WWW.MASH.DOBROTA.BIZ
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - онлайн публикации
 

«ОЖЕГОВА Диана Сергеевна ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ ГЕНОВ ПОДВЕРЖЕННОСТИ ИНФЕКЦИОННЫМ ЗАБОЛЕВАНИЯМ ...»

На правах рукописи

ОЖЕГОВА

Диана Сергеевна

ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ ГЕНОВ

ПОДВЕРЖЕННОСТИ ИНФЕКЦИОННЫМ ЗАБОЛЕВАНИЯМ

03.00.15 – генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Томск – 2009

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении Высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет Росздрава» и в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте медицинской генетики Сибирского отделения РАМН, г. Томск академик РАМН,

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Пузырёв Валерий Павлович доктор медицинских наук

Официальные оппоненты:

Сазонов Алексей Эдуардович кандидат медицинских наук Масленников Аркадий Борисович

Ведущая организация:

Учреждение Российской Академии медицинских наук Научноисследовательский институт молекулярной биологии и биофизики СО РАМН

Защита состоится « » декабря 2009 года в час. мин. на заседании объединенного диссертационного совета ДМ 001.045.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук НИИ медицинской генетики СО РАМН по адресу: 634050, г. Томск, ул. Набережная р. Ушайки, д. 10



С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук НИИ медицинской генетики СО РАМН

Автореферат разослан «_____» _____________ 2009 года

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук Кучер А.Н .

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы:

Одной из проблем современной медицины является изучение механизмов возникновения и персистирования внутриклеточных бактериальных инфекций, вызванных Mycobacterium tuberculosis и Salmonella enteritidis [Воробьев, 2001; Ottenhoff, 2002; Schnappinger, 2006]. Несмотря на многочисленные исследования в области генетики инфекционных заболеваний, многие аспекты функционирования генов, определяющих развитие защитных реакций при внедрении патогенна, остаются до конца не установленными [Lpez-Maderuelo, 2003; Alcas, 2005] .

К настоящему времени получены данные, свидетельствующие о том, что, такие инфекционные заболевания, как туберкулез и сальмонеллез, с генетической точки зрения, являются полигенными [Hunter, 2000; Kaufmann, 2001; Qiao, 2003, Коненков, 2008]. Выявление спектра генов и их полиморфизмов, влияющих на риск развития туберкулеза и сальмонеллеза, заболеваний со схожими начальными этапами патогенеза, представляет особый интерес .

Имеющиеся на сегодняшний день данные о фенотипическом проявлении полиморфных вариантов генов носят противоречивый характер и не позволяют сделать однозначных выводов об их вкладе в развитие инфекционных заболеваний [Cookе, 2006; Malik, 2006]. Совместное использование молекулярно-генетических, эпидемиологических и биоинформационных подходов для оценки функциональной значимости полиморфных вариантов генов, позволяет обеспечить высокую воспроизводимость и точность полученных ассоциаций между генотипами и заболеванием .



В настоящее время существуют десятки биоинформационных ресурсов, которые позволяют проводить отбор генов-кандидатов и их полиморфных вариантов, влияющих на восприимчивость к инфекционным заболеваниям [Cartharius, 2003; Berezikov, 2005; Chorley, 2008]. Предполагаемый вклад однонуклеотидных полиморфных замен в изменение уровня экспрессии генов может быть оценен посредством использования специальных компьютерных программ: MatInspector, MATRIX SEARCH, SignalScan и др .

[GuhaThakurta, 2006] .

Важную роль в изучении функционирования генов, несущих в своей структуре SNPs с предполагаемым фенотипическим эффектом, и их вклада в развитие инфекционных заболеваний, играет экспрессионное профилирование [Bussemaker, 2001; Lazarus, 2005]. К настоящему времени разработан ряд экспериментальных моделей, представляющих собой культуры клеток человека, которые позволяют получить информацию об экспрессии изучаемых генов и уточнить многие патофизиологические процессы in vitro, происходящие при введении в культуру клеток бактериальных агентов [Пичугина, 2003; Cliff, 2004] .

Известно, что фенотипический эффект полиморфного варианта гена может зависеть от контекста, в котором он действуют, то есть от вида стимулятора, вводимого в культуру клеток. В связи с этим представляет интерес изучение влияния компонентов клеточной стенки M. tuberculosis и S .

еnteritidis, иммуномодуляторов IFN- и IL-4 и их комбинаций с микробными агентами на уровень экспрессии генов иммунного ответа в культурах мононуклеарных клеток человека .

Таким образом, исследование экспрессии генов, несущих полиморфные варианты различных регуляторных молекул, которые обеспечивают начальные этапы развития иммунного ответа, таких как ген интерферона гамма (IFNG), ген субъединицы 2 рецептора интерферона гамма (IFNGR2), ген трансдуктора и активатора транскрипции (STAT1), ген Toll–like рецептора 2 (TLR2) и ген моноцитарного хемотаксического протеина (МСР1) в условиях воздействия бактериальных компонентов на клетки иммунной системы человека является перспективным .

Цель исследования:

Изучить функциональную вариабельность генов МСР1, IFNG, TLR2, STAT1 и IFNGR2, вовлеченных в формирование подверженности инфекционным заболеваниям .

Задачи исследования:

1. Сформировать на основе биоинформационных данных панель потенциально функциональных однонуклеотидных полиморфизмов в промоторной и интронной областях генов МСР1, IFNG, TLR2, STAT1 и IFNGR2 .

2. Определить частоту однонуклеотидных полиморфизмов исследуемых генов у здоровых жителей г. Томска .

3. Оценить базальный и стимулированный различными факторами (неспецифический индуктор PHA, микробные продукты TDM и LPS, иммуномодуляторы IFN- и IL-4) уровень экспрессии генов в краткосрочных культурах мононуклеарных клеток периферической крови здоровых людей .

4. Провести анализ связи уровня экспрессии генов МСР1, IFNG, TLR2, STAT1 и IFNGR2 с их полиморфными вариантами .





