WWW.MASH.DOBROTA.BIZ
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - онлайн публикации
 

Pages:   || 2 |

«ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ПРОФЕССИОНАЛЬНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НОВОСИБИРСКОЙ ОБЛАСТИ «БЕРДСКИЙ ПОЛИТЕХНИЧЕСКИЙ КОЛЛЕДЖ» (ГБПОУ НСО «Бердский политехнический колледж») Методические указания ...»

-- [ Страница 1 ] --

МИНИСТЕРСТВО ТРУДА И ЗАНЯТОСТИ НОВОСИБИРСКОЙ ОБЛАСТИ

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ПРОФЕССИОНАЛЬНОЕ

ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НОВОСИБИРСКОЙ ОБЛАСТИ

«БЕРДСКИЙ ПОЛИТЕХНИЧЕСКИЙ КОЛЛЕДЖ»

(ГБПОУ НСО «Бердский политехнический колледж»)

Методические указания

к лабораторным работам

по МДК.04.01 «ОСНОВЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО И

БИОХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА»

профессионального модуля ПМ.04. «Выполнение работ по профессии 13265 «Лаборант - микробиолог»»

по специальности 18.02.01 «Аналитический контроль качества химических соединений»

по укрупненной группе 18.00.00 «Химические технологии»

СОГЛАСОВАНО

Заведующая УМО ________Л.Г. Брайченко «____»________20___г .

Рассмотрено на ПЦК Протокол № 1 от 04.09.2014 Председатель ПЦК ________Л.Л. Литовченко г. Бердск, 2014 Организация-разработчик: Государственное бюджетное профессиональное учреждение Новосибирской области «Бердский политехнический колледж»

Разработчики: Литовченко Л.Л., мастер производственного обучения

Методические указания разработаны в соответствие с нормативными документами:

Федеральным законом от 29 декабря 2012г. № 273-ФЗ «Об образовании в Российской Федерации»;



Федерального государственного образовательного стандарта среднего профессионального образования по специальности 18.02.01 «Аналитический контроль качества химических соединений»

Приказом Министерства образования и науки Российской Федерации от 14 июня 2013 г .

№ 464 «Об утверждении Порядка организации и осуществления образовательной деятельности по образовательным программам среднего профессионального образования»

Лабораторные работы проводятся с целью приобретения навыков и умений выделения биомолекул из биологического материала и исследования их химической структуры и химических свойств с использованием необходимых реактивов и оборудования. Проведение лабораторных работ по профессиональному модулю ПМ.04 позволяет подтвердить теоретические положения и выводы по отдельным вопросам биоорганической химии и тем самым закрепить теоретические знания о строении, пространственной структуре, биологических функциях и основах функционирования белков, нуклеиновых кислот, углеводов, липидов, низкомолекулярных регуляторных молекул и продуктов жизнедеятельности клеток .

ОФОРМЛЕНИЕ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ

Все наблюдения и выводы по экспериментальной работе следует заносить в рабочий журнал, отражающий всю работу студента. На обложке или первой странице журнала должны быть написаны фамилия студента, его инициалы, номер группы и название практикума. Записи в журнале производят только ручкой, лаконично, аккуратно, непосредственно после проведения опыта. Запись должна содержать:

1. Дату выполнения работы .

2. Название темы и название опыта .

3. Цель и значение работы .

4. Ход работы .

5. Уравнения происходящих в опытах реакций .

6. Изменение окраски веществ, выделение и характер осадка .

7. Расчеты, проводимые при выполнении работы .

9. Выводы .

В конце каждой работы даются контрольные вопросы, которые помогут при подготовке лабораторной работы к защите .



ОБЩИЕ УКАЗАНИЯ К ПРОВЕДЕНИЮ ЛАБОРАТОРНЫХ РАБОТ

При выполнении лабораторных работ по биологии и микробиологии работают с различным биологическим материалом и культурами микроорганизмов. Изучают строение живых организмов и их основную структурную единицу – клетку. Клетки имеют небольшие размеры, поэтому невооруженным глазом их рассмотреть невозможно. Для их изучения готовят определенным образом препараты, которые рассматривают под микроскопом .

Микробиология изучает мельчайшие, невидимые невооруженным глазом существа – микробы. Они находятся повсюду: в почве, воздухе, воде, на сырье, различных материалах, оборудовании, продуктах питания и т. д. Одни из них безопасны для человека, другие могут вызывать различные заболевания .

Увидеть микроорганизмы, так же как и отдельные клетки, можно только под микроскопом, приготовив соответствующим образом препараты. Поэтому работы на уровне клеток и микроорганизмов проводят в особых лабораториях, которые должны отвечать определенным требованиям. На лабораторном столе должны находиться: спиртовка; штатив для пробирок и бактериальных петель и игл; набор красителей; промывалка; кювета с шинами для окраски препаратов; фильтровальная бумага; карандаш для стекла; дезинфицирующий раствор .

В лаборатории должны быть созданы условия, обеспечивающие стерильность работы, при которых будет исключена возможность попадания как посторонних микроорганизмов извне, так и микроорганизмов из лаборатории в окружающую среду. Поэтому в микробиологической лаборатории необходимо строго соблюдать определенные правила работы и поведения, которые предотвращают возникновение заражения .

Правила работы в лаборатории

1. В помещение лаборатории нельзя входить без специальной одежды – халата .

2. Не разрешается выходить в халате за пределы лаборатории и надевать на халат верхнюю одежду .

3. В помещении лаборатории запрещается принимать пищу и хранить продукты питания .

4. Не выносить за пределы лаборатории, какие бы то ни было посуду и материалы, которые используются для проведения лабораторных работ (пробирки, краски и т. д.) .

5. Не класть на стол личные вещи (сумки, папки и др.), держать их на специально отведенных местах .

6. Если микроорганизмы попадают на оборудование или пол (разобьется пробирка или чашка Петри, на которой они росли), об этом надо сразу же сообщить преподавателю или лаборанту, а на данном месте провести обеззараживание, залив его дезинфицирующим раствором. После этого необходимо провести уборку .

7. Во время выполнения практических работ нельзя открывать форточки. Необходимо соблюдать тишину, избегать лишнего движения и хождения, открывания и закрывания дверей – всего того, что усиливает движение воздуха .

8. Перед началом работы дежурные проводят влажную уборку помещения, а столы протирают дезинфицирующим раствором .





9. Каждый студент перед началом работы должен проверить, все ли необходимое находится на его столе и исправен ли микроскоп .

10. Раздача необходимого для проведения лабораторной работы материала и посуды проводится лаборантом или дежурными .

11. На занятиях студенты должны иметь тетрадь и карандаши (простой и цветные – красный и синий). Рисунки при микроскопировании надо делать с препаратов, а не из книг или пособий .

12. По окончании работы все используемые инструменты обеззараживают. Бактериальные петли и иглы прокаливают над пламенем спиртовки, а пипетки и стекла помещают в дезинфицирующий раствор .

13. Все используемые при работе микробные культуры сдают лаборанту, который проводит их обеззараживание или в автоклаве, или в дезинфицирующем растворе .

14. В конце занятий надо привести в порядок рабочий стол, протереть и убрать микроскоп, тщательно вымыть руки (при работе с заразным материалом их сначала дезинфицируют) и снять халат .

Лабораторная работа № 1 Ознакомление с оборудованием микробиологической лаборатории .

Микробиологическая лаборатория. В микробиологической лаборатории студенты овладевают методами микроскопических, микробиологических и других исследований, проводят научно-исследовательскую работу, знакомятся с основными вопросами, предусмотренными программой по микробиологии .

Лаборатория должна быть просторной, теплой, снабжена холодной и горячей водой, электричеством. Стены, полы и двери выполнены из материалов, которые хорошо поддаются мойке и дезинфекции. Они должны быть гладкими без выступов, ниш и острых углов .

Столы для работы располагаются у окон, чтобы было максимум света и удобств. Их покрывают линолеумом, пластиком или стеклом. Вдоль стола, посередине, ставят штативы для пробирок, флаконы или капельницы с красителями в штативах-колодках, восковые карандаши, газовые горелки или спиртовки. Чашки сливные с мостиками ставят каждому студенту. Над столами монтируют освещение, которое должно приближаться к естественному или быть матовым .

Для обеспечения работы лаборатории надо иметь вспомогательные помещения: моечную, стерилизационную, средоварочную, бокс, препараторскую, термостатную, комнату для оборудования, виварий для содержания подопытных животных .

Моечная должна иметь столы, раковины, электрические или газовые плиты, сушильный, вытяжной и другие шкафы .

Стерилизационная комната (автоклавная) – для обеззараживания отработанного материала, посуды, уничтожения выделенных культур. В ней имеются один или два автоклава, аппарат Коха, печь Пастера .

Средоварочная – для приготовления, разлива, стерилизации и хранения питательных сред .

В средоварочной необходимы газовая или электрическая плита, столы, шкафы для хранения компонентов сред, мясной воды, холодильник .

Бокс – помещение, где высевают материал на искусственные питательные среды для получения культуры микроорганизмов .

Препараторская – место для подготовки оснащения к занятиям. Здесь имеется холодильник, весы, дистиллятор, центрифуга .

Термостатная – помещение где, находятся термостаты различных марок и размеров для культивирования микроорганизмов .

Виварий – помещения, где содержатся лабораторные животные, используемые для биологических проб .

Микробиологическая лаборатория должна иметь достаточное количество посуды и других материалов: пробирки; колбы; чашки Петри; цилиндры; пипетки; предметные и покровные стекла;

бактериологические петли; пастеровские пипетки; питательные среды; растворы красок для окрашивания препаратов; штативы; спиртовки или газовые горелки; автоклав; водяную баню;

аппарат Коха; сушильный шкаф; термостаты; холодильники; дистиллятор; микроскопы;

бактериальные фильтры (Зейтца); центрифугу; осветитель ОИ-19; бактерицидные лампы; насос Комовского; анаэростат; вакуумный эксикатор .

Лабораторная работа – 2 Ознакомление с оборудованием биохимической лаборатории .

В биохимии применяется широкий спектр аналитических методов, однако доминирующими является фотометрические методы, основанные на измерении оптической плотности реакционной смеси. Еще сравнительно недавно в лабораториях для биохимических исследований применялись в основном достаточно простые фотометры (типа ФЭК, КФК и т.п.) .

Измерения сопровождаются вычислениями (иногда довольно трудоемкими). От аналитика требуется приготовить исследуемый образец, согласно требованиям того набора реагентов, который он собирается использовать, провести биохимическую реакцию, затем произвести фотометрирование, произвести необходимые расчеты и получить результат. Следующим шагом в развитии приборного оснащения являются программируемые фотометры (приборы типа Stat Fax) .

Используя эти инструменты, заранее их, запрограммировав на достаточно большое количество методик можно существенно ускорить работу. Однако и эти инструменты не выпадают из цепочки: исследуемая среда измерительный прибор результат. От качества пробоподготовки, проведения реакции и чистоты посуды существенно зависит точность результатов. Для этих целей используются фотометры и биохимические анализаторы (автоматические и полуавтоматические) .

Аналитический процесс фотометрического метода состоит из ряда процедур: дозирования пробы и реагентов, инкубации реакционной смеси, фотометрических измерений. Автоматизация аналитического процесса в фотометрической биохимии позволяет, прежде всего, значительно улучшить качество результатов исследований, повысить производительность лаборатории .

Исключение человеческого фактора существенно снижает вероятность появления грубых ошибок .

Результат любого лабораторного исследования, в том числе и биохимического, представляет ценность при условии, что его аналитические характеристики отвечают определенным требованиям .

Воспроизводимость результата биохимического анализа зависит от:

воспроизводимости дозирования пробы;

дозирования реагентов;

фотометрического измерения .

Большинство современных биохимических анализаторов позволяет выполнять фотометрические и турбидиметрические исследования «по конечной точке» и в кинетическом режиме .

Систематическая погрешность измерения определяется в значительной степени методом исследования. Если метод измерения включает построение калибровочной кривой с использованием стандартных образцов, то систематические погрешности дозатора и фотометра не влияют на систематическую погрешность результата измерения. Если же методика не предусматривает построение калибровочного графика, то погрешность дозатора или фотометра напрямую повлияет на погрешность итогового результата. Малая систематическая составляющая погрешности обеспечивает сопоставимость результатов анализа разных лабораторий .

Воздействие на ход реакции и точность получаемого результата могут оказывать компоненты пробы, имеющие спектр поглощения в области измерения или промежуточные продукты реакции, вступающие во взаимодействие с компонентами пробы. Разумеется, важнейший элемент - качество используемых реагентов, однако на ход реакции оказывает влияние качество промывки реакционной посуды и дозаторов, поскольку остатки реакционной смеси ранее проведенных в той же кювете тестов могут изменять ход реакции. Хороший способ повышения надёжности - использование приборов с одноразовыми реакционными кюветами .

Анализаторы могут различаться по скорости выполнения методик. Например, монореагентные методики двух типов: по конечной точке и кинетические. Современные анализаторы как правило, выполняют и то и другое одинаково быстро, поскольку процедуры дозирования идентичны. Анализаторы 1 класса могут «замедляться» при выполнении кинетических исследований. Часто сама методика накладывает ограничения на производительность, может различаться время инкубации, скорость реакции и т.п .

Хороший анализатор перед началом работы автоматически определяет и сигнализирует, на какое количество исследований хватит реагентов, установленных на борту. Если оператор учёл этот показатель, а также расход воды, то в дальнейшем его участие может потребоваться только при внештатных ситуациях или для замены реакционных ёмкостей или проб .

Отсюда вытекает следующая важная характеристика - количество проб на борту. Чем больше проб можно установить за один раз, тем реже придётся останавливать прибор для дозагрузки. Расход реагентов и образцов, точность дозирования По работе с реагентами анализаторы можно разделить на «открытые» и «закрытые»

системы. «Закрытой» является система, использующая лишь ограниченный спектр реагентов, предусмотренный фирмой-изготовителем прибора. В таких системах значения контрольных и калибровочных материалов заданы заранее, а информация о вносимых реагентах регистрируется путем считывания штрих-кода с упаковки. Сильной стороной «закрытых систем» является высокая стабильность результатов калибровки, слабой - высокая стоимость .

«Открытые» системы оборудованы набором светофильтров для проведения наиболее распространенных методик, и позволяют выполнять проведение анализа практически на любых реагентах промышленного производства .

