также с Сa2+­связывающими петлями С­кон­ цевого домена ТнС [67]. Структура последних 16 аминокислотных остатков чсТнТ не была определена при кристаллографии тропони­ нового комплекса, что является косвенным признаком подвижности данного участка молекулы [67]. В С­концевом домене расположен второй участок (T2) взаимодействия чсТнТ с тропомиозином. T2 связывается с тропомиозином в районе C190 последнего [110, 111], и данное взаимодействие усиливается в отсутствие ионов Ca2+ [107] .

Существуют противоречивые данные о том, какая конкретно часть С­концевого домена тропонина Т участвует в формировании участка Т2. В работе Jin et al [105] методом иммуноферментного анализа с использованием фрагментов медленной скелетной изоформы тропо­ нина Т мыши было показано, что Т2 участок расположен между остатками 180–204 (гомологичен участку, ограниченному остатками 197–239 чсТнТ). Однако в других работах предполагается, что учас­ ток Т2 образован последними 16 аминокислотными остатками ТнТ [111–113]. Взаимодействуя с тропомиозином и, возможно, актином, C­концевой участок ТнТ стабилизирует неактивное состоя ние тропонинового комплекса, поскольку делеция последних 14 амино­ кислотных остатков чсТнТ приводила к увеличению актин­акти­ вируемой АТФазной активности in vitro [113] .

160 И.А.Катруха

ТРОПОНИН C

Изоформа ТнС, экспрессируемая в сердечной и медленной скелет­ ной мускулатуре, имеет массу 18,4 кДа и состоит из 161 амино­ кислотного остатка [114]. В отличие от чсТнТ и чсТнI, N­концевой метионин зрелой молекулы с/мсТнС не отщепляется и подвергается ацетилированию [114, 115]. ТнС состоит из короткого N­концевого домена (остатки 1–13), содержащего первую ­спираль (N­­спираль), и четырех Ca2+­связывающих EF­рук (EF­hands), объединенных попарно в глобулярный N­концевой (остатки 14–87) и С­концевой (остатки 92–161) домены (рис. 3). Каждая EF­рука состоит из двух ­спиралей (­спирали A–H), между которыми расположена петля, обеспечивающая связывание Ca2+ и включающая в свой состав учас­ ток, формирующий короткую антипараллельную ­складку с анало­ гичным участком соседней EF­руки [67, 116]. N­ и С­концевые домены соединены коротким линкером, расположенным между ­спиралями D и E (D–E линкер) [116] .

У быстрой скелетной изоформы ТнС все четыре EF­руки способны связывать катионы Mg2+ или Ca2+ [117, 118]. У с/мсТнС в первой EF­руке произошли неконсервативные замены, препятствующие связыванию двухвалентных катионов [116, 119]. Таким образом, сердечная изоформа ТнС содержит только три Ca2+­связывающих участка: два С­концевых участка, обладающих высоким сродством к Ca2+ (KdCa~107 M–1) и один участок с низким сродством (KdCa~105 M–1) [120–122] .

Участки высокого сродства к ионам кальция, расположенные в С­концевой глобуле чсТнС (III и IV EF­руки), имеют относительно низкую специфичность, и при физиологических условиях постоянно заполнены ионами Mg2+ или Ca2+ [118] (рис. 3 А). С­концевой глобуляр­ ный домен обеспечивает взаимодействие ТнС с остальными белками тропонинового комплекса, и не принимает непосредственного учас­ тия в Ca2+­зависимой регуляции мышечного сокращения [122, 123] .

Вторая EF­рука, находящаяся в N­концевом домене cТнС, обладает более низким сродством, но более высокой специфичностью к ионам Ca2+ и играет ключевую роль в регуляции сокращения сердечной мускулатуры (см. ниже) [122, 124] .

Тропониновый комплекс сердца человека. Структура и функции 161 Рис. 3. Схема строения сердечной/медленной скелетной изоформы ТнС человека .

А – схема вторичной структуры с/мсТнС [67, 116]. Цилиндрами обозначены ­спирали N и А–Н, стрелками – ­участки. Фиолетовыми кружками обозначены низкоспецифичные участки, способные связывать как ионы Ca2+, так и Mg2+ .

Зеленым кружком обозначен участок с высокой специфичностью к Ca2+. В овалах указаны компоненты тропонинового комплекса, с которыми взаимодействуют соответствующие участки молекулы ТнС [63, 65, 67, 80]. РД – регуляторный домен, N­ТнI – N­концевой домен ТнI, ИД – ингибиторный домен ТнI .

Б – доменная структура ТнС [67] .

IV. РОЛЬ ТРОПОНИНОВОГО КОМПЛЕКСА

В РЕГУЛЯЦИИ СЕРДЕЧНОГО СОКРАЩЕНИЯ

СТРОЕНИЕ САРКОМЕРА И МЕХАНИЗМ МЫШЕЧНОГО СОКРАЩЕНИЯ

Функциональной единицей, обеспечивающей сокращение сердечной мышцы, считается саркомер. Саркомер состоит из образованных миозином толстых филаментов, каждый из которых окружен шестью тонкими филаментами, закрепленными своими «+»­концами на Z­диске. Тонкий миофиламент образован фибриллярным актином (F­актином), связанным с двумя нитями тропомиозина и молекулами тропонинового комплекса. Фибрилла F­актина образуется за счет полимеризации молекул глобулярного актина и при электронной микроскопии представляется в виде двуцепочечной правозакрученной спирали [125, 126], имеющей бороздки с каждой из сторон (рис. 4) .

Нить тропомиозина образуется за счет полимеризации ­спиральных димеров тропомиозина, формирующих суперскрученную спираль [127]. При этом концы димеров частично перекрываются с соседними димерами «хвост к голове», что приводит к образованию протяженной нити тропомиозина, которая располагается в каждой из двух бороздок F­актина [128]. Взаимодействия актина и тропомиозина имеет некова­ лентный характер [129], при этом каждый димер тропомиозина взаи­ модействует с 7 молекулами актина тонкого филамента [130] .

Тропониновый комплекс расположен на тонком филаменте через каждые 7 мономеров актина, таким образом стехиометрическое 162 И.А.Катруха Рис. 4. Схема строения тонкого филамента при низких (А) и высоких (Б) кон­ центрациях Ca2+ .

ТнI отмечен голубым цветом, ТнС – красным, ТнТ – желтым. Расположение и взаимодействия белков тропонинового комплекса отображены согласно моделям [62, 67, 86, 87, 109]. При низких концентрациях Ca2+ II EF­рука в N­концевом домене ТнС (N­ТнС) не заполнена ионами, а III и IV EF­руки С­концевого домена (C­ТнС) связывают ионы Ca2+ или Mg2+ (фиолетовые кружки) [118] .

Ингибиторный домен (ИД) ТнI взаимодействует с актином (серый). Предпо­ лагается, что мобильный домен ТнI имеет вторичную структуру [85] и способен взаимодействовать с актином и тропомиозином (оранжевый) [85, 87–89]. С­кон­ цевой участок ТнТ (С­ТнТ) также взаимодействует с актином и тропомиозином, дополнительно стабилизируя молекулу тропонинового комплекса [111–113] .

Молекула тропомиозина блокирует участок взаимодействия миозина с акти­ ном. Повышение внутриклеточной концентрации Ca2+ (зеленые кружки) и его связывание с N­концевым доменом ТнС приводит к изменению конформации ТнС, диссоциации ингибиторного и мобильного доменов тропонина I от актина и взаимодействию Н3 ­спирали ТнI с N­концевым доменом ТнС. Отделившись от актина, мобильный домен ТнI переходит в неупорядоченное подвижное состояние [86, 87, 109]. Данные структурные изменения позволяют молекуле тропомиозина сместиться вглубь бороздки F­актина, что открывает участок взаимодействия актина с миозином и приводит к развитию мышечного сокра­ щения .