Научная новизна:

Предложен алгоритм поиска функционально значимых полиморфизмов генов с помощью биоинформационных методов и последующего экспрессионного профилирования. Впервые изучена функциональная значимость полиморфизмов С-2508Т гена МСР1, T-1488C гена IFNG, G/T гена TLR2, A-1831C гена STAT1, G-1704del гена IFNGR2, влияющих на развитие и течение инфекционных заболеваний (туберкулеза и сальмонеллеза). Впервые получены данные о распределении частот аллелей полиморфного варианта rs56000463: TG в интронной области гена TLR2 в популяции европеоидов. Впервые установлено, что изученные варианты промоторных областей генов МСР1, IFNG и IFNGR2 являются функционально значимыми и влияют на уровень экспрессии генов .

Научно-практическая значимость:

Полученные данные об уровне экспрессии генов иммунного ответа в культурах мононуклеарных клеток крови здоровых людей при стимуляции их индукторами микробного и немикробного происхождения дополняют фундаментальные сведения о генетической компоненте запуска и реализации защитных механизмов клеток иммунной системы при инфицировании их M .

tuberculosis и S. enteritidis. Данные о функциональной значимости полиморфных вариантов промоторной области генов МСР1, IFNG и IFNGR2 могут служить основой для дальнейшего изучения их ассоциации с риском развития внутриклеточных инфекционных заболеваний. Основываясь на программе MatInspector, представлен алгоритм поиска полиморфизмов генов, влияющих на генную экспрессию, который может быть использован в дизайне исследований, направленных на установление функционально- и патогенетически значимых вариантов генов .

Положения, выносимые на защиту:

1. Полиморфные варианты С-2508Т гена МСР1, T-1488C гена IFNG, Gdel гена IFNGR2, выбранные с помощью биоинформационной программы MatInspector, являются функционально значимыми: уровень экспрессии генов по этим полиморфным вариантам существенно меняется в зависимости от генотипа .

2. У носителей одних и тех же генотипов по исследуемым полиморфизмам разные виды стимуляторов с неизменной концентрацией вызывали разные экспрессионные ответы в культурах клеток .

Гомозиготные генотипы -2508СС и -2508ТТ гена MCP1 обладают 3 .

протективной ролью в развитие туберкулеза и сальмонеллеза, так как ассоциированы с более высоким уровнем экспрессии гена по сравнению с гетерозиготами. Аллель -1488С гена IFNG играет протективную роль в развитии иммунита против M. tuberculosis, а аллель -1488Т развитии иммунного ответа при инфицировании S. еnteritidis .

Апробация работы:

Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на конференции «Генетика человека и патология» (Томск, 2007), VIII научном конгрессе молодых ученых «Науки о человеке» (Томск, 2007), XII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2007), на Ежегодной Европейской конференции по генетике человека (Барселона, 2008), семинаре по биоинформатике в ГОУ ВПО Сибирском государственном медицинском университете Росздрава (Томск, 2008), межлабораторных научных семинарах НИИ медицинской генетики СО РАМН (Томск, 2007, 2009), межлабораторном научном семинаре на базе Центральной научно-исследовательской лаборатории (Томск, 2008) .

Публикации:

По теме диссертации опубликовано 5 работ, в том числе 1 статья в рецензируемом журнале списка ВАК, 1 статья в сборнике, 2 тезисa в материалах отечественных конференций, 1 – в зарубежных .

Структура и объем диссертации:

Диссертационная работа изложена на 185 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и приложения. Данные проиллюстрированы 78 таблицами (72-в приложение), 23 рисунками. Библиографический указатель включает 143 источника, из них 16 работ отечественных авторов .

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материал исследования .

Для проведения исследования была сформирована выборка здоровых доноров, в количестве 91 человек, на базе лечебно-профилактических и научно-исследовательских учреждений г. Томска: областного туберкулезного диспансера (врачи, медсестры, обслуживающий персонал), МПУ поликлиники №2 (врачи, медсестры, обслуживающий персонал), Учреждение РАМН НИИ Фармакологии СО РАМН. Все обследованные были русские по национальности, 69 женщин (76%) и 22 мужчин (24%). Средний возраст пациентов составил 34,4±7,45 года. Условием включения в выборку было отсутствие ранее перенесенных заболеваний туберкулеза, сальмонеллеза и вирусного гепатита. В исследование были включены только индивидуумы, подписавшие добровольное информированное согласие .

В работе был последовательно использован комплекс методических подходов: биоинформационных, молекулярно-генетических, культуральных и методы экспрессионного анализа .

Биоинформационные программы для поиска и оценки фенотипической значимости SNPs .

Поиск однонуклеотидных полиморфных замен (SNPs) с предполагаемым фенотипическим эффектом в промоторных и интронных областях исследуемых генов с помощью методов биоинформатики был осуществлен по алгоритму, представленному на рис. 1 Было проанализировано 31 SNPs, из них выбрано пять SNPs: rs1024611, rs2069705, rs4853455, rs17880053 и rs56000463 .

Молекулярно-генетические методы исследования .

Выделение ДНК проводили из венозной крови стандартным методом с использованием фенол-хлороформной очистки. Анализ генетического полиморфизма осуществляли с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), используя структуру праймеров и параметры температурных циклов, полученных с помощью программы VectorNTI, с последующим анализом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Всего исследовано 5 полиморфных вариантов 5 кандидатных генов подверженности туберкулезу и сальмонеллезу (табл. 1) .

Информация, полученная из баз данных:

- ID SNP

- локализация в гене

- MAF (минимальная аллельная частота)

–  –  –

Информация, полученная из SNPselector:

- позиция на хромосоме

- функция (роль)

- MAF для африканской, азиатской популяций и европеоидов

- регуляторный потенциал (от 0 до 1, Regulatory_score) Количество первоначально отобранных SNPs сохранено, информация о них структурирована и дополнена Посредством FASTSNP проведена приоризация (оценка фенотипического риска или значимости)

Условие включения SNPs в выборку: Условие исключения SNPs из выборки:

- Фенотипический риск равный 3-4 - Фенотипический риск равный 0-2

–  –  –

С помощью MatInspector оценивали изменение количества сайтов связывания для факторов транскрипции, содержащих анализируемые SNPs, и значение коэффициента Matrix similarity

–  –  –

Культивирование мононуклеарных клеток венозной крови .