Определяемые параметры

- Ферменты

- Субстраты

- Специфические белки

- Электролиты

- Лекарственные вещества

- Наркотики

В биохимической лаборатории - следующее современное оборудование:

- Полностью автоматизированный анализатор (система серии ACL 9000, USA-Italy) для проведения коагулометрических исследований;

- Автоматический биохимический анализатор (Vitalab Selectra Junior, Netherlands) для качественного проведения биохимических исследований;

- Автоматический анализатор глюкозы (Enziscan Ultra, Россия) для проведения исследований и получения результатов содержания глюкозы в цельной крови;

- Автоматический анализатор ионоселективный (EasyLyte K, Na, Ca, Ph, USA) для определения в сыворотке крови и моче калия, натрия, ионизированного кальция, а также РН;

- Аппарат (Астра, Россия) для электрофореза белковых фракций со сканером и компьютерной программой обработки результатов для расчета концентрации альбуминов и глобулинов;

- Коагулометр 2-х канальный (Астра, Россия) для автоматизации выполнения коагулометрических исследований;

- Анализатор иммуноферментный планшетный (Sunrise, Tecan) с устройством для промывки микропланшет (Columbus Pro) и термостатируемым шейкером (Stat fax 2200). В настоящее время этот анализатор для ИФА считается одним из самых точных и надежных приборов для регистрации результатов исследований;

- Два полуавтоматических анализатора биохимических (Microlab 300, Netherlands) для качественного проведения биохимических исследований .

Лабораторная работа – 3 Микробиологическая посуда .

Для проведения работ по культивированию микроорганизмов, приготовлению питательных сред и для других целей пользуются посудой, которая должна удовлетворять определенным требованиям и в первую очередь - не должна содержать посторонних веществ. Она должна быть тщательно вымыта и не должна выделять в среду никаких веществ, например щелочей, окислов железа, кислот и др.; лучше всего пользоваться стеклянной, эмалированной или алюминиевой посудой .

Используют посуду из стекла, выдерживающего нагревание при высокой температуре; для изучения свойств микроорганизмов применяют стеклянные приборы, стекла для микроскопирования; для извлечения микроорганизмов и пересевов - иглы и петли .

Посуда. В микробиологической практике чаще всего пользуются пробирками, чашками Петри и колбами разного вида .

В микробиологической практике чаще всего пользуются пробирками и чашками Петри .

Пробирки должны быть без ранта, из прозрачного стекла, размером 18x2,0 см и 18x1,5 см .

Чтобы предохранить содержимое пробирок от попадания из воздуха микробов и культуры от высыхания их закрывают ватными пробками .

Чашки Петри. Чашка Петри состоит из двух чашек разного диаметра. В чашку с меньшим диаметром помещают питательную среду, чашка большего диаметра служит крышкой. Диаметр чашек Петри 8-10-15 см, высота 1,5-2,0 см .

Рис. 1. Посуда для культивирования микроорганизмов: 1 - качалочная колба, 2 - качалочная колба с отбойниками, 3 - коническая колба, 4 - чашка Петри, 5 - пробирка, 6 - матрац .

Стеклянный шпатель Дригалъского используют для растирания по поверхности плотной питательной среды в чашках Петри культуры микроорганизмов при наращивании биомассы .

Колбы Виноградского - это укороченные конические колбы с широким дном; матрацы плоские флаконы .

Химическую посуду также используют при выполнении микробиологических работ:

конические и круглые плоскодонные колбы объемом 50, 100,250 см3 и 1,2,3,5 дм3; бюретки, цилиндры, химические стаканы, воронки различных систем, склянки. Вся посуда, служащая для питательных сред и чистых культур микроорганизмов, закрывается ватными пробками Пипетки используются как градуированные, так и не градуированные емкостью 1 -5 и 10 см3 длиной около 28 см и пастеровские пипетки с оттянутым капилляром .

Специальные микробиологические приборы Специальные приборы. В микробиологии для горячего фильтрования расплавленных плотных сред применяют медные воронки с двойными стенками. Сбоку воронки имеется отросток для подогревания воды. В середину медной воронки вставляют стеклянную воронку с бумажным или ватным фильтром .

Бродильный прибор Эйнгорна применяют для определения количества газа, выделяемого при развитии микроорганизмов. Закрытое колено прибора и часть открытого заполняют горячей питательной средой или в стерильный прибор вливают стерильную среду. После посева выделяющийся при брожении газ будет скапливаться в закрытом колене прибора (рис. 4) .

Бродильными трубками Дунбара пользуются для определения газообразования при брожении. Это стеклянные трубки длиной 30 см и диаметром 0,8 см, запаянные с одного конца и изогнутые под углом 40°). Длина закрытого колена трубки 10 см, открытого - 20 см (рис. 5) .

Рис. 4. Бродильный прибор Рис. 5. Трубки Дунбара для определения Эйнгорна: а - с газообразующей способности дрожжей к брожению: культурой, б - с культурой не а - трубка со средой, б - штатив, образующей газа .

Трубки помещают в специальные деревянные или металлические штативы. Перед посевом закрытое колено надо заполнить средой; если после стерилизации останется пузырек воздуха, его удаляют, наклоняя трубку .

Вспомогательные предметы. Для пересева (посева, инокуляции) культуры с одной среды на другую или для приготовления препарата микроорганизмов, выращенных на поверхности плотной или в жидкой среде, пользуются бактериологической петлей или иглой и шпателем Дригальского (рис. 6). Делают их, используя тонкую (0,4-0,5 мм) проволоку из вольфрама или нихрома .

Проволоку длиной 7-8 см закрепляют в металлическом или стеклянном держателе или впаивают в стеклянную палочку. Конец проволоки загибают на конце пипетки или заточенного карандаша в виде петельки (кольца) диаметром 2-4 мм, концы которой не должны расходиться, иначе жидкость не будет удерживаться .

Рис. 6 Бактериологическая игла (а), петля (б), шпатель Дригальского (в), пастеровская пипетка (г) .

Ввиду легкости стерилизации такая петля или игла является универсальным инструментом при выполнении различных микробиологических работ. При работе с мицелиальными грибами используют крючок. Для посевов на чашках Петри используют стерильный шпатель Дригальского .

Лабораторная работа – 4 Правила техники безопасности при работе в боксовых помещениях .

Кроме основного рабочего помещения лаборатория имеет бокс, стерилизационную, где размещены автоклавы и сушильные шкафы, термостаты или термостатированные комнаты для выращивания микроорганизмов, помещение для хранения культур, моечную, холодильную комнату и т. д .

Бокс представляет собой небольшую изолированную комнату, разделенную на две части перегородкой, и служит для работы с чистыми культурами микроорганизмов. Вход в основное рабочее помещение бокса осуществляется через тамбур с раздвижной дверью, что исключает резкое перемещение воздуха, и, следовательно, занесение извне посторонней микрофлоры .

Оборудование бокса состоит из стола с легко моющейся поверхностью, стула, газовой горелки и бактерицидной лампы, укрепленной в специальном штативе или смонтированной на потолке бокса. Удобно иметь подсобный стол, на котором размещают необходимые во время работы предметы. Все оборудование бокса, его стены, пол и потолок периодически моют и протирают дезинфицирующими растворами; перед работой бокс облучают в течение 40-60 мин ультрафиолетовыми лучами. Бокс может быть устроен и в основном рабочем помещении, но обязательно отделенным от остальной комнаты застекленными стенками и застекленным потолком .

При отсутствии бокса-комнаты широко используют настольные боксы разных конструкций; например, стеклянные настольные шкафы, рамы и дно которых сделаны из отполированного дерева. В среднем размеры шкафа составляют: ширина 62, высота 54 и глубина 50 см. Передняя стенка шкафа поднимается в пазах и может устанавливаться на разной высоте .

Перед работой шкаф стерилизуют разбавленным водой этиловым спиртом с объемной долей этилового спирта 70-75 %. Во время работы шкаф открывают настолько, чтобы руки работающего могли свободно двигаться .

В настоящее время используют герметически закрытые камеры, работа в которых осуществляется под отрицательным воздушным давлением с помощью прикрепленных к передней панели резиновых перчаток. В некоторых боксах («Ламинарах») чистота атмосферы рабочего пространства обеспечивается циркуляцией стерильного воздушного потока внутри камеры .

1. Запрещается входить в бокс при включенной бактерицидной или ртутно-кварцевой лампе .

Работу можно начинать только спустя 30-40 минут после выключения ламп .



2. В боксе и предбокснике не должно быть лишних предметов и оборудования, не предназначенных для работы, загораживающих выход из них и доступ к средствам пожаротушения .

3. Работать в боксе необходимо в спецодежде (халат, шапочка) .

4.4. Запрещается использовать спецодежду, предназначенную для ' работы в боксе, если на ней имеются следы от пролитых легковоспламеняющихся или горючих жидкостей .

5. При работе в боксе исключается использование нательного белья из синтетических материалов .

6. Работы в боксе осуществляются при наличии одновременно не менее двух сотрудников .

7. Перед началом и по окончании работ поверхность стола обрабатывают тампонами, смоченными этиловым спиртом и обжигают (расход спирта при этом не должен превышать 10-15 мл на 1 м2 поверхности). Категорически запрещается эту операцию проводить путем разлива этилового спирта на поверхность рабочего стола и обжига его .

8. Запрещается иметь в боксе легковоспламеняющиеся и горючие жидкости при работе со спиртовкой .

Лабораторная работа – 5 Правила работы с открытым огнем .

Правила работы со спиртовкой:

Зажигать только спичкой, запрещается зажигать другой спиртовкой .

1 .

Перед тем, как зажечь, нужно расправить фитиль, а диск должен плотно прилегать к 2 .

горлышку .

Нельзя переносить спиртовку во время работы в зажжённом виде с одного стола на другой .

3 .

Тушить только колпачком – не дуть!

4 .

Назначение и области применения спиртовок Спиртовки лабораторные, которые применяется для подогрева и плавления материалов, пайки низкотемпературными припоями, стерилизации в открытом пламени инструментов, для фламбирования в медицине, для нагрева небольших лабораторных сосудов (пробирок, колб, тиглей и т.п.) и других подобных термических процессов .

Используются в химических и школьных лабораториях, микробиологических, цитологических, биотехнических лабораториях, медицинских учреждениях, испытательных и зуботехнических лабораториях, а также везде, где требуется применение открытого пламени небольшой тепловой мощности .

Устройство спиртовок Спиртовка это горелка, содержащая резервуар для спирта, имеющий крышку, через которую пропущен фитиль, при этом нижний конец фитиля размещен в резервуаре а верхний конец вне его. Спирт из резервуара поднимается по фитилю за счет капиллярного давления и испаряется, когда достигнет выступающей из резервуара верхней части фитиля. Пары спирта поджигаются и спиртовка горит с температурой пламени не выше 900°Цельсия .

Если фитиль расположен вертикально, спирт поднимается к зоне горения, преодолевая силу тяжести. Необходимый баланс сил определяется размерами капиллярных каналов материала фитиля .

Фитиль пропускается через фитильную трубку, которая является необходимым элементом крышки резервуара, при этом последняя может устанавливаться как внутри горловины, так и вне ее, охватывая последнюю с внешней стороны .

На рисунке слева схематично изображено устройство стандартной спиртовки CЛ-1 .

Резервуар (поз.1) заполнен спиртом (поз.2). Фитиль (поз.3) размещается в спиртовке таким образом, чтобы его нижний конец был в резервуаре, погруженным в спирт, а верхний конец должен быть вне резервуара в открытом воздухе. Крышка резервуара выполнена в виде втулки (поз.4), которая установлена внутри горловины резервуара, и через осевое отверстие в которой с некоторым обжатием пропущен фитиль. Спиртовка имеет колпачок (поз.5), который используется как для тушения пламени спиртовки, так и для предотвращения испарения топлива с верхней части фитиля .

В лабораторных спиртовках наибольшее распространение получили фитили изготовленные из хлопчатобумажной ткани, состоящей из прямых нитей. Однако применяются также и фитили, изготовленные из асбестового шнура .

Обычно топливо для спиртовки заливается через верхнее отверстие резервуара после снятия крышки. Однако имеются спиртовки, резервуар которых имеет боковую заправочную горловину с притертой пробкой .

Отличительные характеристики спиртовок В лабораторной практике применяются спиртовки многочисленных конструкций. Однако все различие между спиртовками можно свести к некоторым основным признакам.

Основные технические характеристики по которым спиртовки отличаются друг от друга являются:

материал резервуара (стекло или металл) форма резервуара (круглая или граненая) внутренний объем резервуара материал, толщина фитиля и его форма наличие или отсутствие устройств для регулировки длины выступающей части фитиля Свойства топлива для спиртовок Все спиртовки в качестве топлива преимущественно используют этиловый спирт Этиловый спирт (этанол) - бесцветная жидкость, обладающая запахом, легковоспламеняющаяся и горящая голубоватым слабо светящимся пламенем. Плотность 0,794 г/см3. Температура кипения чистого этилового спирта при нормальном давлении +73,9°C. Удельная теплота сгорания 7100 ккал/кг .

Этиловый спирт гигроскопичен, хорошо смешивается с диэтиловым эфиром, глицерином, бензолом и т.п. Хранят этиловый спирт в емкостях с плотно притертой пробкой .

Для оценки пожарной опасности этилового спирта при использовании спиртовок необходимо учитывать температуру вспышки и температуру самовоспламенения .

Температура вспышки этилового спирта - это наименьшая температура при которой над его поверхностью образуются пары, способные вспыхнуть в воздухе от источника зажигания .

Устойчивого горения при этом не наблюдается. Ориентировочно температура вспышки характеризует те температурные условия, при которых горючее вещество становится огнеопасным при хранении в открытом сосуде или при случайном разливе. Температура вспышки этилового спирта равна +13°С .

Температура самовоспламенения — это наименьшая температура, при которой начинается горение вещества при контакте с воздухом в отсутствие источника зажигания. Для этилового спирта температура самовоспламенения составляет +365°С .

На рынке имеются три вида этилового спирта: спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья; спирт этиловый технический гидролизный и спирт этиловый технический синтетический .

Утвержденный нормативными документами средний расход спирта при горении спиртовок составляет за 1 мин. горения 1,7 мл. Соответственно за 15 мин горения составляет 25 мл. а за 1 час

-100 мл. Этими нормами можно пользоваться при нормировании расходов спирта при выполнении тех или иных технологических операций .

Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья и спирт этиловый питьевой по степени воздействия на организм человека относят к 4-му классу опасности. Предельно допустимая концентрация (ПДК) паров этилового спирта в воздухе рабочей зоны производственных помещений должна быть не более 1000 мг/м .

В спиртовках происходит горение спирта по химической реакции СН3OH + 3О2 = 2СО2 + 3Н2О Кислород (О2) берется из окружающего воздуха и как видно из уравнения горения этилового спирта при горении образуется только вода (Н2О) и углекислый газ (СО2). И то и другое присутствует вокруг нас в огромных количествах, поэтому можно считать, что использование спиртовок для выполнения лабораторных работ абсолютно безвредно для окружающего персонала .

На рисунке справа показано распределение температуры вдоль пламени фитиля. В нижней части пламени спиртовки температура не превышает 350 °Цельсия а максимальная температура в 900 °Цельсия достигается в верхней части пламени .