Тропониновый комплекс сердца человека. Структура и функции 163 соотношение актин:тропомиозин:тропонин составляет 7 : 1 : 1 [131] (рис. 4). Присоединение тропонинового комплекса к микрофиламенту осуществляется преимущественно за счет взаимодействий тропонина Т с тропомиозином. Также во взаимодействии тропонинового комп­ лекса с тонким филаментом участвует ТнI, ингибиторный и мобиль­ ный домены которого в отсутствие ионов Ca2+ взаимодействуют с актином [132, 133]. Предполагается также, что мобильный домен ТнI способен взаимодействовать с тропомиозином [134, 135] .

Сокращение сердечной мышцы происходит благодаря скольжению тонких актиновых филаментов относительно толстых миозиновых .

Данный процесс обеспечивается за счет циклического АТФ­зави­ симого взаимодействия миозина и актина. Миозин связывает и гидролизует АТФ до АДФ и неорганического фосфата, но при этом практически не способен избавляться от накопившихся в активном центре продуктов АТФазной реакции. Головка миозина (субфрагмент S1 миозина), содержащая в своем составе АДФ и фосфат, способна слабо взаимодействовать с актином, что активирует процесс осво­ бождения фосфата из активного центра S1­миозина. Освобождение неорганического фосфата (а вслед за этим и АДФ) из активного центра миозина сопровождается изменением ориентации «шейки»

головки миозина, протягиванием нити актина относительно головки миозина и развитием натяжения. Связывание новой молекулы АТФ приводит к диссоциации S1­миозина от актина и после гидролиза АТФ происходит очередное циклическое присоединение головки миозина к актину и осуществляется новый «шаг» миозина по актину [136, 137] .

РОЛЬ ТРОПОНИНОВОГО КОМПЛЕКСА

В РЕГУЛЯЦИИ СОКРАЩЕНИЯ СЕРДЕЧНОЙ МЫШЦЫ

Сокращение гладкой и поперечнополосатой мускулатуры развивается при повышении концентрации Ca2+ в цитоплазме миоцита. Однако, в отличие от гладких мышц, где образование актомиозинового комплекса в основном регулируется за счет Ca2+­зависимого фос­ форилирования одной из легких цепей молекулы миозина (MLC20) [138], Ca2+­зависимая регуляция сокращения сердечной и скелетной мускулатуры основана на изменении структуры тонких филаментов [139, 140] .

На данный момент предложено несколько моделей регуляции сокращения кардиомиоцитов: трехстадийная модель [140–142], «fly casting» модель [82, 143], а также четырехстадийная модель [87, 144] .

Согласно трехстадийной модели, белки тонкого филамента могут находиться в трех состояниях: в блокированном B­положении (от 164 И.А.Катруха англ. blocked), закрытом С­положении (от англ. closed) и открытом миозин­связанном M­положении [141]. Во время диастолы при низких (~100 нМ [145]) цитоплазматических концентрациях свободного Ca2+ тонкий филамент находится в В­положении. При этом ингибиторный домен ТнI связывается с молекулой F­актина и смещает молекулу тропомиозина на периферию бороздки актина, что приводит к сте­ рическому блокированию участка связывания миозина с тонким филаментом [146]. Смещению тропомиозина также способствует взаимодействие с ним Т2 участка ТнТ, усиливающееся в отсутствие ионов Ca2+ [107] .

Распространение потенциала действия по мышечному волокну в начале систолы приводит к выходу ионов Ca2+ из саркоплазматичес­ кого ретикулума и повышению концентрации свободного Ca2+ в цитоплазме (до ~1 мкМ [145]). Присоединение Ca2+ ко второй EF­руке c/мсТнС приводит к изменению конформации всего N­концевого домена белка. При этом происходит отдаление ­спиралей B и C от ­спиралей A и D [147–149] и появлению на поверхности N­концевого домена тропонина С гидрофобной области, с которой связывается регуляторный домен ТнI [80, 150, 151]. В отличие от быстрой ске­ летной изоформы ТнС, связывание Са2+ со второй EF­рукой не приводит к изменению конформации с/мсТнС от полностью закры­ той (со спрятанными гидрофобными участками и почти антипарал­ лельной ориентацией спиралей, фланирующих Са2+­связывающие участки) на полностью открытую (с доступными гидрофобными участками и спиралями, фланкирующими Са2+­связывающие участки, ориентированными друг относительно друга под углом 90°) [116, 150]. При связывании кальция N­концевой домен с/мсТнС остается в «полуоткрытой» конформации [116, 152], и считается, что для ее стабилизации необходимо присутствие регуляторного домена чсТнI [80, 153]. Взаимодействие регуляторного домена ТнI с ТнС приводит к разрыву связи между ингибиторным доменом ТнI и актином, некоторому смещению молекулы тропомиозина вглубь бороздки F­актина и к образованию слабого контакта между S1­миозином и актином (С­состояние). Данное взаимодействие не ведет к полной активации актомиозинового мостика, но способствует дальнейшему смещению молекулы тропомиозина вглубь бороздки актина [154]. В М­состоянии тропомиозин окончательно смещается вглубь бороздки F­актина, полностью открывая участок связывания головки миозина с актином [155–157], что приводит к образованию прочного актомио­ зинового комплекса и развитию АТФ­зависимого мышечного сокра­ щения [140]. При снижении цитоплазматической концентрации Ca2+ Тропониновый комплекс сердца человека. Структура и функции 165 происходит изменение конформации с/мсТнС, которое приводит к разрыву контакта регуляторного домена чсТнI с N­концевым доменом с/мсТнС и смещению ингибиторного домена чсТнI в сторону актина .

Возобновляющееся взаимодействие ингибиторного домена ТнI с актином сдвигает молекулу тропомиозина к внешней стороне микро­ филамента, блокируя участок связывания миозина с актином, что предотвращает образование актомиозиновых комплексов и приво­ дит к расслаблению мышцы .

Развитие трехстадийной модели было предложено в работе Robinson et al [158], где методом FRET было показано, что в отсутствие S1­миозина только 50% насыщенного Ca2+ комплекса актина с тропонином и тропомиозином находилось в активированном состоянии. Данные результаты говорили о том, что только повышения концентрации Ca2+ недостаточно для полной акти­ вации сокращения. Добавление S1­миозина и образование прочных актомиозиновых комплексов стабилизировало активное состояние тонкого филамента. Robinson et al предположили, что миозин также оказывает влияние на сродство ТнС к Ca2+, регулируя скорость диссоциации регуляторного домена ТнI от N­концевой доли ТнС [158]. Похожие результаты были получены группой Houmeida et al [159] с использованием нативного тропонинового комплекса сердца свиньи, где методом спектроскопии в остановленном потоке было показано, что для полной активации тонкого филамента необходимо присутствие как Ca2+, так и S1­миозина, а добавление только одного из агентов приводило лишь к ~70% активации филамента. Работы, посвященные более детальному исследованию строения компонентов актомиозинового комплекса и кинетики их взаимодействия, привели к созданию новых моделей регуляции мышечного сокращения .

Исследования структуры скелетного ТнI привели к появлению «flycasting» модели мышечного сокращения (модель «нахлыста», термин, описывающий заброс приманки при помощи спиннинга), согласно которой важную регуляторную роль играет С­концевой мобильный домен скелетной изоформы ТнI [143]. Предполагается, что в отсутствие Ca2+ мобильный домен ТнI принимает конформацию, состоящую из H4 ­спирали, за которой следуют две короткие анти­ параллельные ­складки и две ­спирали. В данной конформации мобильный домен взаимодействует с актином, стабилизируя неактив­ ное состояние актинового филамента. Регуляторный домен ТнI не имеет вторичной структуры и свободно располагается между актином и N­концевым доменом ТнС. Повышение концентрации Ca2+ приводит к взаимодействию N­концевого домена ТнС с регуля­ торным доменом ТнI и приобретению последним ­спиральной 166 И.А.Катруха структуры [143]. Затем происходит разрыв связей между мобильным доменом ТнI и актином, при этом мобильный домен переходит в подвижное неупорядоченное состояние. Данные структурные изме­ нения стимулируют диссоциацию ингибиторного домена ТнI от актина и его ассоциацию с DE­линкером ТнС. Открытое состояние ТнС стабилизируется взаимодействием с регуляторным доменом ТнI, однако возобновляющиеся при снижении концентрации Ca2+ электростатические взаимодействия мобильного домена с актином стимулируют диссоциацию регуляторного домена ТнI от N­концевого домена ТнС, взаимодействие ингибиторного и мобильного доменов ТнI с актином и переход мышцы в расслабленное состояние [143] .