На следующем этапе работы была сформирована группа (n=14), которая представляла разнообразные аллельные сочетания каждого из исследуемых генов. У выбранных индивидуумов осуществлялся повторный забор венозной крови, проводилось выделение мононуклеарных клеток крови путем центрифугирования и их культивирование с индукторами микробной и не микробной природы: PHA (фитогемагглютинин, 10 мкг/мл), TDM (трехалозе 6,6'-димиколат компонент клеточной стенки М. tuberculosis, 100 нг/мл), LPS (липополисахарид, компонент клеточной стенки S. enteritidis, 100 нг/мл), IFNg (100 нг/мл), IL-4 (20 нг/мл), и их комбинации. Затем осуществляли выделение мРНК, с использованием набора TRI-Reagent (Mrcgene), из культур клеток и венозной крови индивидуумов (контроль) .

Для получения кДНК из мРНК для каждого образца проводили реакцию обратной транскрипции .

Анализ уровня экспрессии генов .

Полимеразная цепная реакция (RT-PCR) в реальном времени и учет уровня экспрессии каждого исследуемого гена в 126 культурах мононуклеарных клеток, осуществлялись на завершающем этапе работы. Для каждого исследуемого образца реакцию RT-PCR проводили в трех повторах одновременно. Кроме исследуемых генов, оценивали уровень экспрессии GAPDH гена «домашнего хозяйства» (gliceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase). Образцы изучаемого гена и гена GAPDH ставили в одном планшете – для достижения одного и того же уровня эффективности амплификации гена мишени и эндогенного контроля .

Статистическая обработка данных Были проведены: проверка частот генотипов на соответствие ожидаемым при равновесии Харди-Вайнберга, оценки частот аллелей и генотипов исследуемых генов у здоровых жителей г. Томска. Расчет среднего арифметического значений n-кратных различий между уровнем экспрессии РНК специфического гена в стимулированных и не стимулированных культурах осуществляли с использованием сравнительного Ct метода [руководство Applied Biosystems]. Оценивали изменение уровня экспрессии исследуемых генов в зависимости от генотипа по выбранным полиморфным вариантам. Статистически значимыми считали различия при p0,05 и меньше. Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием программы «Statistica 6.0.» .

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование включало три этапа. Первый – выбор функционально значимых SNPs и проверка с помощью комплекса компьютерных программ .

На втором этапе – изучены изменения уровня экспрессии генов MCP1, IFNG, TLR2, STAT1, IFNGR2 в культурах мононуклеарных клеток крови здоровых людей при стимуляции PHA, TDM, LPS, IFN-, IL-4, и их комбинациями. В третьем сравнивали уровни экспрессии генов в культурах клеток носителей различных генотипов по выбранным полиморфным вариантам генов .

Поиск функционально значимых SNPs с помощью биоинформационных ресурсов Поиск и оценку SNPs с предполагаемым фенотипическим эффектом осуществляли по алгоритму представленному в части Материал и методы. На заключительном этапе биоинформационной части работы была использована компьютерная программа MatInspector. Программа позволяла оценивать влияние полиморфизмов, выбранных с помощью различных баз данных и биоинформационных комплексов SNPselector и FASTSNP, на структуру и количество сайтов связывания для факторов транскрипции в промоторных и интронных областях генов иммунного ответа. Для дальнейшего анализа были выбраны следующие полиморфные варианты: rs1024611 гена МСР1, rs2069705 гена IFNG, rs56000463 гена TLR2, rs4853455 гена STAT1 и rs17880053 гена IFNGR2 .

Оценка уровня экспрессии генов MCP1, IFNG, TLR2, STAT1, IFNGR2 при стимуляции PHA, TDM, LPS, IFNg, IL-4 и их комбинациями В культурах мононуклеарных клеток крови стимулированных PHA, TDM, LPS, IFNg, IL-4, и их комбинациями TDM+IL-4, TDM+IFNg, LPS+IL-4, LPS+IFNg была изучена экспрессия генов MCP1, IFNG, TLR2, STAT1, IFNGR2 (табл. 2) и GAPDH. С помощью сравнительного Ct метод уровень экспрессии специфических генов сначала нормализовали относительно количества мРНК гена домашнего хозяйства GAPDH, а затем уровень экспрессии генов в стимулированных клеточных культурах нормализовали относительно соответствующих показателей из не стимулированных культур (контроль). Результаты представлены как n-кратные различия между количеством мРНК специфического гена в стимулированных и не стимулированных культурах и ошибкой среднего для каждой группы. Для гена GAPDH значение Ct в группах варьировало от 26,65 до 31,25 .

Достоверных отличий в уровне экспрессии гена GAPDH между стимулированными и не стимулированными культурами обнаружено не было .

Для генов MCP1, IFNG, TLR2 наблюдалось увеличение уровня экспрессии по сравнению с не стимулированной культурой. Уровень экспрессии гена МСР1 в исследуемых группах был повышен в два и более раза в клеточных культурах стимулированных всеми видами индукторов, а наибольший уровень экспрессии был отмечен при использовании индуктора LPS (4,95±2,50) (рис. 2) .

Таблица 2 N-кратные различия уровня экспрессии генов МСР-1, IFNG, TLR2, STAT1, IFNGR2 при стимуляции PHA, TDM, LPS, IFNg, IL-4, и их комбинациями по сравнению с не стимулированными культурами Стимуляторы Гены МСР1 IFNG TLR2 STAT1 IFNGR2 TDM 2,66±1,92 1,25±1,03 1,11±0,98 0,65±0,49 0,74±0,51 LPS 4,95±2,50 2,26±1,74 1,65±1,47 1,00±0,65 0,36±0,43 IFN- 3,54±2,88 1,34±0,98 1,02±1,10 0,83±0,70 0,53±0,57 IL-4 3,23±2,44 2,46±1,51 1,20±1,16 0,69±0,43 0,63±0,94 TDM+IFN- 4,11±2,33 1,39±1,20 1,91±1,74 0,68±0,54 0,40±0,56 TDM+IL-4 3,99±2,21 2,34±1,80 2,04±1,76 0,72±0,71 0,53±0,72 LPS+IFN- 3,41±2,49 1,63±1,34 1,38±0,96 0,64±0,42 0,48±0,65 LPS+IL-4 3,22±2,67 1,78±1,40 1,31±0,83 0,87±0,63 0,66±0,68 PHA 2,46±2,18 2,30±1,45 1,04±0,80 0,70±0,63 0,38±0,44 Примечание. Представлены средние значения и ошибка средней показателя 2-Ст, характеризующего кратность изменения уровня экспрессии генов в стимулированных культурах по сравнению с не стимулированными .