Техника безопасности при работе со спиртовками Необходимо использовать спиртовку только по назначению, указанному в ее техническом паспорте. Запрещается заправлять спиртовку вблизи устройств с открытым пламенем. Не заполнять спиртовку топливом более чем наполовину объема резервуара. Нельзя перемещать или переносить спиртовку с горящим фитилем .

Категорически запрещается зажигать фитиль спиртовки посредством другой спиртовки .

Заправлять спиртовку только этиловым спиртом. Гасить пламя спиртовки только посредством колпачка. Не держать на рабочем столе, где используется спиртовка, легковоспламеняющиеся вещества и материалы, способные воспламеняться от кратковременного воздействия источника зажигания с низкой тепловой энергией (пламя спички, спиртовки) .

При работе не наклонять спиртовку, а при возникновении такой необходимости, использовать спиртовки, работающие в наклонном положении (граненые спиртовки). При опрокидывании спиртовки и разливе на столе горящего спирта немедленно накройте спиртовку плотной тканью, а при необходимости используйте для гашения пламени и огнетушитель .

Помещение, в котором производится работа со спиртовкой (спиртовками) должно быть оснащено первичными средствами пожаротушения, например, порошковым огнетушителем марки ОП-1 или ОП-2 .

Лабораторная работа – 6

ПОДГОТОВКА ПОСУДЫ ДЛЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА

Посуда для бактериологических работ должна быть чистой, а для многих исследований — и стерильной, так как использование загрязненной, плохо вымытой посуды может привести к получению неправильных результатов .

Для мытья лабораторной посуды в микробиологических лабораториях отводится отдельное помещение — моечная или специальное рабочее место, которое обеспечивается большой раковиной с подводкой горячей и холодной воды, нагревательными приборами: газовой или электрической плитой. .

В моечной необходимо иметь кастрюли, тазы, ведра, ерши, щетки и доски с колышками для сушки чистой посуды. На дно раковины кладут густую металлическую сетку, чтобы предупредить засорение канализационной сети частицами агара, ватой, бумагой, попадающими в воду при мытье посуды .

В процессе мытья на посуду воздействуют механическими и химическими факторами. К числу первых относится удаление грязи с помощью щеток и ершей. При отсутствии ершей или невозможности их использования, например в случае несоответствия ерша размеру сосуда, посуду моют с помощью мелко нарезанных кусочков бумаги, соломы или сена. При этом загрязнение, имеющееся на внутренних стенках, удаляется механически. Наилучшие результаты мытья посуды отмечаются в том случае, когда воздействие механических факторов сочетается с действием химических веществ. Поэтому ерши, которыми моют посуду, предварительно погружают в соду, полужидкое мыло, мыльный раствор или стиральный порошок .

Надписи, сделанные на стекле восковым карандашом, легко снимаются щеткой либо кусочком влажной марли с меловым порошком или содой .

Мытье посуды. Для микробиологических работ применяют посуду из специального стекла, выдерживающего нагревание при высокой температуре .

Пробирки, чашки Петри, не бывшие в употреблении, промывают подкисленной (1—2 % НСL) водой, так как при нагревании новое стекло выделяет много щелочи и может изменить реакцию питательной среды .

Посуду моют в проточной теплой воде ершами с использованием кальцинированной соды, полужидкого мыла, мыльного раствора и синтетических моющих средств, после чего тщательно ополаскивают водопроводной, а затем дистиллированной водой. Сильно загрязненную посуду со следами жира обрабатывают хромовой смесью .

Состав хромовой смеси: в 150 мл концентрированной серной кислоты всыпают 25 г измельченного двухромовокислого калия. Через сутки, после растворения осадка, смесь темно-оранжевого цвета можно применять для мойки посуды. Перед применением смесь следует подогреть до температуры 45—60 °С. Изменение темно-оранжевого цвета хромовой смеси на темно-зеленый свидетельствует о ее непригодности .

Пипетки и другие градуированные приборы должны быть совершенно чистыми и хорошо обезжиренными. Моют градуированные приборы в теплом растворе горчицы, мыльной воды или стирального порошка в сосудах, где они могут быть полностью погружены в раствор, ополаскивают теплой проточной водой, а затем дистиллированной .

При ополаскивании чисто вымытой посуды вода стекает, оставляя на поверхности стекла ровную водяную пленку. Отдельные капельки воды на стенках посуды свидетельствуют о том, что она плохо обезжирена .

Вымытую посуду сушат при комнатной температуре или в сушильном шкафу при температуре 100—105 °С Чисто, вымытую и высушенную посуду закрывают ватными пробками и хранят в местах, надежно защищенных от пыли, лучше всего в плотно закрывающемся шкафу. Ватные, пробки предохраняют посуду, питательные среды и культуры от заражения посторонними микроорганизмами (микробы оседают в волокнах ваты). Лучше употреблять для изготовления пробок гигроскопическую вату, так как она не так сильно тлеет. Ватная пробка должна легко входить в пробирки и при извлечении из них не терять своей формы. Длина пробки для обычной пробирки около 4 см. Пробка должна входить в пробирку на 1,5— 2,0 см. Удобно для работы обертывать пробку чистой марлевой салфеткой. Ватные пробки делают из пласта ваты, скручивая его руками на столе или на пинцете, или на специальной машине .

Посуду, используемую для приготовления и хранения питательных сред и культивирования микробов, нельзя обрабатывать дезинфицирующими веществами, так как даже следы их делают питательную среду непригодной для размножения микроорганизмов .

Лабораторная работа – 7

ПОДГОТОВКА ПОСУДЫ ДЛЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА

Стерилизация посуды. Перед стерилизацией посуду завертывают в бумагу для сохранения стерильности после прогревания. Бумагу удаляют непосредственно перед использованием посуды .

Пробирки завертывают в бумагу по 10—20—40 шт., закрывая верхнюю часть пробирок, чашки Петри — каждую отдельно или по 5—10 шт. в пакеты .

В концы пипеток, которые берут в рот, вставляют ватные тампоны. Пастеровские пипетки завертывают в бумагу по 3— 15 шт. Градуированные пипетки завертывают в длинные полоски бумаги шириной 4—5 см. Обмотку начинают с конца, который опускают в среду. Пипетку обматывают по спирали. Конец бумаги закручивают или приклеивают. Пипетки можно завертывать в лист бумаги по 3—5 шт. На бумаге указывают объем завернутых пипеток. При наличии пеналов пипетки стерилизуют в них .

Шпатели стерилизуют завернутыми в бумагу по одному или несколько (до 5) штук .

На пробки колб, склянок, трубок надевают бумажные колпачки .

Посуду, подготовленную для стерилизации, загружают в сушильный шкаф не слишком плотно, чтобы обеспечить некоторую циркуляцию воздуха и равномерный, надежный прогрев стерилизуемого материала. Сушильный шкаф при стерилизации должен быть закрыт. За температурой необходимо следить, так как при понижении ее не осуществляется стерилизация, а при нагреве выше 175 °С бумага и пробки начинают разрушаться. Стерилизация длится 2 ч при температуре 160—170 °С. По окончании стерилизации шкаф не открывают до тех пор, пока температура в нем не снизится до 100—70 °С, так как при резком охлаждении иногда нарушается стерильность материала, а стекло может растрескаться .

Посуду можно стерилизовать и в автоклаве .

Мелкие металлические инструменты стерилизуют прокаливанием в пламени непосредственно перед использованием .

Приборы для культивирования микроорганизмов, а также детали к этим приборам (резиновые пробки и шланги) стерилизуют автоклавированием. Предметы, подлежащие стерилизации в автоклаве, завертывают в бумагу .

Стерилизация кипячением является наиболее простым и легкодоступным способом. В стерилизатор наливают дистиллированную воду, так как водопроводная вода образует накипь .

Стеклянные предметы погружают в холодную воду, металлические— в горячую с добавлением соды. Кипячение ведут на слабом огне .

Предметы, изготовленные из термолабильных пластмасс, например центрифужные пробирки, стерилизуют этиловым спиртом или ультрафиолетовыми лучами. Время стерилизации зависит от мощности используемой бактерицидной лампы и расстояния между лампой и объектом. После облучения предметы до использования следует хранить в стерильной посуде .

Лабораторная работа – 8 Устройство сухожароваго (сушильного) шкафа .

Стерилизация сухим жаром производится в печи Пастера. Подготовленный к стерилизации материал кладут на полки так, чтобы он не соприкасался со стенками. Шкаф закрывают и после этого включают обогрев. Продолжительность стерилизации при температуре 150 0C 2 ч, при 165 0C - I ч, при 180 0C - 40 мин, при 200 0C —10—15 мин (при 170 0C бумага и вата желтеют, а при более высокой температуре обугливаются) .

Началом стерилизации считается тот момент, когда температура в печи достигнет нужной высоты. По окончании срока стерилизации печь выключают, но дверцы шкафа не открывают до полного охлаждения, так как холодный воздух, поступающий внутрь шкафа, может вызвать образование трещин на горячей посуде .

Наиболее эффективным и простым способом борьбы с различными бактериями и микроорганизмами в лаборатории является стерилизация. При этом, несомненно, важно также сохранить целостность и физические свойства лабораторного оборудования .

Как правило, сухожаровые шкафы применяются для просушки и стерилизации различных деталей. Конструкция сушильных шкафов позволяет производить процесс сушки в регулируемом диапазоне температур +5 - +300 градусов. В настоящее время выпускаются современные модели с принудительной и естественной циркуляцией, комплектующиеся ручным или микропроцессорным управлением. Время протекания процесса регулируется электронным таймером, информация о его похождении выводится на цифровой дисплей .

Поэтому уже на протяжении многих лет для оснащения лабораторий различного профиля широко применяют сухожаровые шкафы, или сухожары, принцип работы которых основан на циркуляции горячего воздуха внутри камеры из нержавеющей стали со съемными полками .

Равномерно и быстро прогревать воздух по всей рабочей камере позволяет встроенный вентилятор .

Стабильная температура на протяжении всего процесса стерилизации в камере сухожара поддерживается за счет микропроцессорного управления, поэтому стерилизуемое оборудование защищено от различных колебаний температуры и перегрева, и в процессе стерилизации не теряет своих физических свойств и характеристик .

В случае неисправности основной электронной регулирующей системы контроль температуры будет обеспечивать специальный термостат безопасности, работающий независимо от основной системы контроля .

Лабораторная работа 9 Бактерицидные лампы (Ультрафиолетовая лампа, устройство и правила работы) .

Ультрафиолетовое излучение (ультрафиолетовые лучи, УФ-излучение) — электромагнитное излучение, занимающее спектральный диапазон между видимым и рентгеновским излучениями. Длины волн УФ-излучения лежат в интервале от 10 до 400 нм (7,5·1014—3·1016 Гц) .

Различают три участка спектра ультрафиолетового излучения, имеющего различное биологическое воздействие. Слабое биологическое воздействие имеет ультрафиолетовое излучение с длиной волны 390-315 нм. Противорахитичным действием обладают УФ-лучи в диапазоне 315-280 нм, а ультрафиолетовое излучение с длиной волны 280-200 нм обладает способностью убивать микроорганизмы .

Ультрафиолетовые лучи длиной волн 220-280 им действуют на бактерии губительно, причем максимум бактерицидного действия соответствует длине волн 264 нм. Данное обстоятельство используется в бактерицидных установках, предназначенных для обеззараживания в основном подземных вод. Источником ультрафиолетовых лучей является ртутно-аргонная или ртутно-кварцевая лампа, устанавливаемая в кварцевом чехле в центре металлического корпуса .

Оценка бактерицидного действия производится в единицах, называемых бактами (б). Для обеспечения бактерицидного эффекта ультрафиолетового облучения достаточно примерно 50 мкб

• мин/см2 .

Современная ультрафиолетовая лампа работает по тому же принципу, что и обычная люминесцентная лампа: ультрафиолетовое излучение образуется в колбе вследствие взаимодействия паров ртути и электромагнитных разрядов. Газоразрядная трубка изготавливается из специального кварцевого или увиолевого стекол, имеющих способность пропускать УФ-лучи .

Правила работы. Для максимальной обработки всего помещения лампу нужно разместить высоко, чтобы она освещала как можно большую площадь; из обрабатываемого помещения необходимо уйти из помещения; лучше включать лампу, находясь в другом помещении, используя удлинитель. Не стоит находиться в помещении со включенной лампой дольше секунды – этого хватит, чтобы проверить, работает ли прибор .

Во время пользования очистителем нельзя снимать крышку и наблюдать за ультрафиолетовой лампой. Это защитит кожу и зрение .

Перед чисткой прибора его нужно отключить от электричества .

Лампу лучше чистить каждые четыре месяца, чтобы сохранять производительность очистителя воздуха на высоком уровне .

Использованную лампу нельзя выбрасывать как обычный мусор, нужно выполнить меры ее утилизации, которые, скорее всего, записаны в инструкции по применению прибора .

Влияние УФ-излучения на бактерий. Возникновение при воздействии УФ-излучения молекулярных повреждений ДНК, фотодеструкция белков и биологических мембран обуславливает развитие многочисленных биологических эффектов, которые приводят к летальному эффекту. В механизме летального эффекта главную роль играет образование пиримидиновых димеров в молекулах нуклеиновых кислот .

Образование димеров в ДНК ведет к гибели клетки вследствие:

1. возникновения летальной мутации

2. потери, хотя бы одной из молекул ДНК, способности к репликации за счет нерепарированных сшивок ДНК ДНК или ДНК белок

3. нарушения процесса транскрипции .

У бактерий воздействие полного спектра УФ-излучения (200 – 400 нм) вызывает изменение темпа деления клеток и их гибель .

Лабораторная работа 10 Методы стерилизации микробиологической посуды Стерилизация – полное уничтожение живых форм микроорганизмов и их спор .

В микробиологической лаборатории стерилизуют посуду, инструменты, питательные среды, отработанный материал .

Стерилизация осуществляется различными приемами и является непременным условием успешной работы микробиолога .

Существует много способов стерилизации, каждый из них должен гарантировать полное уничтожение всех микрофлор, не влияя на состав и качество стерилизуемых жидкостей, питательных сред и предметов .

МЕТОДЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ

Физические методы:

Холодная стерилизация

1. Облучение УФ лучами Стерилизация помещений для обеззараживания воздуха, поверхностей помещения (стен, пола), воды и пищевых продуктов .

2. Фильтрование через Стерилизация жидкостей и питательных сред, бактериальные фильтры разрушающихся при нагревании .

(механическая Фильтрование под давлением или в вакууме (среды содержат стерилизация) белки, антибиотики, сыворотки, витамины) .

3. Ультразвук Стерилизация ультракороткими радиоволнами .

4. Радиоактивное Рентгеновские лучи вызывают гибель бактерий при больших излучение дозах облучения .

Горячая стерилизация

1. Прокаливание в пламени Стерилизация инструментов (микробиологической петли, спиртовки шпатели, иглы, пинцеты), обгорание микробов и их спор (быстрый и надежный способ стерилизации) .