Четырехстадийная модель мышечного сокращения, предложен­ ная Lehrer [144] и подтвержденная в недавней работе Zhou et al [87], в целом объединяет и дополняет предложенные ранее схемы сокращения кардиомиоцитов. Согласно данной модели, тонкий филамент может находиться в четырех структурных состояниях: бло­ кированном Mg2+­состоянии, закрытом Ca2+­состоянии и открытых Mg2+­S1­ и Ca2+­S1­состояниях [87, 144] (рис. 5). В блокированном Mg2+­состоянии, соответствующем В­стадии трехстадийной модели, взаимодействие ингибиторного домена ТнI с актином смещает моле­ кулу тропомиозина и препятствует образованию актомиозиновых Рис. 5. Схема четырехстадийной модели мышечного сокращения .

ТнI отмечен голубым цветом, ТнС – красным, ТнТ – желтым. В блокирован­ ном состоянии (1) ингибиторный и мобильный домены ТнI взаимодействуют с актином (серый) и тропомиозином (оранжевый), и препятствуют образованию актомиозинового комплекса. При этом EF­рука, находящаяся в N­концевом домене ТнС, не заполнена ионами Ca2+, в то время как обе EF­руки С­концевого домена связывают ионы Ca2+ или Mg2+ (фиолетовые кружки). Деполяризация мембраны кардиомиоцита приводит к увеличению внутриклеточной концентра­ ции ионов кальция и связыванию Ca2+ (зеленые кружки) с N­концевым доменом ТнС. Данное взаимодействие приводит к изменению конформации ТнС, диссо­ циации ТнI от актина и его ассоциации с ТнС. Это позволяет молекуле тропо­ миозина несколько сместиться в сторону бороздки актина и способствует возник­ новению слабого контакта между S1­миозином (фиолетовый) и актином (закры­ тое состояние (2)). Взаимодействие миозина с актином вызывает еще большее смещение молекулы тропомиозина вглубь борозки актина, образованию проч­ ного актомиозинового комплекса и переходу системы в открытое Ca2+­S1­сос­ тояние (3). Альтернативный путь активации микрофиламента заключается в переходе из блокированного состояния в открытое Mg2+­S1­состояние (4), стимулируемом связыванием S1­миозина с актином в отсутствие кальция. Пред­ полагается, что переход в Mg2+­S1­состояние может способствовать присоеди­ нению Ca2+ к N­концевому домену ТнС и переходу тропонинового комплекса в открытое состояние. По материалам [87, 160] .

Тропониновый комплекс сердца человека. Структура и функции 167

Рис. 5.168 И.А.Катруха

мостиков. Мобильный домен ТнI дополнительно стабилизирует тропониновый комплекс на поверхности тонкого филамента, взаимо­ действуя с актином и, возможно, тропомиозином. Повышение концентрации Ca2+ вызывает относительно быструю диссоциацию мобильного домена ТнI от тонкого филамента и переход мобильного домена в подвижное состояние. Затем следует взаимодействие регуля­ торного домена с N­концевым доменом ТнС, что приводит к диссоциа­ ции ингибиторного домена ТнI от актина (закрытое Ca2+­состояние, соответствующее С­положению трехстадийной модели). Молекула тропомиозина полностью смещается вглубь бороздки актина, что приводит к образованию прочных актомиозиновых мостиков и развитию мышечного сокращения (открытое Ca2+­S1­состояние, соответствующее М­положению трехстадийной модели). В Mg2+­S1 состоянии, представляющем альтернативный путь активации тонкого филамента, S1 фрагмент миозина способен взаимодействовать с акти­ ном в отсутствие Ca2+. Предполагается, что данное взаимодействие смещает молекулу тропомиозина, что, в свою очередь, приводит к диссоциации мобильного домена ТнI от актина и взаимодействию регуляторного домена ТнI с ТнС, увеличивая чувствительность пос­ леднего к концентрации Ca2+ [144]. Несмотря на то, что перехода в Mg2+­S1 состояние недостаточно для полноценного развития мышеч­ ного сокращения, которое происходит только при связывании Ca2+ с N­концевой глобулой ТнC, данное взаимодействие способствует переходу тонкого филамента в активное состояние и образованию прочного актомиозинового комплекса [87] .

Расслабление мышцы при понижении концентрации кальция согласно четырехстадийной модели происходит в два этапа, разли­ чающихся по своей скорости. На первом (быстром) этапе происходит диссоциация Ca2+ из N­концевого домена ТнС, что приводит к взаимо­ действию мобильного домена ТнI с актином и отрыву регуляторного домена ТнI от ТнС .

Данные структурные изменения стимулируют более медленную диссоциацию ингибиторного домена ТнI от ТнС и ассоциацию ингибиторного домена ТнI с актином. Присутствие S1­миозина препятствует взаимодействию мобильного домена ТнI с актином и, таким образом, стабилизирует открытую конформацию ТнC, дополнительно замедляя процесс расслабления мышцы. В результате скорость смещения ингибиторного домена ТнI оказывается сравнимой со скоростью образования актомиозинового комплекса и, таким образом, данный этап может оказывать влияние на скорость мышечного расслабления [87, 160] .

Тропониновый комплекс сердца человека. Структура и функции 169 Связывание S1­миозина с актином в отсутствие Ca2+, приводящее к формированию отрытого состояния тонкого филамента, позволяет дать объяснение таким особенностям функционирования сердечной мускулатуры, как зависимая от длины активация кардиомиоцитов [161], медленное расслабление миоцитов при снижении концентра­ ции кальция, и увеличенную чувствительность тонкого филамента к кальцию при образовании актомиозинового комплекса [144] .

Согласно существующим моделям, тропониновый комплекс играет важную роль в регуляции сердечного сокращения. Изменения конформации компонентов тропонинового комплекса обеспечивают развитие сокращения при повышении внутриклеточной концентра­ ции Ca2+ и расслабление сердечной мускулатуры при ее снижении .

Более того, особенности строения белков, входящих в состав тропо­ нинового комплекса, позволяют осуществлять тонкую регуляцию данных процессов, что дает возможность сердечной мышце приспо­ сабливаться к разнообразным физиологическим и патологическим состояниям. Некоторые из механизмов регуляции функционирования тропонинового комплекса и их роль в адаптации сердечной мышцы к различным условиям обсуждаются в следующих разделах .

ТРОПОНИНОВЫЙ КОМПЛЕКС И РЕГУЛЯЦИЯ СИЛЫ СОКРАЩЕНИЯ

МЫШЦЫ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ СТЕПЕНИ ЕЕ РАСТЯЖЕНИЯ .

ЗАКОН ФРАНКА­СТАРЛИНГА

Согласно закону Франка­Старлинга, сила мышечного сокращения увеличивается пропорционально растяжению мышцы. Особенно эта зависимость выражена в сердечной мышце, где сила сокращения миокарда увеличивается при большем наполнении желудочков кровью [162]. Данный механизм позволяет синхронизовать объем сердечного выброса с объемом крови, поступающим в сердце из вен. Увеличенный объем поступающей в сердце крови в большей степени растягивает стенки желудочка, что приводит к увеличению силы сокращения мышцы и, в результате, объема сердечного выброса .

Молекулярные механизмы, приводящие к такому эффекту, до конца не понятны. Предполагается, что причиной увеличения сердечного выброса может служить повышение чувствительности миофиламента к ионам Ca2+, уменьшение расстояния между тонкими и толстыми филаментами, усиление кооперативности мышечного сокращения [163, 164] .