Стимулирующее влияние IL-4 на продукцию МСР1 (3,23±2,44), показанное в данном исследовании, доказано в работе И.C. Фрейдлин (2005) .

Установленное индуцирующее влияние IFN- на экспрессию гена МСР1 (3,54±2,88) подтверждают данные литературы: в культуре кератиноцитов после стимуляции IFN- наблюдалось увеличение уровня экспрессии мРНК гена МСР1 и секреция его белкового продукта [Белова, 2008] .

Наиболее выраженное повышение уровня экспрессии гена IFNG наблюдалось при стимуляции бактериальным продуктом LPS (2,26±1,74), индуктором иммунного ответа IL-4 (2,46±1,51), PHA (2,30±1,45) и комбинацией TDM+IL-4 (2,34±1,80) (табл. 2, рис. 2). Стимулирующее влияние PHA на экспрессию гена IFNG подтверждают работы отечественных и зарубежных исследователей [Lang, 1998; Fan, 1998; Пичугина, 2003] .

Активирующее воздействие антигенов сальмонеллы на продукцию IFNпоказано в работе Воробьева А.A. (2001). В данном исследование был использован LPS-компонент клеточной стенки S. еnteritidis .

Обнаружено повышение уровня экспрессии генов провосполительных цитокинов МСР1 и IFNG при введении в культуру клеток противовоспалительного цитокина IL-4 или его комбинаций с микробными продуктами TDM и LPS (рис. 2). IL-4 рассматривают как цитокин противовоспалительного действия [Ohmori, 1994; Levings, 1999; Zhou, 1994], супрессирующего генную экспрессию провосполительных цитокинов в ответ на стимуляцию LPS и IFN-. Однако имеется ряд исследований, обнаруживших, что стимуляция IL-4 in vitro или in vivo ассоциирована с провосполительными ответами по I типу [Bell,1999; Fort, 2001], т.е. в некоторых случаях IL-4 может способствовать экспрессии генов провосполительных цитокинов. Данные литературы [Major, 2002] свидетельствуют о том, что IL-4 самостоятельно или в комбинации с LPS способен к потенциальной продукции провосполительных цитокинов .

–  –  –

Рис. 2. Уровень экспрессии генов МСР1, IFNG, TLR2, STAT1, IFNGR2 при стимуляции TDM, LPS, IFN-, IL-4, PHA, TDM+IFN-, TDM+IL-4, LPS+IFNLPS+IL-4. За единицу принят уровень экспрессии генов при отсутствии стимуляции. * - Уровень экспрессии генов достигший не менее двукратных изменений значений относительно базального уровня (контроль) .

Для гена TLR2 стимулирующее воздействие, в виде повышения уровня экспрессии до 2,04±1,76 (табл. 2, рис. 2), показано только при использовании комбинации TDM+IL-4. Активирующее действие компонента клеточной стенки M. tuberculosis LAM (микобактериальный гликолипидный липоарабиноманнан) на экспрессию молекул TLR2 на поверхности иммунокомпетентных клеток согласуются с данными литературы [Means, 1999] .

Для генов STAT1 и IFNGR2 отмечено снижение уровня экспрессии по сравнению с контролем. Уровень экспрессии гена STAT1 не достигал 2 – кратных изменений, поэтому эти результаты в дальнейший анализ не включались .

Уровень экспрессии гена IFNGR2 при стимуляции индукторами микробной природы LPS, TDM+IFN- и LPS+IFN-, а также не специфическим индуктором PHA снижался в 2 и более раза по сравнению с уровнем экспрессии в не стимулированной культуре (табл. 2, рис 2) .

Ингибирующее влияние микробных компонентов на экспрессию гена IFNGR2 было подтверждено в ряде исследований [Sakatsume, 1996; Stoiber, 1999; Hussain, 1999; Crespo, 2002; Fortune,2004; Regis, 2005] .

Сравнение уровней генной экспрессии в культурах клеток носителей различных генотипов по выбранным полиморфным вариантам С-2508Т гена МСР1, T-1488C гена IFNG, A-1831C гена STAT1, G/T гена TLR2, G-1704del гена IFNGR2 Анализ частот аллелей и генотипов исследуемых полиморфных вариантов проведен у 91 здоровых жителей г. Томска русской национальности (табл. 3). Во всех случаях частоты генотипов в исследованной группе соответствовали ожидаемым при РХВ .

–  –  –

Для выявления наличия ассоциации между полиморфными вариантами промоторной области и экспрессией соответствующих генов проведено сравнение уровней генетической экспрессии в культурах клеток у носителей различных генотипов по выбранным полиморфным вариантам .

Оценка средних значений уровня экспрессии гена МСР1 между генотипами выявила статистически значимые отличия в уровнях экспрессии при стимуляции LPS, IFN- и PHA (рис. 3). Самый высокий уровень экспрессии гена МСР1 выявлен при стимуляции индуктором LPS для генотипа -2508С/С (8,9±0,42, р0,007) относительно -2508Т/С (3,34±2,0) и Т/Т (5,0±0,88). При стимуляции культуры клеток IFN- наблюдали повышение уровня экспрессии гена MCP1 в зависимости от доли аллеля Т в генотипе обследуемых: 0,65±0,49 для генотипа -2508С/С, 2,05±0,29 для -2508Т/С и 6,5±1,97 для генотипа -2508Т/Т. При экспозиции клеток PHA (р0,05) уровень экспрессии гена МСР1 повышался более чем в четыре раза для генотипа -2508Т/Т (4,47±2,38) по сравнению с носителями других генотипов -2508Т/С (1,31±1,02) и -2508С/С (1,3±0,85) .