2. Кипячение Стерилизация игл и хирургических инструментов (30-60 мин с добавлением 1-2 % раствором соды). Этот метод не обеспечивает полной стерилизации, т.к. споры некоторых бацилл и клостридий выдерживают кипячение в течение нескольких часов .

3. Стерилизация сухим В сушильных шкафах стерилизуется вата, марля, стеклянная посуда при температуре 160-170 0С в течение 1,5 часа .

жаром Нельзя стерилизовать резиновые предметы, питательные среды .

4. Стерилизация паром под Нагревание материала насыщенным водным паром при давлением давлении выше атмосферного. Погибают вегетативные клетки и споры микроорганизмов .

Автоклавируют питательные среды, посуду, инструменты, резиновые перчатки, отработанный материал .

Режим стерилизации измеряют в единицах давления – атмосферах 0,5 атм = 112 0С (температура пара) 0,7 атм = 116 0С 1,5 атм = 128 0С 1,0 атм = 121 С 2,0 атм = 134,8 0С

5. Дробная стерилизация Стерилизация питательных сред, разрушающихся при температуре выше 100 0С. Стерилизация текучим паром по 30-40 мин с 24 часовым перерывом 3 раза .

Сушильный шкаф Автоклав ГК-100 Стерилизуемый Метод стерилизации Режим стерилизации Применение материал Чашки Петри, Горячим воздухом 165-170 0С, Завёрнутые в бумагу пипетки 2 часа. (отверстия пипеток шпатели закрыты ватными пробками.) Колбы, пробирки, Горячим воздухом 165-170 0С, Закрытые ватными химические стаканы, 2 часа. пробками .

флаконы, стеклянные центрифужные пипетки, трубки Бурри .

Держатели Автоклавирование 1 атм. 20 мин. Завернутые в бумагу .

бактериальных фильтров резиновые пробки и шланги фильтры Зейтца свечи Шамберлана и Беркефельда Мембранные фильтры Автоклавирование 0,5 атм. В сосуде с 15 мин. дистиллированной водой. Можно стерилизовать длительным кипячением .

Центрифужные Время экспозиции Пробирки после пробирки, Ультрафиолетовыми устанавливают облучения хранят в изготовленные из лучами экспериментально. стерильной посуде .

термолабильных пластмасс .

Лабораторная работа 11 Лабораторная посуда по биохимии общего назначения и правила работы с ней При проведении лабораторных работ по биохимии, как правило, используют пробирки, химические стаканы, колбы, мерную посуду, воронки, стеклянные палочки .

Пробирки – отрезки стеклянных трубок, запаянные с одного конца, размером 20 х 2 см .

Изготовлены пробирки из тугоплавкого стекла .

При смешивании растворов желательно, чтобы содержимое занимало не более трети объема пробирки. Для перемешивания налитых реактивов пробирку легко держат большим и указательным пальцами левой руки, поддерживают средним пальцем, а указательным пальцем правой руки наносят косые удары по низу пробирки. Нельзя перемешивать содержимое пробирки, закрывая её отверстие пальцем .

Перед нагреванием пробирку зажимают в специальном держателе и осторожно прогревают стенки и содержимое пробирки. При закипании жидкости, пробирку следует отставить и продолжать нагревание не в пламени горелки, а над ним .

Химические стаканы представляют собой тонкостенные цилиндры различной емкости, изготовленные из тонкого химически стойкого стекла, либо непрозрачного фарфора. Стаканы бывают с носиком и без него. Их удобно использовать для переливания жидкостей, разведения растворов, охлаждения пробирок .

Нагревать стаканы на открытом пламени нельзя, для этого используют асбестовую сетку .

Колбы изготавливают из тонкого химического стекла. Они бывают круглые с узким горлом и конические (колбы Эрленмейера) .

Колбы следует нагревать на асбестовых сетках .

Мерная посуда предназначена для измерения объема жидкости. Это могут быть:

- Мерные цилиндры емкостью от 5-10 мл до 1л и более .

- Мензурки – конические стаканы с обозначенными на них делениями в миллиметрах .

- Мерные колбы, имеющие длинное узкое горло, примерно, на середине которого есть метка, обозначающая вместимость. Эти колбы используют для приготовления точных растворов определенной концентрации .

- Градуированные пипетки и бюретки, которые имеют деление по всей длине и позволяют выпускать жидкость строго отмеренными частями .

При использовании градуированной мерной посуды важно знать так называемую цену деления, т.е. скольким миллилитрам или долям миллилитра соответствует каждое деление .

Цену деления определяют следующим образом:

- находят на шкале нулевое деление, а затем, внимательно рассматривая шкалу, находят следующее деление, обозначенное на рисунке цифрой 1;

- считают число мелких делений 0 и первой значащей цифрой;

- непосредственно определяют цену одного мелкого деления. Для этого объем от 0 до значащей цифры (в нашем примере 1) делят на число делений (1 мл \10 = 0,1 мл). Следовательно, цена деления равна 0,1 мл .

Следует обратить внимание, что на пипетках и бюретках отсчет начинается сверху (нулевая отметка вверху), так как жидкость извлекается снизу .

- Глазные пипетки используют для внесения реактивов по каплям .

Воронки предназначены для переливания жидкостей и для фильтрования. Их верхний диаметр может быть от 35 до 300 мм .

При переливании жидкостей нельзя наливать воронку до краев и время от времени ее нужно приподнимать. Плотно прилегающая к горлу сосуда воронка затрудняет переливание, так как внутри сосуда создается повышенное давление .

Фильтрование – процесс отделения жидкости от находящихся в ней частиц твердого вещества. Жидкость, полученная при фильтровании, называется фильтратом. Чаще всего используют бумажные фильтры, изготовленные из специальной фильтровальной бумаги. Простой фильтр изготавливают, складывая кусок фильтровальной бумаги вчетверо и округляя ножницами его края. В воронку вставляют фильтр такого диаметра, чтобы его края были ниже края воронки на 0,5-1,0 см. Фильтр смачивают дистиллированной водой, прижимают его пальцами к стенкам воронки. Далее проводят фильтрование .

Стеклянные палочки служат для перемешивания жидкостей .

Лабораторная посуда Лабораторная посуда представляет собой емкости различной формы и объема, используемые для сбора образцов биоматериалов, для размещения аликвот (проб) биоматериалов и растворов реагентов, для проведения процедур пробоподготовки (термостатирование, центрифугирование), для проведения аналитических процедур.

Существует обширная номенклатура этих изделий, выбор из которой необходимого лаборатории ассортимента определяется профилем выполняемых ею исследований:

- Бутыли, флаконы и виалы;

- Колбы конические и сферические узкогорлые;

- Пробирки многоцелевые;

- Пробирки вакуумные;

- Пробирки центрифужные и микроцентрифужные;

- Пипетки для перенесения жидкости и мерные;

- Микропипетки;

- Капилляры;

- Многолуночные и глубоколуночные планшеты;

- Предметные и покровные стекла;

- Кюветы для измерительных приборов .

Многоразовую посуду (большей частью стеклянную), в которой выполняются анализы, пробирки или контейнеры - следует надписывать только специальным фломастером, а не карандашом по стеклу, так как такие надписи потом трудно удалить, кроме того, карандаш по стеклу при нагревании расползается и надпись теряется. Надписывать пробирки или колбы можно и обычным мягким графитовым карандашом, предварительно обработав участок поверхности посуды наждачной бумагой. Надпись с образовавшейся матовой поверхности легко удаляется обычной резинкой. При наличии в лаборатории оборудования для печатания и считывания штрихового кода вместо надписей используют наклейки с кодом, соответствующим пробе определенного пациента или определенному реактиву. При многоразовом использовании лабораторной посуды она должна быть чисто вымыта, причем для разных исследований требования к чистоте посуды и, следовательно, способы мытья неодинаковы. Наиболее широко распространена обработка стеклянной посуды хромовой смесью (хромпиком) .

До пятидесятых годов вся лабораторная посуда готовилась только из стекла или фарфора, в редких случаях из металла. С тех пор стали широко использовать пластмассы - сначала полиэтилен, затем и другие, с самыми разными свойствами: из прозрачной (пропускающей свет вплоть до ультрафиолетовой области) готовят оптические кюветы, из поглощающей синефиолетовую часть спектра - посуду для чувствительных к свету реактивов. Из пластмассы изготовляются также контейнеры для проб биологического материала, пробирки, наконечники для пипеток, сосуды для выращивания культур и т.д. Преимущество пластмассы перед стеклом очевидны - она не бьется, легче, дешевле. Для каждого вида лабораторной работы удается подобрать соответствующий сорт пластмассы, которая допускает, например, температурную стерилизацию или задерживает свертывание крови. Планируя работу, надо ясно представлять себе свойства посуды, которая будет использоваться непосредственно в анализе и для хранения реактивов .

Образцы проб или реактивы соприкасаются только с внутренней поверхностью сосуда, поэтому в ряде случаев ее стенки делаются двуслойными: внутреннее покрытие обеспечивает химическую или биологическую инертность, внешний слой - механическую прочность. При мытье такой посуды надо соблюдать осторожность, чтобы не нарушить внутреннее покрытие, которое может быть также повреждено агрессивной жидкостью. В ряде случаев поврежденное внутреннее покрытие может быть восстановлено (рециклизовано). Надо иметь в виду, что химическое, техническое и коммерческое название одной и той же пластмассы могут различаться, соответствующую информацию надо искать в каталоге, либо в справочнике. Лабораторная посуда нуждается в стерилизации - иногда перед работой и почти всегда после работы, поскольку всякий поступивший для исследования биологический материал должен рассматриваться как инфицированный.

Большинство видов пластмасс выдерживает действие основных антисептиков:

четвертичных аммониев, формалина, этанола, йода, окислителей, но длительное действие агрессивных веществ может сказаться на посуде из полиуретана, полистирола, поликарбоната и акрила. Стерилизацию автоклавированием проводят обычно при 121°С и избыточном давлении в 1 атмосферу, при этом надо иметь в виду, что пластмассы плохо проводят тепло, поэтому большие объемы (свыше 1 л) надо очень долго выдерживать. Из этих соображений рекомендуют отдельно стерилизовать пластмассовые емкости (обязательно с открытой крышкой!) и отдельно сами растворы. Возможна также стерилизация сухим жаром. Температурной стерилизации не подлежат изделия из полистирена, поливинилхлорида, стиренакрилнитрила, полиэтилена и полиуретана .

Для ее приготовления в большую фарфоровую ступку насыпают кристаллы бихромата калия и растирают сконцентрированной серной кислотой, постепенно увеличивая ее количество так, чтобы раствор был насыщенным. Смесь должна иметь красноватый оттенок и нагреваться, если ее налить в мокрую посуду. Когда хромпик приобретает зеленый цвет и перестает нагреваться, это будет означать, что его способность к окислению органических соединений исчерпана, в связи с чем он не может более применяться для мытья посуды. Хромовую смесь наливают в колбы, цилиндры и т.д. или погружают в нее более мелкие предметы - пипетки, флакончики и т.п. Перед тем как обрабаты- вать посуду хромпиком, нужно тщательно удалить все видимые на глаз загрязнения, в том числе надписи карандашом по стеклу. В противном случае хромовая смесь быстро портится, но, главное, при взаимодействии с органическим веществом могут образоваться ядовитые пары и выделяться тепло, что таит в себе опасность взрыва .

Хромовая смесь - очень едкий реактив: он прожигает одежду, а попадая на кожу, вызывает ожоги. Поэтому, если возможно, лучше пользоваться менее едкими средствами - содой, мылом, стиральным порошком. Если посуду моют, погружая ее в моющие растворы, то сначала нужно удалить грязь и надписи с внешней поверхности и вымыть ее теплой водой с мылом; если надписи сделаны стеклографом (карандашом по стеклу), их удаляют ватой, смоченной в органическом растворителе (хлороформ, эфир и т.п.). Грязь на внешней поверхности не только портит моющие растворы, но и может попасть с ними на внутреннюю поверхность посуды. Каждый способ мытья посуды имеет свои преимущества и недостатки; он должен быть адекватен тому виду анализа, для выполнения которого посуда предназначается. Поэтому желательно всегда использовать один и тот же комплект посуды .

Мытье хромпиком обеспечивает степень чистоты, достаточную практически для всех видов лабораторных клинических работ, но этот способ трудоемок и требует соблюдения мер предосторожности. Стиральные порошки безопаснее и работать с ними проще, но надо иметь в виду, что они прочно адсорбируются на стекле и могут быть удалены только при многократном промывании посуды водой. Для каждого вида анализов нужно разработать адекватный - не слишком трудоемкий, но достаточно надежный метод мытья посуды, убедиться, что он не искажает результаты исследований и всегда пользоваться одним и тем же моющим средством. Однозначные советы дать трудно, так как поступающие в продажу стиральные порошки помимоосновного детергента - алкилсульфоновых кислот - содержат различные добавки, а разные сорта стекла по-разному выщелачиваются и адсорбируют моющие средства .

Лабораторная работа 12

МЫТЬЕ БИОХИМИЧЕСКОЙ ПОСУДЫ

Умение мыть биохимическую посуду является той частью лабораторной техники, знание которой обязательно для каждого работника лаборатории .

Биохимическая посуда должна быть совершенно чиста; без выполнения этого условия работать нельзя. Поэтому следует научиться мыть посуду так, чтобы была полная уверенность в ее чистоте .

Для выбора способа мытья посуды в каждом отдельном случае необходимо следующее:

1. Знать свойства загрязняющих посуду веществ .

2. Использовать растворимость загрязнений в воде (холодной или горячей), в растворах щелочей, различных солей или кислот .

3. Использовать свойства окислителей окислять в определенных условиях органические и неорганические загрязнения, разрушать их с образованием легко растворимых соединений .

4. Для мытья могут быть использованы все вещества, обладающие поверхностноактивными свойствами (мыло, синтетические моющие вещества, моющие глины и пр.) .

5. Если загрязняющий посуду осадок химически стоек, для удаления его можно применять механическую очистку (при помощи ершей и пр.) .

6. Из реактивов для мытья следует применять только дешевые материалы .

7. Нужно всегда помнить о технике безопасности и возможности несчастных случаев при мытье посуды, особенно если работающий незнаком со свойствами загрязнений. Каждый новый работник лаборатории должен быть' ознакомлен с правилами техники безопасности .

Удалить загрязнения со стенок посуды можно различными методами: механическими, физическими, химическими, физико-химическими или комбинируя их .

Механические и физические методы очистки посуды Мытье водой. В тех случаях, когда химическая посуда не загрязнена смолой, жировыми и другими не растворяющимися в воде веществами, посуду можно мыть теплой водой. Стеклянная посуда считается чистой, если на стенках ее не образуется отдельных капель и вода оставляет равномерную тончайшую пленку .

Щетки для мытья посуды .