Данные многих исследований указывают на то, что тропониновый комплекс может принимать участие в регуляции зависимой от растяжения силы сокращения сердечной мышцы [165, 166]. В 170 И.А.Катруха экспериментах с трансгенными мышами было показано, что замена сердечной изоформы ТнI на медленную скелетную изоформу этого белка приводила к снижению данной зависимости и увеличению сродства ТнС к Ca2+ [165, 167]. И, наоборот, в экспериментах на скини­ рованных скелетных миоцитах кролика было показано, что замена скелетного тропонина на сердечный тропонин свиньи приводила к усилению зависимости силы сокращения от растяжения мышцы и снижению сродства ТнС к Ca2+ [166]. Также было установлено, что фосфорилирование сердечной изоформы ТнI по остаткам S23 и S24 протеинкиназой А (PKA) оказывает значительное влияние на эффект Франк­Старлинга в сердечной мускулатуре, снижая чувствительность мышцы к Ca2+ [167, 168] .

Причины, по которым сердечная изоформа ТнI оказывает боль­ шее, чем скелетные изоформы белка, влияние на зависимую от рас­ тяжения силу сокращения миоцитов, остаются не до конца изучен­ ными. В работе Tachampa et al [169] предполагается, что важную роль в регуляции данного процесса может играть остаток T144, расположенный в ингибиторном домене сердечной изоформы ТнI. В скелетных изоформах белка в данной позиции располагается пролин .

Замена данного аминокислотного остатка на треонин приводила к увеличению зависимости Франка­Старлинга практически до уровня, характерного для сердечной изоформы белка [169] .

ВЛИЯНИЕ АЦИДОЗА НА СОКРАЩЕНИЕ СЕРДЕЧНОЙ МЫШЦЫ

Сердечная мускулатура крайне чувствительна к падению внутрикле­ точного рН (ацидозу). Понижение значения рН ниже физиологического уровня снижает эффективность сердечных сокращений, нарушает Са2+­зависимую регуляцию, а также может приводить к возникнове­ нии аритмии [170–172]. Физиологические флуктуации значений рН возникают при изменении сердечных нагрузок и учащении сердечного ритма [173]. Опасное понижение внутриклеточного рН (до значений 6,5 и ниже [174, 175]), обусловленное накоплением продуктов метабо­ лизма, в т.ч. лактата [176], наблюдается при продолжительной ишемии сердечной мускулатуры .

Тропониновый комплекс играет важнейшую роль в чувствитель­ ности сократительного аппарата к понижению рН [21, 177, 178]. Так, отмечалось, что эмбриональные миоциты, в которых экспрессируется медленная скелетная изоформа тропонина I, значительно меньше подвержены влиянию ацидоза, нежели кардиомиоциты взрослого организма [14, 179]. Замена сердечной изоформы ТнI на медленную скелетную в первичной культуре кардиомиоцитов крысы приводила Тропониновый комплекс сердца человека. Структура и функции 171 к понижению, по сравнению с контролем, порога активации ионами Ca2+ и повышала значение pCa50 при понижении рН (до значения 6,2) [21]. Похожие результаты были получены в экспериментах на транс­ генных мышах, у которых сердечная изоформа белка была заменена на медленную скелетную [19] .

В экспериментах, проведенных на мышах, было показано, что раз­ личия в чувствительности изоформ тропонина к изменению рН могут быть обусловлены заменой одного аминокислотного остатка, распо­ ложенного в регуляторном домене сердечной изоформы ТнI – А164 (гомологичен A163 последовательности чсТнI). В молекуле скелетной изоформы ТнI в данной позиции находится гистидин. Перфузия изолированных сердец мышей дикого типа буфером с низким рН (рН 6,8) быстро приводила к нарушениям в работе левого желудочка и понижению создаваемого им давления крови. В то же время сердца трансгенных мышей, у которых остаток H164 был заменен на аланин, оказались гораздо более устойчивыми к понижению рН [180]. Указанная мутация ослабляла негативный эффект ишемии­ реперфузии и уменьшала длительность аритмии [180]. Аналогичное восстановление чувствительности к Ca2+ при понижении рН до 6,5 наблюдалось и в условиях in vitro при использовании мутантного A163H чсТнI человека [178]. Недавнее исследование, проведенное с использованием пептида, соответствующего ингибиторному домену чсТнI, в который была введена замена A163H, показало, что H163 взаимодействует с остатками E15 и E19 чсТнС [181]. Авторы пред­ полагают, что повышение положительного заряда боковой группы гистидина, происходящее при понижении рН, приводит к усилению взаимодействия ингибиторного домена мутантного сТнI с N­конце­ вым доменом ТнС, что стабилизирует открытую конформацию пос­ леднего и приводит к увеличению чувствительности к Ca2+ [181] .

Тропонин Т также может оказывать влияние на работу сердечной мышцы при понижении рН. Однако интересно, что в отличие от ТнI, cердечная изоформа тропонина Т более устойчива к изменению внутриклеточного рН, чем скелетные изоформы белка. Так, замена сердечной изоформы ТнТ на быструю скелетную изоформу белка приводила к увеличению влияния снижения рН на сокращение мышцы по сравнению с мышцей дикого типа in vitro. У трансгенных мышей при понижении рН до 6,5 наблюдалось снижение максимальной силы сокращения и pCa50 по сравнению с контролем [182] .

172 И.А.Катруха

V. ВЛИЯНИЕ ПОСТТРАНСЛЯЦИОННЫХ МОДИФИКАЦИЙ

КОМПОНЕНТОВ ТРОПОНИНОВОГО КОМПЛЕКСА

НА РЕГУЛЯЦИЮ МЫШЕЧНОГО СОКРАЩЕНИЯ

Одним из важнейших механизмов регуляции биохимической актив ности белков является фосфорилирование. В различных исследованиях было показано, что ТнТ и ТнI могут подвергаться фосфорилированию различными протеинкиназами, и данные пост­ трансляционные модификации оказывают существенное влияние на конформацию и свойства тропонинового комплекса. Нарушение механизмов фосфорилирования тропонинов может быть связано с развитием различных патологий сердечной мускулатуры, что также подтверждает важную роль данных модификаций в функциони­ ровании тропонинового комплекса .

ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ ТРОПОНИНА I

В экспериментах in vitro и in vivo, а также методом компьютерного анализа in silico [183] было идентифицировано множество амино­ кислотных остатков сердечной изоформы тропонина I, способных подвергаться фосфорилированию. Так, в экспериментах in vivo и in vitro описано 17 аминокислотных остатков, которые потенциально могут быть фосфорилированы различными протеинкиназами [183–194] (рис. 6). Функциональная значимость фосфорилирования некоторых из этих аминокислотных остатков чсТнI in vivo на данный момент еще не до конца изучена, но есть участки, фосфорилирование которых подробно исследовано, и поэтому не приходится сомневаться в том, что данный тип посттрансляционных модификаций тропонина I является важнейшим механизмом регуляции мышечного сокращения .

ПРОТЕИНКИНАЗА А

При повышенных нагрузках (например, при физических упражне­ ниях) организму требуется более интенсивный приток богатой кислородом крови к органам. Эта потребность обеспечивается за счет увеличения объема сердечного выброса и увеличения частоты сердечных сокращений. Данные процессы находятся под контролем симпатической нервной системы, активирующей ­адренергические рецепторы кардиомиоцитов [195]. Одним из важнейших мессендже­ ров, появляющихся в кардиомиоцитах при ­адренергической стиму­ ляции, является цАМФ, активирующий PKA. Основными белками­ мишенями PKA, участвующими в регуляции сердечного сокращения, являются белки миофиламента: миозин­связывающий белок С (cMyBP­C) [196], титин [197, 198], ТнI [199–201], а также белки, Рис. 6. Расположение участков фосфорилирования ТнI и ТнТ в тропониновом комплексе .

ТнI отмечен голубым цветом, ТнС – красным, ТнТ – желтым. Фосфорилируемые аминокислотные остатки ТнI обозначены голубыми кружками, ТнТ – желтыми кружками. Зеленые кружки – ионы кальция. Тропониновый комплекс изображен в открытом Ca2+­связанном состоянии .