–  –  –

Рис. 3. Уровень экспрессии у носителей генотипов -2508С/С, -2508Т/С и Т/Т полиморфного варианта Т-2508C гена MCP1 при стимуляции LPS, IFN- и PHA Гомозиготные состояния генотипов -2508С/С и -2508Т/Т (6,3±2,14) по полиморфному варианту Т-2508C промоторной области гена MCP1 при индукции LPS коррелирует (р0,04) с более высоким уровнем экспрессии гена по сравнению с гетерозиготами (3,34±2,0) .

Уровень экспрессии гена MCP1 у носителей аллелей -2508С и -2508Т достоверно отличался при стимуляции индуктором LPS (р0,002), IFNр0,002) и PHA (р0,01). Стимуляция культур мононуклеарных клеток крови здоровых людей специфическим индуктором LPS сопровождается высокими значениями уровня экспрессии гена МСР1 у носителей аллеля С (8,9±0,42) по сравнению со значениями уровня экспрессии гена для обладателей аллеля -2508Т (4,08±1,75). Присутствие аллеля -2508Т в генотипах обследуемых приводило к повышению уровня экспрессии гена от 4,48±2,38 до 6,5±1,97 при индукции PHA и IFN- по сравнению с не стимулированной культурой соответственно. Соотнося эти данные с полученными ранее, можно предположить, что аллель -2508С гена MCP1 обладает протективной ролью в развитие инфекционных заболеваний в большей степени, чем аллель -2508Т .

Анализ средних значений n-кратных различий между уровнем экспрессии мРНК в стимулированных культурах для гена IFNG в группах, сформированных по генотипу, показал статистически значимые отличия при стимуляции LPS+IL-4, TDM+IFN- и LPS+IFN- (рис. 4). У лиц с генотипом

-1488Т/Т (3,0±1,53) при стимуляции культуры клеток LPS+IL-4 (р0,003) уровень экспрессии в 2,3 раза выше по сравнению с уровнем экспрессии, полученным для лиц с генотипом -1488Т/С (1,28±0,73) и в 4,0 раза выше, чем у носителей генотипа -1488С/С (0,75±0,74). При воздействии TDM+IFNр0,008) наблюдалось постепенное снижение уровня экспрессии гена в зависимости от дозы аллеля -1488С. Для генотипа -1488С/С уровень экспрессии составил 3,07±1,25, а для вариант -1488Т/С и -1488Т/Т – 1,08±0,88 и 0,76±0,47 соответственно. Уровень экспрессии гена IFNG при стимуляции комбинацией LPS+IFN- (р0,003) для гетерозигот -1488Т/С по изучаемому полиморфизму имел значение 0,57±0,40, что статистически значимо ниже уровня экспрессии гена для гомозигот -1488С/С в четыре раза (2,3±0,53) и для -1488Т/Т в 4,4 раза (2,48±1,62) .

–  –  –

Рис. 4. Уровень экспрессии у носителей генотипов -1488С/С, -1488Т/С и Т/Т полиморфного варианта Т-1488C гена IFNG при стимуляции TDM+IFN-, LPS+IFN-, LPS+IL-4 Анализ различий в уровне экспрессии гена IFNG в группах, сформированных по гомо- или гетерозиготному носительству выявил статистически значимые различия при стимуляции LPS+IFN- (р0,005) и TDM+IL-4 (р0,03). Гетерозиготное состояние генотипа -1488Т/С по полиморфному варианту Т-1488C промоторной области гена IFNG при индукции LPS+IFN- коррелирует с низким уровнем экспрессии гена (0,58±0,4), т.е. с отсутствием ответа на микробный продукт LPS, по сравнению с гомозиготами (2,41±1,26). При экспозиции культуры клеток TDM+IL-4 наблюдается обратная картина уровня экспрессии изучаемого гена у обладателей гомозигот и гетерозигот. Стимуляция культуры мононуклеарных клеток корд-фактором M. tuberculosis TDM в сочетании с IL-4 приводит к повышению уровня экспрессии гена IFN- у лиц гетерозиготных по полиморфному варианту Т-1488C в 3,5 раза (3,52±0,56) по сравнению с контролем, а у гомозиготных носителей только в 1,4 раза (1,46±0,36). Такое явление можно объяснить не одинаковым воздействием стимуляторов различного микробного происхождения на исследуемый полиморфный вариант гена IFNG .

Экспозиция культуры клеток индукторами различной природы характеризуется корреляцией уровня экспрессии исследуемого гена с дозой аллеля -1488Т при стимуляции LPS+IL-4, или с дозой аллеля -1488С при индукции комбинацией TDM+IFN- соответственно. Использование стимуляторов, полученных от двух филогенетически различных микроорганизмов, не вызывает однонаправленного экспрессионного ответа гена IFN- у носителей генотипов -1488Т/Т и -1488С/С .

Известно, что M. tuberculosis выживает в макрофагах с помощью ингибирования IFN--сигнала. Поскольку гетерозиготный генотип -1488Т/С характеризуется пониженным уровнем экспрессии гена IFNG по сравнению с контролем, можно сделать предположение, что в ответ на попадание M .

tuberculosis в организм человека замена цитозина на тимидин в позиции ТC в промоторной области изучаемого гена только в одной хромосоме будет способствовать синтезу IFN- в недостаточных количествах. Снижение уровня IFN- является одним из механизмов выживания микобактерий в макрофагах и их сопротивлению иммунной системе. Носителями генотипа Т/С по изучаемому полиморфизму является около 47% населения г .

Томска (табл. 3). Окончательные выводы о возможном вкладе полиморфного варианта Т-1488C промоторной области гена IFNG в возникновение и развитие иммунного ответа при инфицировании M. tuberculosis, можно будет сделать при проведении подобного эксперимента на культурах мононуклеарных клеток из венозной крови больных туберкулезом .

Оценка средних значений уровня экспрессии между генотипами полиморфного варианта A-1831C промоторной области гена STAT1 не показала статистически значимых различий в уровнях экспрессии при стимуляции TDM, LPS, IFN-, IL-4, PHA, TDM+IFN-, TDM+IL-4, LPS+IFNи LPS+IL-4 .