Если на стенках посуды имеется налет каких-либо солей или осадок, посуду очищают (предварительно смочив водой) щеткой или ершом и уже затем окончательно моют водой .

При работе с ершом нужно следить, чтобы нижний конец его не ударялся ни о дно, ни о стенки посуды, так как этим концом можно выбить дно или проломить стенку. Чтобы предотвратить возможность разбивания посуды металлическим концом ерша, на кончик его нужно надеть кусочек резиновой трубки подходящего размера. Хорошо вымытую в теплой воде посуду обязательно два-три раза споласкивают дистиллированной водой для удаления солей, содержащихся в водопроводной воде .

Приспособления для мытья посуды водой и паром .

В больших лабораториях, где имеется отдельное помещение для мытья посуды (так называемые мойки), иногда применяют специальные приспособления для мытья водой и паром .

В раковину нельзя выливать и выбрасывать концентрированные растворы кислот и щелочей, хромовую смесь, дурно пахнущие и ядовитые. вещества, металлический натрий и т. п .

Концентрированные кислоты и щелочи необходимо предварительно сильно разбавить или, еще лучше, нейтрализовать во избежание разрушения канализационной сети, Дурно пахнущие и ядовитые вещества должны быть разрушены или обезврежены тем или иным способом в зависимости от их свойств. При выливании в раковину таких веществ возможно их испарение и отравление воздуха лаборатории. Если нет возможности так или иначе разрушить или обезвредить эти вещества, их можно сливать только в раковину, находящуюся в вытяжном шкафу .

Мытье паром. Посуда не всегда может быть отмыта одной водой; например, этим путем нельзя удалить загрязнения жировыми веществами. Значительно лучших результатов можно достичь, если мыть посуду струей водяного пара. Этот способ мытья является самым лучшим, но он редко применяется, так как требует длительного времени. Если обычно колбу можно вымыть за 5—10 мин, то для мытья паром нужен минимум 1 ч. Когда требуется особенно чистая посуда (для проведения ряда физико-химических работ), ее предварительно моют каким-либо обычным способом, после чего пропаривают .

Для мытья паром в колбу емкостью 3—5 л до половины наливают воду, на дно кладут несколько кусочков пемзы или стеклянные капилляры (для равномерного и спокойного кипения) .

Колбу плотно закрывают пробкой. В пробку вставляют трубку для подводки пара и воронку, через которую в колбу стекает конденсат. Конец воронки для предотвращения прорыва пара опускают в воду приблизительно на 2—3 см. Верхний конец трубки вводят в сосуд, который укрепляют в кольце или лапке штатива. Другие приспособления для мытья химической посуды паром показаны на рис 3 .

Приборы для мытья посуды паром .

После мытья паром посуду, не перевертывая, высушивают или продуванием чистого воздуха, или в сушильном шкафу, или же просто на воздухе, но при этом нужно следить, чтобы не загрязнить ее .

Мытье органическими растворителями. К органическим растворителям относятся:

диэтиловый (серный) эфир, ацетон, спирты, петролейный эфир, бензин, скипидар, четыреххлористый углерод и другие растворители .

Наилучшие результаты дает применение изопропилового спирта, особенно в сочетании с ультразвуковой обработкой поверхности стекла Органические растворители применяют для удаления из посуды смолистых и других органических веществ, которые не растворяются в воде .

Для мытья посуды используют также пары органических растворителей. Для этого применяют аппарат, представляющий собой металлический сосуд, на дно которого наливают органический растворитель, преимущественно высококипящий (например, хлорированные углеводороды и т. п.) .

Аппарат для мытья посуды парами органических растворителей: 1 — водяная баня: 2 —тренога; 3 — сосуд с растворителем; 4 — корзина для посуды; 5 —змеевик; 6крышка .

В сосуд на треноге 2 помещают корзину 4 из проволоки. В эту корзину укладывают посуду так, чтобы горла сосудов были обращены вниз. Сосуд плотно закрывают крышкой 6. Верхняя часть сосуда имеет охладительное устройство 5 в виде змеевика с 3—4 оборотами. Змеевик одним концом присоединен к водопроводному крану, а на другой конец надевают резиновую водоотводную трубку, опущенную в раковину. Если охлаждение змеевиком окажется недостаточным, в крышку сосуда можно вставить обратный холодильник Сокслета. Работу с аппаратом следует проводить под тягой .

В зависимости от горючести растворителя и его температуры кипения обогрев можно проводить или голым пламенем, или на электроплитке, или на водяной бане..»

Продолжительность обработки парами растворителя за*.-висит от того, насколько загрязнена посуда. Очень загрязненную смолами или маслами посуду приходится иногда обрабатывать несколько раз, причем каждый раз в сосуд следует наливать свежий растворитель .

Промытую парами растворителей посуду обрабатывают хромовой смесью или другими окислителями. Большинство органических растворителей огнеопасно, работать с ними следует вдали от огня .

Загрязненные органические растворители нужно собирать каждый в отдельности и время от времени регенерировать их. Регенерация состоит в том, что загрязненный растворитель отгоняют. Мытье другими моющими средствами. Для мытья посуды можно применять и другие вещества, например мыло и особенно 10 %-ный раствор тринатрийфосфата, обладающий прекрасными моющими свойствами .

При мытье водой с мылом или тринатрийфосфатом полезно поместить в колбу кусочки чистой фильтровальной или какой-либо другой мягкой бумаги. При встряхивании колбы бумага механически удаляет со стенок приставшие к ним загрязнения. Совершенно недопустимо применять для очистки посуды песок, так как он царапает стекло. Посуда, имеющая царапины при нагревании, обычно лопается .

Лабораторная работа – 13 Автоматические пипетки Автоматический дозатор (автоматическая пипетка) - это высокотехнологичное устройство поршневого типа (работают по принципу вытеснения воздуха за счет перемещения поршня в измерительном цилиндре) .

Автоматические дозаторы предназначены для точного дозирования жидкостей, проб и реагентов при проведении исследований в лабораториях любого уровня и, поскольку дозирование одна из часто повторяемых процедур, автоматические пипетки являются необходимым устройством и пользуются большим спросом у медицинских работников, научных работников, тем самым повышая производительность работы и комфорт при выполнении большого количества рутинных исследований .

Автоматические пипеточные дозаторы бывают одноканальные и многоканальные, с постоянным (фиксированным) и переменным объемами дозирования .

Эргономичный корпус дозатора выполнен из высококачественного пластика, устойчивого к химически активным средам, что позволяет пользователю работать с разнообразными жидкостями, как с растворами, так и с концентрированными жидкостями. Дозирующие устройства легки и удобны в использовании и обслуживании .

Особенности:

Современный эргономичный дизайн Максимально комфортная работа благодаря легким высокотехнологичным материалам конструкции .

Низкая удельная теплопроводность двойного корпуса: отсутствие влияния температурных колебаний на точность пипетки .

Отдельно расположенный сбрасыватель наконечника .

Легкость в использовании и простота калибровки Материал рукоятки устойчив к УФ-излучению, различным реагентам и влаге .

Контрастный черно-белый дисплей с крупными цифрами .

Разнообразие типов и объемов дозирования Широкий выбор наконечников и аксессуаров Доступные цены и значительный гарантийный срок эксплуатации Соответствуют международным стандартам качества На рынке широкий выбор моделей автоматических дозаторов, а также наконечников и аксессуаров к ним, которые позволяют с успехом решать задачи дозирования в лабораториях любого типа .

Дозатор DRAGONLAB переменного объема Дозатор DRAGONLAB фиксированного объема Дозатор PIPETTE переменного объема Дозаторы PIPETTE фиксированного объема Дозаторы серии "Лайт" переменного объема Дозаторы серии "Лайт" фиксированного объема Дозаторы серии "Колор" фиксированного объема Лабораторная работа – 14 Составление инструкционной карты по оказанию помощи при термических ожогах .

Термические ожоги возникают от воздействия высокой температуры на кожу и подлежащие ткани .

Термические ожоги могут носить массовый характер, например, при пожарах и авариях .

Особую опасность несут ожоги, причиненные открытым пламенем, так как в данном случае возможно поражение верхних дыхательных путей и значительной части тела. Чем обширнее ожог, тем тяжелее общее состояние пострадавшего, и тем хуже прогноз на выздоровление .

Клиническими признаками поражения верхних дыхательных путей являются ожог лица, наличие обожженных волос на лице или в носовых ходах, выделение мокроты, содержащей сажу, а также респираторный дистресс-синдромом или свистящее дыхание .

Все термические ожоги условно подразделяют на легкие и тяжелые. Тяжелыми принято считать ожоги, занимающие не менее 10 поверхности тела, при которых у пострадавшего может развиться так называемая ожоговая болезнь .

Термические ожоги кистей рук I и II степеней — наиболее часто встречающееся поражение. Однако при пожарах и особенно в случаях воспламенения одежды возможны и более тяжелые ожоги .

По степени тяжести ожоги принято условно подразделять на четыре группы:

I степень — эритема (покраснение) кожи II степень — образование пузырей III степень — омертвение отдельных участков кожи IV степень — омертвение глубже лежащих тканей Ожоги I степени опасны при поражении более 50% поверхности тела, ожоги II степени приводят к развитию ожогового шока при поражении 25—30% поверхности, ожоги III степени — менее 25% поверхности (ладошка человека равна примерно 1% поверхности его тела) Задача первой помощи при тяжелых термически: ожогах заключается в борьбе с болью и предотвращении травмирования, раздражения и загрязнения обожженных участков .

При термических ожогах кожи (кроме ограниченных ожогов I степени) следует вызвать врача или немедленно доставить пострадавшего в ближайшее лечебное учреждение .

До оказания медицинской помощи необходимо осторожно, не допуская травмирования, обнажить обожженный участок и закрыть его сухой асептической повязкой. С обожженного участка нельзя снимать прилипшие остатки обгоревшей одежды и вообще как-либо очищать его .

Обработка ожогов мазями или наложение компрессов производится только квалифицированными медицинскими работниками .

Сильная боль — одна из главных причин ухудшения общего состояния пострадавшего в первые часы после ожога. Для снятия боли следует применять любые доступные обезболивающие средства: амидопирин (0,5 г), анальгин (0,5—1 г), ацетилсалициловую кислоту (0,5—1 г.) .

Рекомендуется также прием димедрола (0.1 г) или супрастина (0.025 г). Действенным средством обезболивания при ожогах служит применение сухого холода (лед, снег, холодная вода в пузыре или полиэтиленовом мешочке) поверх повязки. Охлаждение одновременно уменьшает отек и воспалительные процессы в обожженных тканях .

При ожогах II и III степени не следует смачивать обожженные участки холодной водой. В рамках оказания первой помощи не допускается также промывание тяжелых ожогов этиловым спиртом, перекисью водорода или другими средствами, смазывание мазями, жирами и маслами, присыпание питьевой содой, крахмалом и т. д .

Лабораторная работа – 15 Правила работы с микробиологической петлей .

Для взятия посевного материала, для взятия исследуемого материала .

Неразъемная конструкция .

Петли обладают достаточной жесткостью для проведения манипуляций, стерилизуются прокаливанием в пламени горелки .

Держатель изготовлен из алюминиевого сплава с защитным покрытием, снабжен удобной силиконовой ручкой, позволяющей с удобством манипулировать инструментом в работе и защитить руки от высокой температуры при прокаливании рабочей части инструмента .

Длина инструмента с держателем 275 мм, длина держателя 185 мм, диаметр 2,5 мм, диаметры петель 1, 2, 3, 4, 5 мм (соответственно №), №0 - без петли .

Петли изготовлены из нихромовой проволоки: № 1 и 2 - диаметром 0,4 мм; № 3,4,5 и № 0 диаметром 0,5 мм .

Лабораторная работа – 16 Устройство микроскопа .

Функционально устройство микроскопа делится на 3 части:

1. Осветительная часть Осветительная часть конструкции микроскопа включает источник света (лампа и электрический блок питания) и оптико-механическую систему (коллектор, конденсор, полевая и апертурная регулируемые/ирисовые диафрагмы) .

2. Воспроизводящая часть Воспроизводящая часть включает объектив и промежуточную оптическую систему .

3. Визуализирующая часть Визуализирующая часть включает монокулярную, бинокулярную или тринокулярную визуальную насадку с наблюдательной системной (окулярами, которые работают как лупа) .

С конструктивно-технологической точки зрения, микроскоп состоит из следующих частей:

механической;

оптической;

электрической .

1. Механическая часть микроскопа Устройство микроскопа включается себя штатив, который является основным конструктивно-механическим блоком микроскопа. Штатив включает в себя следующие основные блоки: основание и тубусодержатель .

В простых микроскопах на основание устанавливают осветительные зеркала или накладные осветители. В более сложных моделях осветительная система встроена в основание без или с блоком питания .

Тубусодержатель представляет собой блок, часть конструкции микроскопа, на котором закрепляются:

узел смены объективов, имеющий следующие варианты исполнения — револьверное устройство, резьбовое устройство для ввинчивания объектива, «салазки» для безрезьбового крепления объективов с помощью специальных направляющих;

фокусировочный механизм грубой и точной настройки микроскопа на резкость — механизм фокусировочного перемещения объективов или столиков;

узел крепления сменных предметных столиков;

узел крепления фокусировочного и центрировочного перемещения конденсора;

узел крепления сменных насадок (визуальных, фотографических, телевизионных, различных передающих устройств) .

Чисто механическим узлом микроскопа является предметный столик, предназначенный для крепления или фиксации в определенном положении объекта наблюдения. Столики бывают неподвижные, координатные и вращающиеся (центрируемые и нецентрируемые) .

2. Оптика микроскопа (оптическая часть) Основными оптическими элементами микроскопа являются оптические элементы, образующие осветительную (в том числе, конденсор), наблюдательную (окуляры) и воспроизводящую (в том числе объективы) системы микроскопа .

Объективы микроскопа Объектив состоит из фронтальной и последующей частей. Фронтальная линза (или система линз) обращена к препарату и является основной при построении изображения соответствующего качества, определяет рабочее расстояние и числовую апертуру объектива. Последующая часть в сочетании с фронтальной обеспечивает требуемое увеличение, фокусное расстояние и качество изображения, а также определяет высоту объектива и длину тубуса микроскопа .

Классификация объективов Объективы разделяются по принципу расчетного качества изображения, параметрическим и конструктивно-технологическим признакам, а также по методам исследования и контрастирования .

По принципу расчетного качества изображения объективы могут быть:

ахроматическими;

апохроматическими;

объективами плоского поля (план) .

Современные объективы, обладающие промежуточным качеством изображения .

Иммерсия (от лат. immersio — погружение) — жидкость, заполняющая пространство между объектом наблюдения и специальным иммерсионным объективом (конденсором и предметным стеклом). В основном применяются три типа иммерсионных жидкостей: масляная иммерсия (МИ/Oil), водная иммерсия (ВИ/W) и глицериновая иммерсия (ГИ/Glyc), причем последняя в основном применяется в ультрафиолетовой микроскопии .