А – схема изменения конформации N­концевого домена чсТнI при фосфорилировании остатков S21 и S22 по материалам Тропониновый комплекс сердца человека. Структура и функции [62]. В дефосфорилированном состоянии остатки 1–31 ТнI взаимодействуют с N­концевым доменом ТнС. Предполагается, что фосфорилирование S23 и S24 приводит к образованию ­спирали остатками 21–30 и смещению кислого N­концевого участка ТнI (остатки 2–11) к ингибиторному домену (ИД) ТнI (рис. 6 Б). Дополнительно указано положение остатков Y26 и S31, закрытых N­концевым доменом чсТнС на рис. 6Б .

Б – схема расположения известных аминокислотных остатков ТнI и ТнТ, подвергающихся фосфорилированию [183–194, 242–247] .

174 И.А.Катруха участвующие в связывании и транспорте ионов Ca2+: фосфоламбан [202], дигидропиридиновый и рианодиновый рецепторы [203, 204] .

PKA­зависимое фосфорилирование белков миоцита приводит к усилению работы сердечной мышцы. Этот эффект достигается как за счет увеличения силы сокращения (инотропный эффект), так и за счет увеличения скорости расслабления сердечной мышцы при повы­ шенной частоте сердечных сокращений (люзитропный эффект), что необходимо для нормального наполнения сердца кровью во время диастолы. Инотропное действие PKA реализуется, в основном, за счет фосфорилирования кальциевых каналов (дигидропиридиновых и рианодиновых рецепторов), что приводит к увеличению выхода кальция из цистерн ретикулума и увеличению входа Ca2+ снаружи внутрь кардиомиоцитов. Оба этих процесса приводят к повышению концентрации кальция в цитоплазме [203]. Люзитропное действие PKA реализуется за счет фосфорилирования cMyBP­C, фосфоламбана и ТнI, что приводит к увеличению скорости расслабления сердечной мышцы. Данный эффект может быть достигнут за счет снижения чувствительности миоцитов к Ca2+, а также за счет увеличения ско­ рости образования актомиозиновых мостиков. Предполагается, что фосфорилирование ТнI PKA может оказывать влияние на оба пути расслабления мускулатуры [205–208] .

Особый интерес к активности PKA связан также и с тем, что данная протеинкиназа фосфорилирует аминокислотные остатки S23 и S24 чсТнI [60, 184, 185, 209], которые расположены в уникальной N­концевой части молекулы чсТнI, отсутствующей у скелетных изоформ белка. Таким образом, фосфорилирование PKA представляет собой механизм регуляции мышечного сокращения, характерный только для сердечной, но не скелетной мускулатуры. Согласно данным масс­спектрометрического исследования тропонина, аффинно выде­ ленного из сердец животных и человека, в норме в полностью дефос­ форилированном состоянии находится около половины молекул ТнI, в то время как оставшаяся часть молекул представлена моно­ или бифосфорилированной формами белка. Так, было показано, что 41±3% тропонина I, выделенного из сердец крыс, находилось в полностью дефосфорилированной форме, 46±1% – в монофосфори­ лированной форме, 13±3% – в бифосфорилированной форме [210] .

В работе Van Der Velden et al при исследовании образцов сердечной ткани человека, полученных путем биопсии у здоровых доноров, было показано, что 48,9±10,0% тропонина I полностью дефосфо­ рилировано, 21,6±9,8% находится в монофосфорилированной форме и 29,5±11,3% – в бифосфорилированной форме [184]. Похожие Тропониновый комплекс сердца человека. Структура и функции 175 результаты (50,5±5,9% дефосфорилировано, 38,6±3,8% монофос­ форилировано и 10,9±2,2% бифосфорилировано) были получены в исследовании Zhang et al [185]. При этом в исследованиях [185, 210] отмечалось, что только S23 фосфорилирован в случае монофосфо­ рилированной формы тропонина I .

В работе Howarth et al [62] методом ЯМР было показано, что бифос­ форилирование пептида, содержащего остатки 1–32 ТнI, по S23 и S24 приводит к значительным конформационным изменениям данного участка. Предполагается, что в отсутствие фосфорилирования участок 1–32 молекулы чсТнI находится в неструктурированном состоянии и взаимодействует с N­концевой глобулой ТнС. Фосфорилирование S23 и S24 приводит к образованию аминокислотными остатками 21–30 ­спиральной структуры, диссоциации N­концевой части ТнI от ТнС и ее смещению к ингибиторному домену ТнI (рис. 6 А) .

Согласно гипотезе, выдвинутой авторами, именно взаимодействие N­концевого домена с ингибиторным доменом чсТнI опосредует эффекты фосфорилирования ТнI PKA [62] .

Роль фосфорилирования S23 и S24 PKA в снижении чувствитель­ ности сердечной мышцы к ионам Ca2+ и увеличении скорости расслаб­ ления миоцитов подтверждена многочисленными исследованиями, проведенными как in vitro, так и in vivo. В экспериментах in vitro с фрагментами и целыми молекулами cТнI и cТнС мыши фосфори­ лирование остатков S23 и S24 приводило к снижению чувствитель­ ности комплекса ТнI–ТнС к ионам Ca2+ и снижению сродства ТнI к ТнС [211, 212]. В экспериментах in vivo с трансгенными мышами, у которых сердечная изоформа тропонина I была заменена на медленную скелетную изоформу, в которой отсутствует участок фос форилирования PKA, была отмечена более низкая скорость расслабления сердечной мышцы, чем у мышей дикого типа. Также в миоцитах мутантных мышей наблюдалась повышенная по срав­ нению с миоцитами дикого типа чувствительность к Ca2+ [20, 213] .

Аналогичные эффекты были отмечены у трансгенных мышей при замене в сердечной изоформе ТнI остатков S23 и S24 на аланины, фосфорилирование которых невозможно [214, 215]. И наоборот, при замене S23 и S24 на остатки аспарагиновой кислоты, имитирующей фосфорилирование, у мутантных мышей наблюдалось повышенное расслабление миоцитов левого желудочка по сравнению с мышами дикого типа [216]. Схожие результаты были получены in vitro с использованием препарата скинированных кардиомиоцитов чело­ века, в которых нативный тропониновый комплекс был заменен на реконструированный комплекс, содержащий мутантный по одному 176 И.А.Катруха или обоим остаткам серина чсТнI [208]. При этом было показано, что данный эффект наблюдается только при одновременной замене двух остатков серина, в то время как одиночные замены не приводили к достоверному снижению чувствительности к Ca2+ [208] .

В то же время данные о влиянии фосфорилирования cТнI на скорость образования актомиозинового комплекса и силу сокращения кардиомиоцитов противоречивы. В работах, проведенных на препа­ ратах скинированных миофибрилл мыши и свиньи, было отмечено, что PKA­зависимое фосфорилирование ТнI усиливает скорость образования актомиозинового комплекса, а также скорость и силу сокращения кардиомиоцитов [206, 207]. Аналогичные результаты были получены в экспериментах с препаратами скинированных вентрикулярных миоцитов крысы [201]. Однако в другом исследо­ вании, проводившемся на препаратах скинированных трабекул и миоцитов крысы, не было отмечено изменений в Ca2+­активируемой изометрической скорости образования актомиозинового комплекса под воздействием PKA [217]. Также не было найдено достоверного изменения в скорости образования актомизинового комплекса и в силе сокращения миоцитов трансгенных мышей, у которых S23 и S24 были заменены на аспартаты [208, 216]. В работах Stelzer et al [218] и Chen et al [219] было показано, что зависимое от протеинкиназы А ускорение образования актомиозиновых комплексов происходит не из­за фосфорилирования ТнI, а благодаря фосфорилированию cMyBP­C .

Фосфорилирование тропонина I PKA может играть важную роль в развитии патологий сердца. Установлено, что у больных с терми­ нальными стадиями сердечной миопатии чувствительность к Ca2+ повышена по сравнению со здоровыми донорами [184]. Также было отмечено значительное снижение уровня фосфорилирования ТнI по остаткам S23 и S24 у больных с сердечной недостаточностью и кардиомиопатией [183, 185, 220]. Однако на данный момент не понятно, являются ли различия в фосфорилировании причиной или следствием развития сердечных заболеваний .