Оценка значений между генотипами полиморфизма G/T интронной области гена TLR2 выявила статистически значимые отличия в уровне экспрессии при стимуляции TDM (р0,01) (рис. 5). При стимуляции TDM уровень экспрессии гена TLR2 в культурах клеток лиц с генотипом G/T (2,21±1,23) был в 1,3 раза выше по сравнению с уровнем экспрессии, полученным для генотипа Т/Т (1,70±0,0) и в 3,2 раз выше, чем у носителей генотипа G/G (0,69±0,56). Активирующее влияние TDM на экспрессию изучаемого гена подтверждено в опубликованных исследованиях [Means, 1999]. Однако полученные данные не позволяют сделать однозначные выводы о влиянии полиморфного варианта rs56000463: TG интронной области на поведение гена TLR2 при воздействии компонентов клеточной стенки микобактерий в условиях in vitro .

Анализ средних суммы n-кратных различий между уровнем экспрессии мРНК в стимулированных культурах для гена IFNGR2 в группах, сформированных по генотипу, показал статистически значимые отличия (р0,005) при стимуляции TDM+IFN- (рис. 5). Уровень экспрессии гена IFNGR2 при стимуляции клеточных культур TDM+IFN- резко снижается у носителей генотипов -1704G/G (0,21±0,23) и -1704-/- (0,17±0,03), а уровень экспрессии гена у обладателей генотипа -1704G/- (1,21±0,27) приближается к значению контроля .

–  –  –

Рис. 5. Уровень экспрессии у носителей генотипов G/G, G/T и Т/Т полиморфного варианта rs56000463: TG интронной области гена TLR2 при стимуляции TDM и уровень экспрессии у носителей генотипов -1704G/G, G/- и -1704-/- при наличии делеции в положении G-1704del промоторной области гена IFNGR2 при стимуляции TDM+IFNУровень экспрессии гена IFNGR2 гомозиготных носителей делеции в положении -1704 статистически значимо (р0,02) ниже в 4,3 при индукции LPS+IFN- относительно уровня экспрессии гена обладателей гетерозиготных генотипов .

Присутствие делеции в позиции -1704 обследуемых приводило к статистически значимому (р0,03) снижению уровня экспрессии гена IFNGR2 при индукции TDM+IFN- до 0,17±0,16, что было в 4,8 раза ниже, чем уровень экспрессии гена для индивидуумов с аллелем -1704G (0,81±0,19). То есть присутствие делеции в позиции -1704 приводит к резкому снижению уровня экспрессии исследуемого гена при экспозиции с микробным антигеном .

Наиболее благоприятным сочетанием для индивидуумов при инфицировании микобактериями будет присутствие аллеля -1704G в гетерозиготном состоянии по полиморфному варианту -1704 G/промоторной области гена IFNGR2. Супрессирующее влияние TDM в присутствии иммунномодулятора IFN- на экспрессию изучаемого гена исследовано в ряде работ [Hussain, 1999; Fortune, 2004]. Полученные данные позволяют сделать предположение о том, что исследуемая делеция в позиции

-1704 промоторной области гена IFNGR2 обладает функциональной значимостью и оказывает влияние на риск возникновения туберкулеза, но не сальмонеллеза .

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Задачи проведенного исследования включали в себя формирование, посредством биоинформационных методов панели потенциально функциональных однонуклеотидных полиморфных вариантов в промоторной и интронной областях генов МСР1, IFNG, TLR2, STAT1 и IFNGR2 и оценку влияние полиморфизмов на экспрессию исследуемых генов в культурах мононуклеарных клеток крови при стимуляции их индукторами микробного и не микробного происхождения у здоровых русских жителей г. Томска .

С помощью биоинформационной программы Matinspector проведен анализ 26 полиморфизмов промоторной области генов МСР1, IFNG, STAT1, IFNGR2 и пяти SNPs интронной области гена TLR2, из которых для дальнейшего анализа выбрано только пять SNPs: rs1024611, rs2069705, rs4853455, rs17880053 и rs56000463. Остальные 21 SNPs при оценке их предполагаемого фенотипического эффекта, не вызывали изменений в качестве и количестве ССФТ регуляторного региона каждого из исследуемых генов. Идентифиция потенциальных сайтов связывания для факторов транскрипции в промоторных областях генов МСР1, IFNG, STAT1, IFNGR2 и в интронной области гена TLR2 позволила значительно сократить пространство поиска кандидантных SNPs, т.е. подойти к их выбору более целенаправленно .

Выявлено, что присутствие нуклеотида «С» в позиции Т-2508C гена MCP1 и в положении Т-1488C гена IFNG формирует сайты связывания для фактора транскрипции MyoD в гене MCP1 и для HNF1 в гене IFNG. С помощью базы данных IIG-TRRD показана непосредственная роль этих сайтов связывания для факторов транскрипции MyoD и HNF1 в осуществлении процессов транскрипции генов иммунного ответа. Возможно, что именно эти сайты связывания являются необходимыми для обеспечения функциональности, рассмотренных участков, промоторных регионов этих генов .

Анализ изменений уровня экспрессии генов МСР1, IFNG, TLR2, STAT1, IFNGR2 в культурах клеток стимулированных различными индукторами показал, что экспрессия исследуемых генов может быть, как индуцирована, так и супрессирована. Микробные продукты LPS и TDM, индукторы иммунного ответа IL-4 и IFN-, неспецифический индуктор PHA, а также комбинации TDM+IFN-, TDM+IL-4, LPS+IFN- и LPS+IL-4 индуцировали экспрессию генов МСР1, IFNG и TLR2, и снижали уровень экспрессии генов STAT1 и IFNGR2 .

Одна и та же доза стимулятора оказывала разное воздействие на экспрессию разных генов. Сравнение профилей генной экспрессии в исследуемых группах, показало, что это характерно для всех используемых индукторов. Также выявлено, что уровень экспрессии различных генов варьировал в зависимости от вида используемого стимулятора, т.е. оказался стимул-специфическим .

Уровень экспрессии гена МСР1 увеличивался в два и более раза в клеточных культурах стимулированных всеми видами индукторов. Индуктор LPS оказывал значительное стимулирующее воздействие на экспрессию гена МСР1, так как из всех опробованных стимуляторов он увеличивал уровень экспрессии этого гена более чем в 4,9 раза. Возможно, активирующее действие LPS на ген MCP1, объясняется наличием ARE (adenosine-uridinerich element) – элемента в пределах 3'-UTR мРНК, который играет значительную роль в осуществлении посттранскрипционных механизмов проведения сигнала LPS. LPS-сигнал стабилизировал мРНК, блокируя ее деградацию, что ведет к быстрому накоплению соответствующего белкового продукта .