Иммерсия применяется в тех случаях, когда требуется повысить разрешающую способность микроскопа или её применения требует технологический процесс микроскопирования.

При этом происходит:

повышение видимости за счет увеличения разности показателя преломления среды и объекта;

увеличение глубины просматриваемого слоя, который зависит от показателя преломления среды .

Кроме того, иммерсионная жидкость может уменьшать количество рассеянного света за счет исчезновения бликов от объекта. При этом устраняются неизбежные потери света при его попадании в объектив .

Маркировка объективов .

Данные о каждом объективе маркируются на его корпусе с указанием следующих параметров:

увеличение («х»-крат, раз): 8х, 40х, 90х;

числовая апертура: 0,20; 0,65, пример: 40/0,65 или 40х/0,65;

дополнительная буквенная маркировка, если объектив используется при различных методах исследования и контрастирования: фазовый — Ф (Рп2 — цифра соответствует маркировке на специальном конденсоре или вкладыше), поляризационный — П (Pol), люминесцентный — Л (L), фазово-люминесцентный — ФЛ (PhL), ЭПИ (Epi, HD) — эпиобъектив для работы в отраженном свете по методу темного поля, дифференциально-интерференционный контраст — ДИК (DIC), пример: 40х/0,65 Ф или Ph2 40x/0,65;

маркировка типа оптической коррекции: апохромат — АПО (АРО), планахромат — ПЛАН (PL, Plan), планапохромат — ПЛАН-АПО (Plan-Аро), улучшенный ахромат, полуплан — СХ — стигмахромат (Achrostigmat, CP-achromat, Achroplan), микрофлюар (полуплан-полуапохромат) — СФ или М-ФЛЮАР (MICROFLUAR, NEOFLUAR, NPL, FLUOTAR) .

Окуляры В общем виде окуляры состоят из двух групп линз: глазной — ближайшей к глазу наблюдателя — и полевой — ближайшей к плоскости, в которой объектив строит изображение рассматриваемого объекта .

Окуляры классифицируются по тем же группам признаков, что и объективы:

Осветительная система Осветительная система микроскопа проходящего света состоит из двух частей — коллектора и конденсора .

Коллектор. При встроенной осветительной системе проходящего света коллекторная часть расположена вблизи источника света в основании микроскопа и предназначена для увеличения размера светящегося тела. Для обеспечения настройки коллектор может быть выполнен подвижным и перемещаться вдоль оптической оси. Вблизи коллектора располагается полевая диафрагма микроскопа .

Конденсор. Оптическая система конденсора предназначена для увеличения количества света, поступающего в микроскоп. Конденсор располагается между объектом (предметным столиком) и осветителем (источником света) .

Чаще всего в учебных и простых микроскопах конденсор может быть выполнен несъемным и неподвижным. В остальных случаях конденсор является съемной частью и при настройке освещения имеет фокусировочное перемещение вдоль оптической оси и центрировочное перемещение, перпендикулярное оптической оси .

При конденсоре всегда находится осветительная апертурная ирисовая диафрагма .

Классификация конденсоров близка по группам признаков к объективам:

Конденсор темного поля — конденсор, предназначенный для получения эффекта темного поля. Может быть специальным или переделан из обычного светлопольного конденсора путем установки в плоскости ирисовой диафрагмы конденсора непрозрачного диска определенного размера .

Маркировка конденсора .

На фронтальной части конденсора наносится маркировка числовой апертуры (осветительной) .

3. Электрическая часть микроскопа В современных микроскопах, вместо зеркал, используются различные источники освещения, питаемые от электрической сети. Это могут быть как обычные лампы накаливания, так и галогенные, и ксеноновые, и ртутные лампы .

Также все большую популярность набирают светодиодные осветители. Они обладают значительными преимуществами перед обычными лампами, как например долговечность, меньшее энергопотребление и др. Для питания источника освещения используются различные блоки питания, блоки розжига и другие устройства, преобразующие ток из электрической сети в подходящий для питания того или иного источника освещения. Также это могут быть и аккумуляторные батареи, что позволяет использовать микроскопы в полевых условиях при отсутствии точки подключения .

Лабораторная работа – 17 Приготовление препарата раздавленная капля .

Раздавленная капля — способ наблюдения живых микроорганизмов в микроскоп. На середину предметного стекла наносят петлей или пипеткой каплю исследуемого материала, ее осторожно накрывают покровным стеклом, чтобы в жидкости не образовалось пузырьков воздуха .

Капля должна заполнять все пространство между стеклами и не выступать за края покровного стекла. Иногда, если препарат нужно рассматривать длительное время, края покровного стекла предварительно смазывают вазелином. Препарат можно окрасить, осторожно добавив к нему петлей разведенный краситель .

Раздавленная капля — это метод приготовления препаратов для микроскопического изучения живых объектов. Применяется при исследовании бактерий, клеток культуры тканей, простейших, ряда водорослей и других мелких организмов .

Для приготовления препаратов по методу раздавленной капли на поверхность чистого сухого предметного стекла наносят каплю воды, физиологического раствора или культуральной жидкости. Стеклянной палочкой или бактериологической петлей в каплю вносят небольшое количество исследуемой культуры и осторожно распределяют ее в жидкости для получения однородной взвеси. При работе с культурой тканей на предметное стекло наносят каплю суспензии клеток в культуральной жидкости. Если суспензия клеток слишком густая, предварительно приготовляют рабочее разведение культуры. Для этого обычно к 4,5 мл воды, физиологического раствора или среды для роста добавляют 0,5 мл суспензии клеток и тщательно перемешивают. Этим достигается десятикратное разбавление исходной суспензии. При необходимости можно получить более высокие разведения (1:100—1:1000 и т. д.);

приготовленную каплю накрывают покровным стеклом, избегая образования пузырьков воздуха .

Если часть жидкости выступает за края покровного стекла, излишек среды можно отсосать узкой полоской фильтровальной бумаги .

Готовые препараты рассматривают в сухих и иммерсионных системах. Для получения наибольшего контраста применяют темнопольную или фазово-контрастную микроскопию. Так как при этом чаще всего необходима двойная иммерсия (объектива и конденсора), толщина препарата не должна превышать 1,1—1,3 мм. Неокрашенные организмы выглядят под микроскопом обведенными светлой или темной (в зависимости от фокусировки) полоской (линия Векке), возникающей на границе преломления среды и тела .

Помимо изучения неокрашенных бактерий, простейших и т. д., метод раздавленной капли позволяет применять методы прижизненной окраски. В качестве красителя широко используют 0,1% водный раствор нейтрального красного .

Лабораторная работа – 18 Простой метод окраски микроорганизмов .

Большинство красок, применяемых в микробиологии, принадлежат к производным бензола и добываются из каменноугольной смолы .

Красители применяемые в микробиологии, являются солями двух типов:

1) кислые красители – это те, у которых ион, придающий окраску (хромофор), является анионом (примером может служить эозин);

2) основные красители – те, у которых роль хромофора играет катион (примером может служить метиленовый синий) .

Красители первого типа являются кислыми потому, что хромофор, будучи кислотой, при образовании придающей окраску соли, связывается с основанием (NaOH) .

Красители второго типа называются основными потому, что хромофор, будучи основанием, при образовании соли связывается с кислотой (HCl)/ Как правило, кислые красители связываются более интенсивно с цитоплазменными (основными) компонентами клетки, а основные – с ядерными (кислыми) .

Действие некоторых красителей не зависит от образования солей или других химических соединений с окрашиваемым материалом. Они просто покрывают поверхность, адсорбируясь, растворяясь или осаждаясь в материале .

В процессе окрашивания играют роль как физические, так и химические факторы Существуют простые и сложные методы окрашивания микропрепаратов .

Для простого метода окрашивания микропрепаратов чаще всего пользуются основными анилиновыми красителями. Очень широко применяют метиловый синий, основной фуксин, кристаллический фиолетовый, тионин .

Простой метод окрашивания может быть применен как для окрашивания убитых микробных клеток в фиксированных микропрепаратах, так и для прижизненной окраски микроорганизмов .

Прижизненной окраской следует считать лишь такую, при которой окрашенные организмы длительное время остаются живыми и способными к размножению. Существует несколько способов прижизненной окраски, в том числе и способ Nakanischi .

При этом способе чистое предметное стекло обливают насыщенным водным раствором метиленовой сини, высушивают и обтирают сухой тряпочкой до тех пор, пока налет краски не примет светло – голубого оттенка. На покровном стекле приготовляют мазок из исследуемых микробов, после чего не высохший до конца препарат накладывают на предметное стекло с красителем. При помощи микроскопа можно наблюдать, как микробы, оставаясь живыми, не теряя своей активной подвижности (если таковой обладают), постепенно окрашиваются в синий цвет .

Этот метод ценен тем, что при его применении отсутствует опасность образования искусственных продуктов обработки, в возможности выявления некоторых функциональных особенностей микробной клетки .

Среди простых методов окраски существуют как позитивные, так и негативные способы окрашивания .

К простым позитивным методам окраски относится окраска по методу Лнеффлера, а к негативным – окрашивание по методу Бури .

Для окраски по методу Леффлера (Loffler) можно применить раствор метиленового синего (краситель Леффлера), который позволяет выявить многие детали формы и структуры микроорганизмов. Краситель Леффлера представляет собой смесь двух растворов А и Б .

Раствор А: метиловый синий – 0,3 г, этиловый спирт – 30,0 мл .

Раствор Б: КОН (0,01 %) – 100 мл .

Смесь хорошо сохраняется во флаконе с притертой стеклянной пробкой .

Для получения более чистых препаратов, краску можно наливать на мазок покрытый фильтровальной бумагой, или использовать фильтровальную бумагу заранее пропитанную красителем и высушенную. В таком случае на фиксированный мазок накладывают полоску сухой пропитанной красилелем фильтровальной бумаги, а затем на бумагу пипеткой наносят несколько дистиллированной воды и пинцетом или шпателем прижимают фильтровальную бумагу к стеклу .

Краситель вымывается из бумаги и окрашивает мазок. По истечении времени окрашивания, фильтровальную бумагу снимают, препарат промывают осторожно струей воды, высушивают и микроскопируют .

В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зрения остается светлым и чистым, а окрашенными будут только микробные клетки .

Помимо позитивных способов окраски в некоторых случаях применяются негативные (контрастные) способы. В этом случае микроорганизмы, в которые краситель не проникает, выглядят как светлые частички на равномерно окрашенном фоне .

Очень часто для негативного окрашивания микропрепаратов пользуются жидкой черной тушью («негативный способ» Burri) .

По способу Бури фон препарата заливают жидкой тушью. Тушь не является истинным красителем, поэтому тела микробов остаются неокрашенными; вследствие чего получается как бы негативное их изображение .

При этом способе тушь разбавляют водой в соотношении 1:9, 1:1 или 1:2 .

Поскольку тушь сама по себе может содержать бактерии, ее стерилизуют, добавляя несколько капель формалина или автоклавируют 30 минут при 110 градусах. Перед употреблением подготовленная тушь (разбавленная и стерильная) должна в течение двух – трех недель сохраняться в спокойном состоянии, чтобы осели взвешенные в ней частицы. При приготовлении тушевых препаратов используется верхняя часть отстоявшейся жидкости .

Каплю черной туши наносят на предметное стекло и тщательно смешивают с каплей микробной взвеси. Смесь тонким слоем размазываю по поверхности предметного стекла краем покровного стеклышка. Когда темный слой высохнет, препарат фиксируют и исследуют с помощью микроскопа. Микробные клетки видны в виде бесцветных телец а темном фоне препарата .

Кроме жидкой туши для негативного окрашивания можно использовать водные растворы конгорот (3 %), нигрозина (10 %) и некоторых других красителей. Окрашивание негативными красителями можно проводить двумя способами: либо раствор красителя наносить на сухой фиксированный мазок, после промывки водой и высушивания микроскопировать; либо каплю исследуемой суспензии микробов смешивают с красителем, накрывают покровным стеклом и микроскопируют. И в том, и в другом случае микробные клетки будут бесцветными .

Лабораторная работа – 19 Окраска Гр+ микроорганизмов по методу Грама .

Метод Грама — метод окраски микроорганизмов для исследования, позволяющий дифференцировать бактерии по биохимическим свойствам их клеточной стенки. Предложен метод в 1884 году датским врачом Г. К. Грамом .

По Граму бактерии окрашивают анилиновыми красителями — генциановым или метиловым фиолетовым и др., затем краситель фиксируют раствором иода. При последующем промывании окрашенного препарата спиртом те виды бактерий, которые оказываются прочно окрашенными в синий цвет, называют грамположительными бактериями (обозначаются Грам (+)), — в отличие от грамотрицательных (Грам ()), которые при промывке обесцвечиваются .

После промывания растворителем при окрашивании по Граму добавляется контрастный красный краситель, который окрашивает всех грамотрицательных бактерий в красный или розовый цвет. Это происходит из-за наличия внешней мембраны, препятствующей проникновению красителя внутрь клетки. Тест классифицирует бактерии, разделяя их на две группы относительно строения их клеточной стенки При этом методе выявляется способность бактерий удерживать краситель или обесцвечиваться в спирте, что связано с химической структурой микробной клетки .

Грамположительные микробы окрашиваются в сине-фиолетовый цвет, грамотрицательные — в розовый и красный .

Для выполнения окраски по Граму надо приготовить следующие растворы .

Карболовый раствор генцианвиолета или кристалвиолета:

красителя 1 г, 96° спирта 10 мл, кристаллической карболовой кислоты 2 г, дистиллированной воды 100 мл. Растирают в ступке краситель с карболовой кислотой до кашицы, прибавляют небольшими порциями спирт и окончательно разводят водой. Сливают в бутыль, оставляют на сутки, затем фильтруют. Или: насыщенного (4,8 %) спиртового раствора красителя 10 мл, 2 % карболовой воды 100 мл .

Раствор Люголя (в модификации Грама): йодистого калия 2 г, дистиллированной воды 10 мл, йода кристаллического 1 г. Смесь хорошо закупоривают, оставляют на сутки, после чего добавляют дистиллированной воды до 300 мл .

Методика окраски по Граму .

На фиксированный мазок накладывают кусочек фильтровальной бумаги и на нее наливают карболовый раствор генцианвиолета от 30 сек до 1 минуту .

Сливают краситель и, не смывая, наливают раствор Люголя на 1 минуту .

Сливают раствор Люголя и прополаскивают препарат в 95° спирте в течение 1/2 до 1 минуты, пока не перестанет отходить краситель. Промывают водой .

Дополнительно окрашивают разведенным фуксином от 30 сек-1 минуту .

Сливают краситель, промывают и высушивают препарат .

Видоизменение окраски Грама по А. И. Синеву .