ПРОТЕИНКИНАЗА С

Обобщенное наименование «протеинкиназа С» (PKC) подразумевает обозначение большого семейства серин/треониновых киназ. Данное семейство состоит из трех подсемейств: «традиционных» (conven­ tional) киназ (изоформы PKC, 1, 2 и ), «новых» (novel) киназ (изоформы PKC,, и ), а также «атипичных» (atypical) киназ (PKC и \), различающихся по структуре доменов, отвечающих за внутриклеточную локализацию белка на мембране [221]. В кар­ Тропониновый комплекс сердца человека. Структура и функции 177 диомиоцитах взрослого человека экспрессируются, 1, 2,, изоформы PKC [221, 222]. В исследованиях было установлено, что данные изоформы взаимодействуют со многими белками, участвую­ щими в регуляции сердечного сокращения, в том числе с ТнI [223], ТнТ [224], MyBP­C [225] и титином [226] .

В экспериментах in vitro было показано, что основными амино­ кислотными остатками, по которым идет фосфорилирование чсТнI данным семейством киназ, являются остатки S23, S24 [186–188], S42, S44, T143 [189] (последовательность чсТнI)). При этом разные изо­ формы данной протеинкиназы обладают различной специфичностью по отношению к белку. C использованием сердечной изоформы ТнI быка было показано, что PKC фосфорилирует преимущественно аминокислотные остатки S42, S44, а протеинкиназа PKC – S23, S24 [186]. В исследованиях, проведенных на сердечной изоформе ТнI мыши, было показано, что PKC и PKC фосфорилируют остатки S23, S24 и T144 (T143 последовательности чсТнI), но не S42, S44 [188]. В то же время в другом исследовании отмечено, что при фос­ форилировании ТнI in vitro, предпочтительным участком фосфори­ лирования PKC является S44 [227]. В экспериментах с кардиомио­ цитами крысы in vitro было показано, что «атипичная» изоформа PKC, экспрессия которой была определена в кардиомицитах крыс [228], фосфорилирует исключительно остаток T143 [229] .

Данные о влиянии фосфорилирования чсТнI протеинкиназой С на функционирование тропонинового комплекса во многом противо­ речивы. В целом, физиологический эффект фосфорилирования PKC противоположен эффекту РКА [230]. Замена S23 и S24 (участки фосфорилирования PKA) у мышей на остатки аспарагиновой кислоты приводила к увеличению скорости расслабления и мышечного сокра­ щения при нагрузке. В то же время одновременное мутирование S23D, S24D и S43D, S45D, T144D (остатки, фосфорилируемые PKC, гомологичны, соответственно, S42, S44 и T143 чсТнТ) нивелировали этот эффект [231]. Миоциты трансгенных мышей, у которых в сердеч ной изоформе тропонина S43 и S45 были заменены на нефосфорилируемые аланины, обладали, по сравнению с клетками мышей дикого типа, повышенной способностью к контрактуре, вызванной ишемией [232]. При замене остатков S43, S45 и T144 на глутаминовую кислоту, что имитирует фосфорилирование, у транс­ генных мышей было отмечено снижение активных сокращений и замедленное расслабление сердечной мышцы, сниженный ответ на ­адренергическую стимуляцию, снижение максимальной силы сокращения без изменения в чувствительности к Ca2+ [233]. Однако в работе, проведенной на скинированных миоцитах мыши, в которых 178 И.А.Катруха нативный тропонин I был заменен на аналогичные мутанты, отмеча­ лось как снижение скорости мышечного сокращения, так и снижение чувствительности к Ca2+ [234]. Аналогичные результаты (снижение максимальной Ca2+­активируемой силы сокращения, АТФазной активности и чувствительности к концентрации Ca2+) были получены при исследовании in vitro реконструированного тонкого филамента, содержащего мутантный чсТнI [235] .

Функционирование PKC может иметь важное значение при раз­ витии патологических состояний сердечной мышцы. Экспрессия PKC и PKC была повышена у крыс со спонтанно возникающей гипертензией, при этом уровень экспрессии PKA и PKC оставался неизменным, а уровень PKC снижался. У этих модельных животных также было отмечено увеличение уровня фосфорилирования ТнI по остаткам S23, S24, S42 и S44 (последовательность ТнI крысы) [236]. В другом исследовании [225] было установлено, что PKC и PKC­зависимое фосфорилирование чсТнI в миоцитах больных с дилатационной кардиомиопатией приводит к снижению чувстви­ тельности микрофиламента к Ca2+, не оказывая влияния на макси­ мальную силу сокращения. Высказывается предположение, что PKC­опосредованное снижение активности сокращения может иметь компенсаторный эффект, предохраняя кардиомиоциты от истощения в условиях повышенной кальциевой нагрузки [237] .

ДРУГИЕ ПРОТЕИНКИНАЗЫ

В экспериментах in vitro было показано, что сердечная изоформа ТнI может подвергаться фосфорилированию протеинкиназой D [238, 239] и сGMP­зависимой протеинкиназой (PKG) [240] по остаткам S23, S24, p21­активируемой киназой 3 (PAK3) (по остатку S150) [190, 191], протеинкиназой Mst­1 (преимущественно по остатку T31, но также по остаткам, T51, T129, T143) [192], АМФ­зависимой киназой (AMPK) (по остатку S150) [193, 194] (рис. 6 Б) .

Фосфорилирование тропонина I также изучалось in vivo с исполь­ зованием масс­спектрометрического анализа аффинно выделенного из образцов сердечной ткани тропонинового комплекса. С использо­ ванием данного метода помимо описанных выше аминокислотных остатков было показано фосфорилирование остатков S4, S5, Y25, S76, T77, S166, T180, S198 (нумерация приведена без учета первого метионина) тропонина I, выделенного из образцов миокарда здоровых доноров, а также больных с ишемической болезнью сердца и дилата­ ционной миопатией [61, 183]. Однако, в других исследованиях, проведенных с использованием данного метода, были получены Тропониновый комплекс сердца человека. Структура и функции 179 противоречивые результаты. Так, тропонин I, аффинно выделенный из сердец мышей [241] и крыс [210], был фосфорилирован только по остаткам S23 и S24. Аналогичные данные были получены и при исследовании тропонина, выделенного из образцов сердечной ткани здоровых доноров [184, 185] и у больных с дилатационной или ишемической миопатией [185] .

Фосфорилирование чсТнI протеинкиназой А имеет важное физиологическое значение, снижая чувствительность тропонинового к ионам Ca2+ и ускоряя расслабление сердечной мышцы. Данные о физиологических эффектах фосфорилирования тропонина I другими протеинкиназами получены преимущественно в экспериментах in vitro или с использованием различных моделей трансгенных живот­ ных. Результаты, полученные в работах, посвященных роли PKC и других протеинкиназ в фосфорилировании ТнI сердца человека, противоречивы, что говорит о необходимости проведения дальней­ ших исследований в этом направлении in vivo .

ПОСТТРАНСЛЯЦИОННЫЕ МОДИФИКАЦИИ ТРОПОНИНА T

Фосфорилирование чсТнТ В экспериментах in vitro было установлено, что чсТнТ, как и ТнI, может подвергаться фосфорилированию несколькими протеин­ киназами. Так, на различных моделях было показано, что ТнТ может быть фосфорилирован тропонин Т киназой по остатку S2 [242–244], регулирующей сигналы апоптоза киназой­1 (ASK­1) по остаткам T194 и S198 [245], Rho­A­зависимой протеинкиназой (ROCK­II) по остаткам S275 и T284 [246], киназой Raf­1 по остатку T203 чсТнТ [247] (рис. 6 Б). В экспериментах с сердцем быка было показано, что в отличие от ТнI, сердечная изоформа ТнТ не подвергается фосфорилированию PKA [248, 249]. Наиболее изучен­ ными протеинкиназами, фосфорилирующими чсТнT, являются про­ теинкиназы семейства PKС [248–250]. В экспериментах in vitro, проведенных на миоцитах крысы, было установлено, что основными изоформами, способными фосфорилировать cТнТ являются PKC,, и [229]. Также in vitro было показано, что фосфорилирование сердечной изоформы ТнТ быка PKC проходит по аминокислотным остаткам T190, S194, T199 и T280 (гомологичны, соответственно, T194, S198, T203 и T284 чсТнТ) [189, 251, 252]. Фосфорилирование ТнТ PKC ингибирует Ca2+­зависимую активацию тонкого филамента и снижает максимально возможное усилие, развиваемое кардиомио­ цитами [251, 253, 254] .