Двух- и более кратное повышение экспрессии гена IFNG наблюдалось при стимуляции бактериальным продуктом LPS, индуктором иммунного ответа IL-4, PHA и комбинацией TDM+IL-4. Во всех остальных случаях уровень экспрессии этого гена не достигал порога регистрации значений .

Экспрессия гена TLR2 в культурах мононуклеарных клеток крови здоровых людей повышалась только при использовании комбинации TDM+IL-4. Стимуляция культур клеток индукторами микробного и не микробного происхождения приводила к снижению уровня экспрессии генов STAT1 и IFNGR2. Регистрируемое снижение экспрессии гена IFNGR2 наблюдалось при добавлении в культуры клеток не специфического индуктора PHA, микробного антигена LPS или LPS в сочетании с IFN- и компонента микобактериальной стенки TDM в комбинации с IFN- .

Анализ уровня экспрессии обладателей полиморфных вариантов генов МСР1, IFNG, TLR2, STAT1 и IFNGR2 в условиях стимуляции культур мононуклеарных клеток крови различными индукторами показал зависимость их от генотипа .

Гомозиготные состояния гена MCP1 -2508С/С и -2508Т/Т по полиморфному варианту Т-2508C при индукции LPS коррелировали с более высоким уровнем экспрессии гена по сравнению с гетерозиготами. Кроме того, стимуляция культур мононуклеарных клеток крови здоровых людей специфическим индуктором LPS сопровождалась высокими значениями уровня экспрессии гена МСР1 у носителей аллеля -2508С, а при индукции клеток модулятором иммунного ответа IFN- и PHA – у обладателей аллеля

-2508Т. Скорее всего, аллель -2508С гена MCP1 обладает протективной ролью в развитие инфекционных заболеваний в большей степени, чем аллель

-2508Т .

Для полиморфного варианта Т-1488C гена IFNG показана предположительная протективная роль аллеля -1488С, связанная с повышением уровня экспрессии гена, в развитии иммунита против M .

tuberculosis, и протективная роль аллеля -1488Т в развитии иммунного ответа при инфицировании S. enteritidis, при использовании соответствующих индукторов микробного происхождения. Гомозиготные состояния -1488Т/Т и

-1488СС исследуемого полиморфного варианта гена IFNG являлись более благоприятными для их носителей, чем гетерозиготное -1488Т/С .

Показано, что, возможно, присутствие аллеля -1704G в гетерозиготном состоянии по делеции G-1704del промоторной области гена IFNGR2 будет наиболее благоприятным сочетанием для индивидуумов при инфицировании микобактериями. При этом полученные данные позволили сделать предположение о том, что исследуемый полиморфизм гена IFNGR2 обладает функциональной значимостью и оказывает влияние на риск возникновения туберкулеза, но не сальмонеллеза .

На основе проведенных исследований можно утверждать, что полиморфные варианты промоторной области гена МСР1 в позиции СТ, гена IFNG в позиции T-1488C и гена IFNGR2 в положении G-1704del обладают функциональной значимостью и, возможно, влияют на риск развития Тб и сальмонеллеза .

Изученные полиморфные замены в промоторной области гена STAT1 и интронной области гена TLR2, скорее всего, не имеют влияния на уровень экспрессии этих генов .

В целом, полученные результаты свидетельствуют, что использование биоинформационных методов в сочетании с экспериментальной проверкой является эффективным методов установления функциональной значимости полиморфизма генов .

ВЫВОДЫ

1. Частоты полиморфных вариантов генов (МСР-1, IFNG, IFNGR2 и STAT1) у здоровых русских находились в границах величин, характерных для популяций европеоидного происхождения. Частота редкого аллеля Т полиморфного варианта rs56000463: TG интронной области гена TLR2 составила 6,3% .

2. Различные индукторы имеют разнонаправленное влияние на экспрессию генов IFNG, IFNGR2, STAT1, MCP1, TLR2: корд-фактор M. tuberculosis (TDM) и иммуномодулятор IL-4 повышают экспрессию генов МСР1 и IFNG; компонент клеточной стенки S. еnteritidis LPS и неспецифический стимулятор PHA повышают уровень экспрессии генов МСР1 и IFNG и снижают уровень экспрессии гена IFNGR2; иммуномодулятор IFN- и сочетание LPS+IL-4 повышают уровень экспрессии гена МСР1;

комбинация индукторов TDM+IL-4 способствует экспрессии генов МСР1, IFNG и TLR2; сочетание стимуляторов TDM+IFN- и LPS+IFNиндуцирует экспрессию гена МСР1 и супрессирует экспрессию гена IFNGR2 .

Полиморфные варианты С-2508Т гена МСР1, T-1488C гена IFNG, Gdel гена IFNGR2, выбранные с помощью биоинформационной программы MatInspector, являются функционально значимыми: уровень экспрессии генов по этим полиморфным вариантам существенно меняется в зависимости от генотипа .

4. У носителей одних и тех же генотипов по исследуемым полиморфизмам разные виды стимуляторов с неизменной концентрацией вызывали разные экспрессионные ответы в культурах клеток .

Аллели -2508Т и -2508С гена MCP1 обладают протективной ролью в 5 .

развитие туберкулеза и сальмонеллеза – гомозиготные генотипы -2508СС и -2508ТТ ассоциированы с более высоким уровнем экспрессии гена по сравнению с гетерозиготами. Аллель -1488С гена IFNG играет протективную роль в развитии иммунитета против M. tuberculosis, а аллель -1488Т в развитии иммунного ответа при инфицировании S .

enteritidis .

Установлена вовлеченность в патогенез туберкулеза гена IFNGR2, 6 .

делеция области -1704 которого приводит к снижению уровня экспрессии гена при экспозиции клеток с микробными антигенами .

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ожегова Д.С., Фрейдин М.Б., Пузырев В.П. Биоинформационные подходы к изучению регуляторных последовательностей ДНК:

программы, базы данных, алгоритмы / Cборник научных трудов .