Заготовляют полоски фильтровальной бумаги, пропитанной 1 % спиртовым раствором кристалвиолета и высушенной. На препарат накладывают полоску такой бумаги (немного меньше предметного стекла) и наливают 2—3 капли воды .

Окрашивают в течение 2 минут .

Снимают бумажку пинцетом и наливают раствор Люголя на 1 минуту. Обесцвечивают спиртом .

Дополнительно окрашивают разведенным фуксином .

Модификация окраски Грама по Г. П. Калине .

В небольшую каплю дистиллированной воды на предметном стекле внести минимальное количество микробных клеток, суспензию смешать с одной петлей 0,5 % спиртового раствора бриллиантового зеленого, распределить равномерно на площади 1 см2, подсушить и фиксировать однократным проведением через пламя. Затем обработать в течение полутора двух минут реактивом: 5 % спиртового раствора фуксина 2 мл, 5 % спиртового раствора йода 2 мл и 0,5 % спиртового раствора йодистого калия 96 мл. Промыть 30 % этиловым спиртом до конца отхождения красителя, ополоснуть водой, докрасить 10 % водным раствором фуксина .

Видоизменение окраски Грама по Эткинсу .

Готовят следующие растворы .

1. Насыщенный спиртовой раствор генцианвиолета -1 часть, 1 % водный раствор сернокислого анилина - 3 части .

Для приготовления сернокислого анилина к 100 мл 5 % раствора серной кислоты прибавляют по каплям 20 мл анилинового масла. Выпавший обильный белый рыхлый осадок фильтруют, снимают с фильтра и размешивают в 30 мл 95° спирта, снова фильтруют, собирают осадок и высушивают. Для получения более чистого продукта высушенный осадок растворяют в небольшом количестве кипящей воды и выливают в кристаллизатор. Сейчас же сернокислый анилин выпадает в виде красивых снежно-белых листочков. Дают остыть, сливают маточный раствор, отжимают кристаллическую массу фильтровальной бумагой и высушивают .

2. Йод кристаллический — 2 г, 4 % едкий натр — 10 мл, дистиллированная вода — до 100 мл .

Для дополнительной окраски применяют спиртово-водный раствор сафранина (насыщенного спиртового раствора 1 часть, дистиллированной воды 10 частей) .

Окрашивание:

1) красить генцианвиолетом 1 минуту;

2) промыть водой;

3) обработать йодом 1 минуту;

4) обесцвечивать спиртом 5 минут;

5) дополнительно красить 10 секунд;

6) промыть водой, высушить .

Модификация Николля .

Готовят растворы:

1. Насыщенный спиртовой раствор генцианвиолета-10 мл, 1% водный раствор карболовой кислоты-100 мл .

2. Абсолютный спирт — 3 части, ацетон — 1 часть .

Окрашивание:

1) красить 1—2 минуты, слегка подогревая препарат на слабом пламени;

2) не промывая, нанести несколько капель раствора Люголя. Повторить 2—3 раза в течение 5 секунд;

3) дифференцировать смесью спирта и ацетона 10 секунд;

4) промыть водой;

5) докрасить фуксином Пфейффера 30—60 секунд;

6) промыть водой и высушить .

Лабораторная работа – 20 Окраска Гр– микроорганизмов по методу Грама .

Сущность метода заключается в различии химического состава и строения клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий .

Клеточная стенка грам+ бактерий толстая, но однослойная, содержит много пептидогликана

– муреина, а также тейховые кислоты, которые образуют прочное соединение с красителями генцианвиолетом и йодом и поэтому остаются окрашенными после обработки мазка спиртом .

Таким образом, грам+ бактерии по методу Грама окрашиваются в сине-фиолетовый цвет .

У грам бактерий клеточная стенка тонкая, но двухслойная. Муреина мало, причем он содержится во внутреннем слое клеточной стенки, тейхоевые кислоты отсутствуют. Внешний слой клеточной стенки содержит, главным образом, вещества, обладающие гидрофобными свойствами – липополисахариды и липопротеиды. Эти вещества не образуют прочного комплекса с красками генцианвиолетом и йодом и поэтому клетки обесцвечиваются после обработки 96 %ным этиловым спиртом и после дополнительной окраски красителем фуксином окрашиваются в бледно-розовый цвет .

Окраска по Граму .

Методика:

1. окрасить мазок генцианвиолетом (2 минуты, через фильтровальную бумагу);

2. бумагу удалить, оставшуюся краску слить;

3. окрасить мазок раствором Люголя (1 минута);

4. раствор Люголя слить и нанести несколько капель чистого 96% спирта (30-40 секунд, осторожно покачивать стекло);

5. тщательно смыть спирт водой;

6. окрасить водным фуксином (2 минуты);

7. промыть водой и высушить .

Грамположительные микробы окрашиваются в сине-фиолетовый цвет, грамотрицательные — в розовый и красный .

Лабораторная работа – 21 Окраска микроорганизмов по методу Циля-Нильсена Метод назван именами немецких медиков — микробиолога Франца Циля (1857—1926) и патологоанатома Фридриха Нельсена (1854—1898), которые разработали его в 1882—1883 гг .

Способ окраски по Цилю — Нильсену был впервые предложен для кислотоустойчивых микроорганизмов — микобактерий туберкулеза и лепры. Эти микроорганизмы имеют своеобразный химический состав, отличающийся высоким (до 30—40 %) содержанием особых жироподобных веществ (воски). Предварительно фиксированный на пламени мазок из мокроты больного туберкулезом окрашивают раствором карболового фуксина при дву- или троекратном подогревании до появления паров. Видимо, благодаря размягчению воска краска проникает в клетку и удерживается в ней даже при последующей обработке препарата 5 % серной кислотой в течение 3—5 с; поэтому кислотоустойчивые микобактерии остаются окрашенными в красный цвет .

Остальные микробы обесцвечиваются под действием кислоты и при дополнительной окраске метиленовым синим становятся синими .

Для окраски спор, которые при обычных методах окраски имеют вид неокрашенных пустот, применяют протравы: кислоты и щелочи. Они разрыхляют плотную оболочку споры и облегчают проникновение через нее краски. Окрасившиеся споры обладают кислотоустойчивостью и не обесцвечиваются под действием кислоты в отличие от вегетативного тела микробной клетки. Поэтому принцип окраски спор и кислотоустойчивых бактерий одинаков .

Споры можно окрасить по методу Циля—Нильсена (споры красные, вегетативное тело синее). Для этого на высушенный, но нефиксированный мазок наливают несколько капель 0,5% раствора хлористоводородной или серной кислоты и подогревают над пламенем горелки в течение 1—2 мин до закипания. Остатки кислоты сливают, препарат высушивают, фиксируют в пламени .

Дальнейшую окраску производят по методу Циля — Нильсена .

Методика окраски:

1. На фиксированный мазок накладывают белую Карболовый фуксин-основная краска;

фильтровальную бумагу и наливают карболовый прогревание-протрава .

фуксин Циля. Препарат 2-3 раза подогревают в пламени до появления паров .

2. Препарат промывают водой, бумагу сбрасывают .

–  –  –

Приготовление растворов

Раствор 1. Насыщенный спиртовой раствор фуксина:

растереть в ступке 0,3 г основного фуксина с 2 — 3 каплями глицерина, добавить по каплям 10 мл 96- этилового спирта .

Раствор 2. Рабочий раствор фенола (5 % водный раствор):

расплавить 5 г кристаллического фенола путем легкого подогревания на водяной бане (температура плавления фенола 41 °C). Добавить слегка подогретую дистиллированную воду до объема 100 мл .

Раствор 3. Рабочий раствор карболового фуксина Циля:

в 90 мл полученного раствора фенола (2) добавить 10 мл насыщенного раствора фуксина (1) .

Раствор 4. Обесцвечивающие растворы:

а) Раствор серной кислоты К 75 мл дистиллированной воды осторожно долить 25 мл концентрированной серной кислоты, постепенно наслаивая ее по стенкам сосуда. Смешать. Содержимое нагреется .

Никогда не добавляйте воду в кислоту!

б) Раствор солянокислого спирта Вместо раствора серной кислоты для обесцвечивания можно использовать 3 % солянокислый спирт: К 97 мл этилового спирта осторожно добавляют 3 мл концентрированной соляной кислоты .

Всегда осторожно вливайте кислоту в спирт, но не наоборот .

Раствор 5. Рабочий раствор метиленового синего по Леффлеру:

растворить 0,3 г хлорида метиленового синего в 100 мл дистиллированной воды .

Лабораторная работа – 22 Устройство и правила работы электронных весов .

Современные электронные весы - это надежное высокоточное многофункциональное устройство, которое позволяет определять вес предметов с наименьшей погрешностью. В отличие от устаревших механических моделей, электронные весы обладают рядом существенных преимуществ, среди которых - компактные габаритные размеры, простота в установке и последующей эксплуатации, высокая точность измерения, малое время взвешивания, широкий набор различных функций и опций .

Лабораторные весы обладают высокой точностью и предназначены для взвешивания легких и сверхлегких предметов в научно-производственных лабораториях любых предприятий, банках, ломбардах, ювелирных магазинах и мастерских .

По классу точности лабораторные весы можно разделить на аналитические весы (с дискретностью не более 0,1 мг) и прецизионные весы (с дискретностью от 1 г до 1 мг). Некоторые модели лабораторных весов снабжены множеством дополнительных функций, таких как гидростатическое взвешивание - определение плотности жидкостей и твердых тел, или динамическое взвешивание - взвешивание нестабильных предметов. Лабораторные весы могут отличаться по типу калибровки. Существует калибровка весов внешней гирей, внутренней гирей и автоматическая калибровка .

–  –  –

Калибровка весов Показания весов зависят от сил гравитации, поэтому калибровать весы необходимо непосредственно на месте их эксплуатации. Калибровку также рекомендуется проводить при длительном перерыве в работе весов, изменении условий эксплуатации (температуры, влажности и т, д), а так же если погрешность превышает допустимое значение .

Калибровка весов встроенной гири (только для весов серии HTR) Нажмите кнопку Cal На дисплее появится сообщение(A u t, CAL) .

Когда появится сообщения ( P u SH, С]. Нажмите Cal снова Включится механизм встроенной гири, и автоматически качнется калибровка. Показания дисплея будут меняться в следующем порядке:[A u t. CAL] [CH. O][CH.F S),[busy][End]. По окончании калибровки весы вернутся в нормальное состояние .

–  –  –

Особенности:

Класс точности лабораторных весов - высокий(II) по ГОСТ 24104-2001 .

В Госреестр средств измерений России весы лабораторные внесены под № 27766-04 .

Функциональные особенности весов Весы могут работать от сети или автономно .

Контрастный жидкокристаллический легкочитаемый дисплей (высота цифр 14 мм) .

Платформа весов изготовлена из нержавеющей стали .

Ветрозащитный колпак .

Устройство установки по уровню - ампула уровня и регулируемые по высоте ножки .

11 выбираемых единиц измерения массы .

Функция тарирования (обнуление массы тары во всём диапазоне взвешивания) .

Счетный режим (подсчет количества изделий, имеющих одинаковую массу) .

Режим автовыключения (обеспечивает сохранение заряда батарей, отключая автоматически питание весов, при их не использовании в течение заданного количества минут) .

Процентное взвешивание (осуществление измерений в процентном соотношении компонентов) .

Интерфейс RS-232С .

Источник питания: сеть 220В/50Гц через сетевой адаптер или 6 батареек АА-типа (до 1000 часов непрерывной работы) .

Рабочий диапазон температур: от -5 °С до +35 °C .

Влажность не более 85 % .

Масса весов: 1 кг .

Технические характеристики

–  –  –

Калибровка весов SCL 150

1. Нажмите РЕЖ и, удерживая, включите весы. На дисплее появится сообщение Count .

2. Нажмите РЕЖ ещё раз, на дисплее появится сообщение CAL .

3. Нажмите ЕД.ИЗМ, на дисплее появится сообщение CAL zro. Подождите несколько секунд

– идет процесс калибровки нуля. После завершения калибровки весы подадут звуковой сигнал. На дисплее появится сообщение 1/3g Span (значение 1/3 при мигании меняется на 2/3), эти значения определяют, какой вес будет использоваться при калибровке 1/3НПВ (50

г) или 2/3НПВ (100 г). Можно использовать и тот и другой вес, однако рекомендуется калибровать весы с использованием груза 2/3НПВ .

4. Положите калибровочный груз на весы (50 г или 100 г). После завершения на дисплее появится сообщение PASSspn .

5. Снимите калибровочный груз. Нажмите ¤ /СЧЕТ для сохранения в памяти результатов калибровки и возврата в режим взвешивания .

Лабораторная работа – 23 Приготовление питательных сред (МПА) .

Питательная среда – это стерильные смеси веществ, жидкие и плотные, применяемые для культивирования микроорганизмов и содержащие все необходимые для жизнедеятельности вещества .

Питательные среды применяются для выращивания микробов, выделения их в чистой культуре, изучения свойств микробов и для длительного сохранения свежевыделенных и производственных культур .

К обычным питательным средам, относятся МПА и МПБ которые применяются для выращивания и сохранения большинства микроорганизмов .

Состав среды МПА (мясопептонный агар)

1. Водопроводная вода – 1 л (1000 мл)

2. Пептон – 10 г

3. NaCl – 5 г

4. Агар-агар – 20 г

5. Глюкоза – 5 г

6. Мясной бульонный кубик – 2 шт МЕТОДИКА ПРИГОТОВЛЕНИЯ СРЕДЫ МПА (500 мл)

1. Отмерить цилиндром 500 мл водопроводной воды .

2. Отлить в стаканчик – 50 мл

3. Внести в колбу 450 мл воды

4. Взвесить 5 г пептона, 2,5 г натрия хлористого, 2,5 г глюкозы .

5. Внести в колбу с 450 мл воды, навеску пептона, навеску натрия хлористого

6. Содержимое колбы нагреть для полного растворения пептона .

7. Растворить в 50 мл воды бульонный кубик, слегка нагревая стаканчик с водой на плитке .

8. Внести в колбу растворенный мясной кубик .

9. Взвесить 10 г агар-агара .

10. После полного растворения пептона, внести агар-агар, продолжать нагревание, не допуская пригорания агара .

11. Среду кипятить при слабом нагревании 15-20 мин .

12. После полного растворения агар-агара, измерить рН с помощью лакмусовой бумаги или потенциометрическим методом. Установить слабощелочную реакцию (довести рН в среде до 7,2-7,4) с помощью 10 % р-ра HCl или 10 % р-ра NaOH .

13. Снять среду с плитки, внести навеску глюкозы .

14. Отфильтровать среду в две круглодонные колбы, примерно по 250 мл, через ватномарлевый фильтр .

15. Колбы закрыть ватными пробками и бумажными колпачками с надписью, простым карандашом, название и объем среды, ФИО лаборанта и дату .

16. Простерилизовать среду в автоклаве дробным методом при 0,8-1,0 атм в течение 30 мин .