180 И.А.Катруха Согласно данным, полученным in vitro, чсТнТ может подвергаться фосфорилированию по различным аминокислотным остаткам .

Однако масс­спектрометрический анализ фосфорилирования ТнТ, аффинно выделенного из сердечной мышцы крысы [210], мыши и человека [255], показал, что in vivo фосфорилирование данного белка происходит только по одному аминокислотному остатку, а именно по – S2. Эти данные подтверждают первые результаты исследования фосфорилирования сердечного тропонина T быка [256], в которых S2 также был единственным идентифицированным аминокислотным остатком, подвергающимся фосфорилированию. Этот аминокислот­ ный остаток фосфорилируется тропонин Т киназой [242], и при этом степень фосфорилирования тропонина Т по этому остатку очень высока [210, 255, 256]. Физиологическая роль данной модификации не совсем ясна, так как было показано, что фосфорилирование S2 не оказывает влияния на чувствительность к Ca2+ и образование акто­ миозинового комплекса [41] .

Дефосфорилирование ТнI и ТнТ Несмотря на то, что дефосфорилирование белков, участвующих в функционировании сердечной мускулатуры, имеет не менее важное регуляторное значение, чем их фосфорилирование [257–259], роль фосфатаз в модуляции активности тропонинового комплекса исследо­ вана крайне поверхностно. В дефосфорилировании ТнI и ТнТ участ­ вуют протеинфосфатазы 1 и 2A (PP1 и PP2A) [260–263]. Эти широко распространенные фосфатазы [264] принимают участие в регуляции множества биологических процессов, включая клеточное деление, синтез белков, углеводный метаболизм и мышечное сокращение [265, 266]. Можно надеяться, что дальнейшие исследования прольют свет на роль фосфатаз в регуляции функционирования тропонино­ вого комплекса .

Ограниченный протеолиз ТнТ Одним из недавно описанных механизмов адаптации сердечной мышцы является ограниченный протеолиз ТнТ. Протеолиз N­конце­ вой части (остатки 1–71) сердечной изоформы ТнТ был выявлен в миоцитах мышей и крыс после проведения экспериментальной ишемии­реперфузии и при повышении давления [267, 268]. Протео­ литический фрагмент ТнТ также был обнаружен в модельных экспе­ риментах, симулирующих перегрузку кальцием [269]. Было показано, что отщепление остатков 1–71 ТнТ происходит под действием каль­ Тропониновый комплекс сердца человека. Структура и функции 181 паина­1 (­кальпаин) [267] .

Протеолиз N­концевой части сердечной изоформы ТнТ приводит к изменению конформации центральной и С­концевой части молекулы белка и к снижению сродства ТнТ к ТнI, ТнС и тропомиозину [100, 267]. В ex vivo исследованиях сердец трансгенных мышей, экспрес­ сирующих укороченную сердечную изоформу ТнТ (остатки 72–291 тропонина Т мыши), было показано, что указанная замена не приводит к гипертрофии сердечной мышцы и снижению сердечной активности [100]. При этом сердца, в которых экспрессировался мутантный белок, оказались более устойчивы к нагрузкам под давлением, что позволило выдвинуть гипотезу о том, что протеолиз N­концевой части cТнТ является одним из способов компенсаторной адаптации миокарда к возникновению ишемического стресса [268] .

VI. ТРОПОНИНОВЫЙ КОМПЛЕКС

И ЗАБОЛЕВАНИЯ СЕРДЦА

ТРОПОНИНОВЫЙ КОМПЛЕКС

И ТЕРАПИЯ СЕРДЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ

Являясь одним из ключевых белков­регуляторов сердечного сокра­ щения, тропониновый комплекс играет важную роль в терапии сер­ дечной недостаточности – патологического состояния, при котором сердце не способно прокачивать необходимый организму объем крови. Одной из причин возникновения данной патологии является снижение чувствительности сердечной мышцы к ионам Ca2+, что приводит к уменьшению силы сокращения и систолической функции сердца. Как было показано выше, ключевую роль в чувствительности сердечной мышцы к Ca2+ играет тропониновый комплекс (в особен­ ности взаимодействия между чсТнI и ТнС, а также сродство ТнС к Ca2+). На данный момент известен ряд веществ, которые, взаимо­ действуя с компонентами тропонинового комплекса, усиливают чувствительность тонкого филамента к кальцию. К таким агентам относятся бепридил, левосимендан, EMD 57033 и другие [270, 271] .

В работах, посвященных исследованиям действия этих веществ, были продемонстрированы различные пути усиления чувствительности кардиомиоцитов к Ca2+. Методами рентгеноструктурного анализа [272] и ЯМР [273, 274] было показано, что терапевтическое действие бепридила и левосимендана реализуется через непосредственное взаимодействие этих фармакологических соединений с гидрофобным участком на поверхности N­концевого домена тропонина С. Данные взаимодействия приводят к стабилизации открытой конформации 182 И.А.Катруха ТнС, т.е. вызывают эффект аналогичный действию, производимому ингибиторным доменом чсТнI [274]. В результате наблюдается снижение скорости диссоциации Са2+ из второй EF­руки сердечной изоформы ТнС, что увеличивает чувствительность тонкого филамента к кальцию. В отличие от описанных выше лекарственных средств, EMD 57033 взаимодействует с С­концевым доменом ТнС [275, 276], нарушая его взаимодействия с остатками 34–71 чсТнI [277]. Пред­ полагается, что данные взаимодействия также приводят к усилению взаимодействия ингибиторного домена ТнI с ТнС [270] .

Одним из преимуществ агентов, оказывающих влияние на чувст­ вительность тропонинового комплекса к Ca2+, является отсутствие повышения внутриклеточного уровня Ca2+ [278], наблюдаемое при терапии такими кардиотоническими агентами, как кардиотонические стероиды, катехоламины, ингибитор фосфодиэстеразы цАМФ третьего типа [279]. Данное свойство лекарств, взаимодействующих с ТнС, снижает риск возникновения побочных эффектов, связанных с повышенной кальциевой нагрузкой [270, 279]. Таким образом, соз­ дание лекарственных средств, модулирующих чувствительность тон­ кого филамента к кальцию, является перспективным направлением терапии сердечной недостаточности .

ТРОПОНИНОВЫЙ КОМПЛЕКС И КАРДИОМИОПАТИЯ

Одним из достаточно распространенных заболеваний сердца является кардиомиопатия, патология, связанная с изменениями в структуре миокарда и/или развитием систолической или диастолической дис­ функции в отсутствие врожденного порока сердца, артериальной гипер­ тензии, патологий клапанов и коронарных артерий [280]. Согласно сов ременной классификации Европейского кардиологического общества, выделяют пять типов кардиомиопатии: гипертрофическую кардиомиопатию (HCM), дилатационную кардиомиопатию (DCM), рестриктивную кардиомиопатию (RCM), аритмогенную кардиомио­ патию правого желудочка и кардиомиопатию неизвестной природы [280]. Данные заболевания связаны с повышенным риском развития сердечной недостаточности, инфаркта миокарда, высокой смерт­ ностью, и являются главной причиной смерти от внезапной остановки сердца [281–283] .