Генетика человека и патология. – Томск. – 2007. – Выпуск №8. – С.320

– 323 .

2. Ожегова Д.С., Фрейдин М.Б. Анализ функциональных вариантов промоторных регионов генов-кандидатов подверженности внутриклеточным инфекционным заболеваниям / Сборник тезисов по материалам XII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине». – Казань. – 2007. – С. 101 – 102 .

3. Ozhegova D.S., Freidin M.B., Pusyrev V.P. Using the bioinformatic tools to choose the SNPs with highly possible phenotypic effect / European Journal of Human Genetics. – 2008. – Vol. 16. – P. 397 .

4. Ожегова Д.С., Фрейдин М.Б., Гончарова И.А., Пузырев В.П. Уровень экспрессии генов иммунного ответа IFNG, STAT1 и MCP1 в условиях различной антигенной нагрузки / Якутский медицинский журнал. – 2009. – №2. – С.118-121 .

5. Ожегова Д.С., Фрейдин М.Б. Биоинформационный подход для оценки регуляторных мотивов промоторных областей генов подверженности к инфекционным заболеваниям / Сборник тезисов по материалам VIII конгресса молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» .

Томск. – 2007. – С. 135-136 .

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

мРНК – матричная рибонуклеиновая кислота ПЦР – полимеразная цепная реакция ПДРФ – полиморфизм длин рестрикционных фрагментов РХВ – равновесие Харди-Вайнберга ССФТ – сайт связывания факторов транскрипции Ст - время выхода кривой на плато и пересечение ее с базовой линией .

Тб - туберкулез IFN – интерферон IFNG – ген интерферона гамма IFNGR2– ген субъединицы 2 рецептора интерферона гамма IL4 – интерлейкин 4 GAPDH – ген глицеральдегид-3 фосфат дегидрогеназы FASTSNP – Function Analysis and Selection Tool for Single Nucleotide Polymorphisms (функциональный анализ и инструменты выбора однонуклеотидных полиморфизмов) LAM – липоарабиноманнан LPS – липополисахарид МСР1 (CCL2) – ген моноцитарного хемотаксического протеина MyoD – Myoblast Determining factors (детерминирующий фактор миобластомы) PHA – фитогемагглютинин RT-PCR – полимеразная цепная реакция в реальном времени SNP – single nucleotide polymorphisms (однонуклеотидные полиморфизмы) STAT1 (ISGF-3, STAT91) – ген трансдуктора и активатора транскрипции TDM – трехалозе 6,6'-димиколат, корд-фактор Mycobacterium tuberculosis TLR2 – ген Toll–like рецептора 2






Похожие работы:

«УТВЕРЖДАЮ Директор ИМКЭС СО РАН, д.ф-м.н. _ В.А.Крутиков "_" 2013 г. НАУЧНЫЙ ОТЧЕТ об использовании средств, полученных на поддержку Научного стационара Кедр Института мониторинга климатических и экологических систем СО РАН в 2013 г. В 2...»

«MICROGENICS ПАСПОРТ БЕЗОПАСНОСТИ ВЕЩЕСТВА Подразделение компании Thermo Fisher Scientific РАЗДЕЛ 1. СВЕДЕНИЯ О ВЕЩЕСТВЕ/СМЕСИ И КОМПАНИИ/ПРЕДПРИЯТИИ Microgenics Corporation Телефон для экстренной 1 (800) 424-9300 (для США и Канады) 46500 Kato Road связи...»

«Новый Opel Astra OPEL С ГОРДОСТЬЮ ПРЕДСТАВЛЯЕТ Содержание Комплектации 14–19 Двигателиикоробкипередач 26–27 ИнформационноЦветакузоваи Динамикавождения/Шасси 28–29 развлекательныесистемы 38–39 отделочныематериалы 20–21...»

«ФЕДОРОВА ОКСАНА ИВАНОВНА ВЛИЯНИЕ ДОМЕСТИКАЦИИ НА ХОЗЯЙСТВЕННО ПОЛЕЗНЫЕ И МОРФОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ НОРКИ АМЕРИКАНСКОЙ (MUSTELA VISON SCHREBER, 1777), ХОРЬКА (MUSTELA PUTORIUS L., 1758) И СУРКА СТЕПНОГО (MARMOTA BOBAK MULL., 1776) ПРИ ПРОМЫШЛЕННОЙ ТЕХНОЛОГИИ РАЗВЕДЕНИЯ 06.02.07разведение, селекция и генетика сельскохозяйст...»

«Химия растительного сырья. 2005. №1. С. 49–52. УДК 615.32:552.577 К ВОПРОСУ ОБ ИСПОЛЬЗОВАНИИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ГУМИНОВЫХ ВЕЩЕСТВ В МЕДИЦИНЕ И.В . Федько*, М.В. Гостищева, Р.Р. Исматова © Сибирский государственный медицинский университет, Московск...»

«Действуют с 03.01.2018 Фонды, торгуемые на рынке (ETF) Краткое описание Биржевой инвестиционный фонд (БИФ, англ. ETF), как и обычный инвестиционный фонд, состоит из ценных бумаг и других базовых активов, однако в отличие от инвестиционного фонда БИФ торгуется на фондовой бирже, как обычные акции. Фонды, торгуемые на рынке, действуют по такому же п...»

«ISSN 0536 – 1036. ИВУЗ. "Лесной журнал". 2004. № 6 20 УДК 630* 174.754 Т.А. Шуляковская, Т.Ю. Ветчинникова Шуляковская Тамара Алексеевна родилась в 1951 г., окончила в 1973 г. Петрозаводский государственный университет, кандидат био...»

«ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ КОНЦЕПЦИЯ ИЗМЕНЧИВОСТИ О.Н. Тиходеев Кафедра генетики и биотехнологии СПбГУ ЛЮБАЯ ЕСТЕСТВЕННАЯ НАУКА СЛАГАЕТСЯ ИЗ ЭМПИРИЧЕСКИХ ДАННЫХ И ТЕОРИИ Тиходеев 2015 ВАЖНЫМ ПОКАЗАТЕЛЕМ "КАЧЕСТВА" НАУЧНОЙ...»




 
2019 www.mash.dobrota.biz - «Бесплатная электронная библиотека - онлайн публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.