На данный момент идентифицировано более 90 мутаций компо­ нентов тропонинового комплекса, связанных с HCM, DCM и RCM [284–287]. В их число входят точечные мутации ТнТ, ТнI и ТнС, связанные с заменой или делецией одиночного аминокислотного остатка [288–290], мутации, связанные со сдвигом рамки считывания Тропониновый комплекс сердца человека. Структура и функции 183 ТнС [287], а также делецией С­концевой части молекулы чсТнТ и ее заменой на 7 незначащих аминокислотных остатков [291]. Физиоло­ гическая роль мутаций генов различных компонентов тропонинового комплекса отличается в зависимости от типа кардиомиопатии. Мута­ ции, ассоциированные с HCM и RCM, в основном приводят к повы­ шению чувствительности миофиламента к концентрации Ca2+, в то время как мутации, связанные с DCM, наоборот, в основном снижают Ca2+­ чувствительность миофиламента [284] .

ТРОПОНИНОВЫЙ КОМПЛЕКС

И ДИАГНОСТИКА ИНФАРКТА МИОКАРДА

Как говорилось выше, в сердечной мышце взрослого человека тропо­ нины I и Т представлены уникальными изоформами, которые не экспрессируются в других тканях. Эта особенность позволяет исполь­ зовать оба этих белка в качестве высокоспецифичных маркеров гибели клеток сердечной мышцы. Наиболее распространенной причиной массовой гибели кардиомиоцитов является инфаркт миокарда, возни­ кающий в результате продолжительной ишемии участка сердечной мышцы. Из мертвых кардиомиоцитов внутриклеточные белки попа­ дают в кровоток и там могут быть обнаружены с использованием иммунохимических методов .

Впервые использование тропонина I, а затем и тропонина Т в качестве белков­маркеров инфаркта миокарда было предложено более 20 лет назад [292, 293]. С тех пор диагностические системы, основан­ ные на иммунохимическом определении концентрации тропонинов I и Т в крови больного, оттеснили на второй план традиционные методы диагностики инфаркта. Высокая специфичность и чувствительность методов, основанных на детекции тропонинов, стала причиной того, что с 2007 г., согласно рекомендациям ведущих кардиологических ассоциаций Европы и США, определение концентрации этих белков в крови стало одним из основных критериев постановки диагноза «инфаркт миокарда» [294–296]. Современные диагностические системы позволяют достоверно определить инфаркт уже через 3–6 часов после начала приступа [296]. Следует надеяться, что исполь­ зование новых, более чувствительных диагностических систем, появление которых ожидается в ближайшее время, позволит сокра­ тить время постановки диагноза до 2–3 часов [297–299]. К сожа­ лению, ограниченный объем данного обзора не позволяет более подробно рассмотреть основные особенности применения тропо­ нинов в диагностике, однако заинтересованный читатель может полу­ чить более полную информацию по данному вопросу в следующих обзорных статьях [300–303] .

184 И.А.Катруха

VI. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Тропониновый комплекс является уникальным механизмом, позво­ ляю щим при помощи различных биохимических воздействий осуществлять тонкую регуляцию сократительной активности сердца .

Важнейшую роль в такой регуляции играют посттрансляционные модификации компонентов тропонинового комплекса. Несмотря на длительную историю изучения, многие свойства тропонина остаются не до конца понятны. Можно надеяться, что дальнейшие исследования прольют свет на неизвестные особенности функцио­ нирования и регуляцию работы тропонинового комплекса. Это позволит более точно понять его роль в регуляции сокращения сердеч­ ной мускулатуры, а также разработать более совершенные подходы в диагностике и терапии патологий сердечно­сосудистой системы .

Автор выражает благодарность А.Е. Когану и А.В. Вылегжаниной за помощь в подготовке данной работы .

–  –  –






Похожие работы:

«Муниципальное бюджетное дошкольное образовательное учреждение Детский сад № 24 "Белочка"УТВЕРЖДАЮ: Заведующая МБДОУ Детский сад № 24 "Белочка" /Демихова И.В./ Приказ №_ от " "2017г Дополнительная общеразвивающая программа для детей дошкольного возраста "Юный эколог" Возраст обучающихся: 4-7 лет...»

«Щепотина Елена Георгиевна Полиморфизм генов цитохромов Р450 подсемейства 3А, прегнанового Х рецептора и вариабельность активности CYP3A 03.00.04 биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск – 2008 Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте м...»

«Фармацевтический рынок РОССИИ Выпуск: февраль 2015 розничный аудит фармацевтического рынка РФ – февраль 2015 события фармацевтического рынка – март 2015 Информация основана на данных розничного аудита фармацевтического рынка РФ DSM Group, система менеджмента качества которого соо...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ БЕЛОРУСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ Кафедра общей экологии и методики преподавания биологии Денисова Александра Сергеевна ОПТИМИЗАЦИЯ ПОДРАЩИВАНИЯ ЛИЧИНОК ВЕСЛОНОСА В УСЛОВИЯХ ИНКУБАЦИОННОГО ЦЕХА СПУ "ИЗОБЕЛИНО" Дипломная работа Научный руко...»

«Никитина Лариса Валерьевна ВКЛАД НЕОДНОРОДНОСТИ БЕЛКОВ САРКОМЕРА В СОКРАТИТЕЛЬНУЮ ФУНКЦИЮ МИОКАРДА И ЕЕ РЕГУЛЯЦИЮ 03.03.01 физиология диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант д.б.н. С.Ю. Бершицкий Екатеринбург – 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ Введение..4 Глава 1...»

«Итоги XXI региональной научно-практической конференции "Творчество юных" (11-12 марта 2017 г.) № Номинация ФИО Школа Научный руководитель (победители, призеры, грамоты) 12 марта Секция "Биология" подсекция "Я познаю мир" Бегишева Арина 3 кл., ГБОУ Кольчугина Ольга Владимировна Победитель Сергеевна, Иванова Школа № 1194 Надежда В...»

«МАТУСОВСКАЯ Галина Геннадьевна ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ТВИТЧИНА ЗАПИРАТЕЛЬНЫХ МЫШЦ МОЛЛЮСКОВ С ФИБРИЛЛЯРНЫМ АКТИНОМ 03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Владивосток – 2008 Работа выполнена в лаборатории...»

«СЕКЦИЯ 9. ЗЕМЛЕУСТРОЙСТВО: НАУКА И ПРАКТИКА ПРОБЛЕМЫ МОНОГОРОДОВ В ЗЕМЛЕУСТРОЙСТВЕ НА ПРИМЕРЕ ГОРОДА ПРОКОПЬЕВСКА А.Е. Киселева Научный руководитель доцент Н.В. Кончакова Национальный исследовательский Томский политехнич...»

«Электронный архив УГЛТУ ЭКО-ПОТЕНЦИАЛ № 2 (14), 2016 22 БИОЛОГИЯ УДК 582.475:631.523 В.А. Драгавцев Агрофизический институт ФАНО, г. Санкт-Петербург О ВОЗМОЖНОСТИ БЫСТРОЙ ОЦЕНКИ АДАПТИВНОГО ПОЛИМОРФИЗМА В ЕСТЕСТВЕННЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ МОНОПОДИАЛЬНЫ...»

«Фармацевтический рынок РОССИИ Выпуск: ноябрь 2014 розничный аудит фармацевтического рынка РФ – ноябрь 2014 события фармацевтического рынка – декабрь 2014 Информация основана на данных розничного аудита фармацевтического рынка РФ DSM Group, система менеджмента качества которого соответствует требованиям ISO 9001:2008...»

«ВСЕРОССИЙСКИЙ КОНКУРС ЮНЫХ ИССЛЕДОВАТЕЛЕЙ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ ГБОУ СОШ "ОЦ" с. Богатое Муниципальный район Богатовский Самарская область Номинация: "Юные исследователи"БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ БОРЬБЫ С НАСЕКОМЫМИ ВРЕДИТЕЛЯМИ ПЛОДОВЫХ КУЛЬТУР (НА П...»

«Публикуется Альянсом по сохранению сайгака лето 2009 SAIGA NEWS выпуск 9 Издается на 6-ти языках для информационного обмена по вопросам экологии и охраны сайгака СОДЕРЖАНИЕ Россия присоединилась к Ме...»




 
2019 www.mash.dobrota.biz - «Бесплатная электронная библиотека - онлайн публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.