Лабораторная работа – 24 Приготовление питательных сред (LB-бульон) .

LB-бульон – жидкая среда, которая применяются для глубинного выращивания большинства микроорганизмов .

LB-бульон – питательная среда Luria-Bertani, состоящая из импортных компонентов:

триптон 10 г/л дрожжевой экстракт 5 г/л натрий хлористый 5-10 г/л рН должен быть доведен до 7,2-7,4 LB-бульон – используется для культивирования микроорганизмов и получения биомассы клеток в большом количестве .

Автоклавирование при 1,2 атм в течение 30 мин .

LB-агар – агаризованная питательная среда Luria-Bertani (с добавлением агар-агар – 20 г/л), используемая для выращивания посевного материала из 1 колонии. Автоклавирование при 1,2 атм в течение 30 мин .

Типа LB-агар и LB-бульон – в которой произведена замена триптона на пептон (10 г/л), ввиду дороговизны триптона. Автоклавирование при 1,2 атм в течение 30 мин .

Для глубинного выращивания большинства микроорганизмов можно использовать и МПБ (мясопептонный бульон)

–  –  –

После автоклавирования рН в среде падает до 7,0-7,2 Лабораторная работа – 25 Определение рН в жидкой питательной среде .

рН среды – концентрация ионов Н+ в среде. Рост микроорганизмов, их морфология и физиологические свойства зависят от рН среды .

Для большинства бактерий оптимум рН 7,0–8,5 (слабощелочная среда). Плесневые грибы и дрожжи развиваются в кислой среде 6,8–5,4–4,5 .

Самым простым методом определения рН является определение с помощью лакмусовой бумаги (индикаторной бумаги) и прибором рН-метром .

pH-метр pH-410 предназначен для измерения активности ионов водорода (рН), окислительно-восстановительного потенциала (Eh) и температуры в растворах, питьевой воде, пищевой продукции и сырье, объектах окружающей среды и производственных систем контроля технологических процессов .

Прибор может использоваться в производственных (в т.ч. мясомолочной и хлебопекарной промышленности), клинико-диагностических, судебно-медицинских, научно-исследовательских лабораториях; стационарных и передвижных, в том числе полевых .

Устройство и работа 1 Принцип работы приборов основан на измерении разности потенциалов в электродной системе при контроле температуры раствора датчиком температуры .

2 Прибор состоит из преобразователя и электродной системы. Электродная система может включать измерительный и вспомогательный электроды или комбинированный электрод. Электронная плата внутри корпуса выполняет функции измерения поступающего сигнала, его усиления, преобразования, математической обработки, вывода выходного сигнала на дисплей .

3.1 Вспомогательный электрод - хлорсеребряный электрод с электрическим сопротивлением не более 20 кОм .

3.2 Измерительный электрод - стеклянный электрод с допускаемой величиной электрического сопротивления от 10 до 1000 мOм используют при измерениях pH .

Клавиши настройки и управления:

«On/Off» - включение/выключение прибора;

«» или «» - уменьшение или увеличение отображаемой величины в режиме калибровки;

«mV/pH» - включение отображения Eh или рН;

«CAL» - включение режима калибровки;

«ENTER» - подтверждение ввода запоминаемых параметров .

«T °С» - включения отображения на дисплее температуры измеряемого раствора;

ВНИМАНИЕ! Кнопки «» и «» используются только в режиме калибровки Выполнение измерений рН Датчик температуры и электроды погружают в измеряемую среду .

Нажатием клавиши «On/Off» включают прибор .

На дисплее прибора индуцируется результат измерения э.д.с. раствора в мВ = 180.7 mV Нажатием клавиши «mV/pH» выбирают режим измерений рН .

Проводят измерение .

Показания прибора - результат измерения в ед.рН отображается на дисплее. Результаты регистрируют после успокоения. = 5.85 рН

Довести рН в среде LB-бульон до 7,2-7,4 с помощью 10 % р-ра HCl или 10 % р-ра NaOH .

Режим калибровки преобразователя с электродной системой 1 Калибровку прибора выполняют по двум калибровочным растворам [ РТ1] и РТК2], значения рН которых находится вблизи нижней [РТ1] и верхней [РТ2] границ диапазона .

2 Калибровку следует производить по возможности чаще, а при смене измерительного электрода обязательно. Для проведения калибровки выполняют операции приведенные ниже .

–  –  –

Физиологический раствор (ФР) – изотонический раствор натрия хлористого 0,5 – 0,9 % NaCl (от вида микроорганизмов, обычно 0,85 %) – применяется для разведения, разбавления, смыва микроорганизмов .

Задание: Приготовить 100 мл физиологического раствора, рассчитать количество необходимых компонентов, взвесить их, растворить .

Довести рН в физ. р-ре до 7,2-7,4 с помощью 10 % р-ра HCl или 10 % р-ра NaOH .

–  –  –

К обычным питательным средам, помимо МПА и МПБ относятся РПА которые применяются для выращивания и сохранения большинства микроорганизмов .

РПА – рыбный питательный агар, сухой препарат, производства НПО «Питательные среды», г. Махачкала .

Состав:

гидролизат кильки – 17,9 г/л агар-агар – 11,2 г/л натрий хлористый – 5,9 г/л рН – 7,2-7,4

Способ приготовления: указан на банке:

35 г препарата размешать в 1 л дист. воды, в некоторых случаях для получения более плотной среды дополнительно вносят 8 г/л агар-агара, прокипятить до полного растворения агара, профильтровать горячим через вату, разлить по колбам, проавтоклавировать при 1,2 атм в течение 30 мин .

Для роста пекарских дрожжей – к среде РПА добавляют 10 г/л глюкозы, перед фильтрованием .

–  –  –

К дифференциально-диагностическим питательным средам относятся среда Сабуро, которая применяется для идентификации и изучения биохимических свойств микроорганизмов .

Среда Сабуро – питательная среда, используемая для выявления и культивирования плесневых грибов, дрожжей. Может быть готовым фабричным препаратом или приготовить эту среду легко по прописи .

Состав:

пептон – 10 г/л, глюкоза – 40 г/л и в зависимости от необходимости агар-агар – 20 г/л .

Применяется как в жидком, так и в плотном виде .

Автоклавирование при 0,8-1,0 атм в течение 30 мин .

Лабораторная работа – 29 Посев микроорганизмов в жидкую питательную среду с помощью микробиологической петли .

Культивирование микроорганизмов – это процесс роста и размножения клеток в питательных средах .

Культивируют м/о обычно в пробирках, колбах, чашках Петри в жидких и на плотных питательных средах .

Жидкие питательные среды предназначены для:

1. Получения большого количества микробиологической массы

2. Изучения их ферментативных свойств и других сторон физиологической деятельности

3. Получения посевного материала Основной прием при культивировании культуры – посев. Необходимо строго соблюдать условия стерильности, которые предохраняют культуру от загрязнения другими м/о .

Для пересева культуры с одной среды на другую пользуются бактериологической (м/б) петлей. Петля представляет собой тонкую проволоку из платины или нихрома, прикрепленную к металлическому держателю. Конец проволоки загибают в виде кольца (d =2 мм), которым и захватывают небольшое количество м/о .

Петлю обязательно стерилизуют в пламени спиртовки, прокаливая до красна петлю, проволоку и обжигая примыкающую к ней часть держателя до отбора м/о и после посева. Петлю необходимо немного остудить перед отбором м/о .

М/о на жидкие питательные среды с помощью м/б петли высевают следующим образом:

соблюдая все меры стерильности и осторожности, берут посевной материал и вносят в пробирку со стерильной средой, растирают м/б петлей клетки на стенки пробирки, слегка касаясь среды и смывают средой. Засеянные пробирки встряхивают и ставят в термостат с нужной температурой в штативе или в слегка наклонном положении .

а, е – стерилизация петли; б – стерилизация краев пробирки;

в, г – взятие и посев материала; д – закрывание пробирок пробками Рисунок – Пересев микроорганизмов из пробирки в пробирку Лабораторная работа – 30 Посев микроорганизмов на плотную питательную среду с помощью микробиологической петли .

Плотные питательные среды предназначены для:

1. Выделения культуры в чистом виде

2. Хранения культуры

3. Количественного учета живых форм м/о в исследуемом материале

4. Описания их характера из культуральных признаков по характеру образуемых колоний

5. Получения посевного материала

6. Получения некоторого количества биомассы М/о на плотные питательные среды с помощью м/б петли высевают глубинными и поверхностными методами .

При поверхностном методе высевают м/о штрихом на поверхность застывшей агаризованной питательной среды .

При глубинном посеве делают укол в столбик застывшей агаризованной питательной среды .

Если стоит задача получения микробной массы – для этого м/о высевают сплошным слоем, т.е. газоном .

Если стоит задача получения культуры в чистом виде – для этого используют методы посева, дающие на чашках отдельные изолированные колонии .

Методы посева на плотные среды для получения:

Газона Отдельных колоний

1. Поверхностный посев обычным штрихом 1. Поверхностный посев истощающимся

2. Глубинный посев прокалыванием столбика штрихом

2. Поверхностный посев обычным штрихом сильно разбавленной суспензии Посев уколом Существует много методов посева штрихом в чашки с твердыми средами («штрихованные чашки») .

Посев проводят истощающимся штрихом, используя бактериологическую петлю .

Удобный метод посева штрихом в чашки для получения отдельных колоний .

А. Для маркировки на обратной стороне чашки Петри карандашом наносят букву Т, разделяющую дно на 3 сектора .

Б. Петлей с культурой зигзагом наносят штрихи на поверхности агара в секторе 1, как показано на рисунке .

Для этого крышку чашки сначала приподнимают, а после нанесения штриха сразу закрывают. Петлю стерилизуют в пламени и дают ей остыть (15 с). В. Проводят петлей по поверхности среды в секторе 1, как показано на рисунке, и затем немедленно наносят ею зигзагом штрихи на поверхности среды в секторе 2. Прогревают петлю в пламени и дают ей остыть .

Г. Проводят петлей по поверхности среды в секторе 2, как показано, и затем наносят ею зигзагом штрихи на поверхности среды в секторе 3 .

Д. Инкубируют опрокинутые вверх дном чашки, как показано на рисунке, для того, чтобы конденсирующаяся вода с крышки не попала на поверхность агара. В секторе 1 вырастает большое число колоний, тогда как в секторах 2 и 3 появляются отдельные хорошо изолированные колонии .

Лабораторная работа – 31 Ознакомление с методом посева микроорганизмов с помощью градуированной пипетки .

Пипетки подразделяют на следующие типы:

1. Градуированные пипетки, вымеряемые на слив жидкости от верхней нулевой отметки до любой отметки. Нижняя отметка соответствует номинальной вместимости. Такие пипетки могут быть 1-го и 2-го классов. Время ожидания не устанавливается (пипетки типа 1 ГОСТ 29228) .

2. Градуированные пипетки, вымеряемые на слив жидкости от любой отметки до сливного кончика. Верхняя отметка соответствует номинальной вместимости. Такие пипетки могут быть 1го и 2-го классов. Время ожидания не устанавливается (пипетки типа 2 ГОСТ 29228) .

3. Градуированные пипетки, вымеряемые на слив жидкости от верхней нулевой отметки до любой отметки. Нижняя часть сливного кончика соответствует номинальному объему. Пипетки 2го класса. Время ожидания не устанавливается (пипетки типа 3 ГОСТ 29228) .

4. Градуированные пипетки, вымеряемые на слив жидкости от верхней нулевой отметки до любой отметки. Нижняя часть сливного кончика соответствует номинальному объему. Пипетки 1го класса. Время ожидания - 15 с (пипетки типа 4 ГОСТ 29229) .

5. Градуированные пипетки, вымеряемые на слив жидкости от любой отметки до сливного кончика. Верхняя отметка соответствует номинальной вместимости. Пипетки 2-го класса .

Последняя капля (в пипетке) выдувается (выдувные пипетки - пипетки типа 5 по ГОСТ 29230) .

Градуированные пипетки должны быть изготовлены из стекла, обладающего необходимой химической и термической стойкостью. Изделия должны иметь как можно меньше видимых дефектов. Внутреннее напряжение стекла должно быть сведено до необходимого уровня .

Нижняя часть пипетки должна заканчиваться сливным кончиком. Поверхность сливного кончика должна быть гладкой и иметь форму конуса без значительных сужений канала, которые могут привести к турбулентности потока жидкости .

Оцифровка отметок в зависимости от цены наименьшего деления шкалы должна соответствовать указанной в таблице .

Номинальная вместимость Цена наименьшего деления Оцифровка через каждые шкалы 1,0 0,01 0,1 2,0 0,02 0,2 5,0 0,05 0,5 10,0 0,1 1,0 М/о на жидкие питательные среды с помощью градуированной пипетки высевают следующим образом: соблюдая все меры стерильности и осторожности, берут стерильную градуированную пипетку, отбирают необходимое количество посевного материала (КЖ) и вносят в пробирку со стерильной средой, выдувают с помощью резиновой груши клетки на стенки пробирки, слегка касаясь среды и смывают средой. Засеянные пробирки встряхивают и ставят в термостат с нужной температурой в штативе или в слегка наклонном положении .

Культуральную жидкость отбирают пипеткой с расчетом минимального выброса.

Если необходимо отобрать 0,5 мл КЖ, то:

пипеткой типа 1 на 1,0 мл – набирают до 0,5 и спускают до 1,0 мл пипеткой типа 1 на 2,0 мл – набирают до 1,5 (средняя отметка между 1,4 и 1,6) и спускают до 2,0 мл Схема градуировки 8.4.1. Для пипеток с ценой наименьшего деления шкалы 0,01 и 0,1 см:

а) каждая десятая отметка - длинная;

б) между двумя последовательными длинными отметками - одна средняя отметка;

в) между двумя последовательными средней и наибольшей отметками - четыре коротких .

8.4.2. Для пипеток с ценой наименьшего деления шкалы 0,02 и 0,2 см:

а) каждая пятая отметка - длинная отметка;

б) между двумя последовательными длинными отметками - четыре коротких .

8.4.3. Для пипеток с ценой наименьшего деления шкалы 0,05 см:

а) каждая десятая отметка - длинная;

б) между двумя последовательными длинными отметками - четыре средние отметки;

в) между двумя последовательными средними или средней и длинной отметками - одна короткая .

Лабораторная работа – 32 Посев микроорганизмов на плотную питательную среду с помощью градуированной пипетки .

М/о на плотные питательные среды с помощью градуированной пипетки высевают глубинными и поверхностными методами .

При поверхностном методе высевают м/о на поверхность застывшей агаризованной питательной среды и растирают шпателем .

При глубинном посеве делают посев на дно чашки Петри и сверху заливают расплавленной и охлажденной до 45 0С агаризованной питательной средой .

Два варианта глубинного посева

Метод однослойного агара Метод двухслойного агара Культуру вносят непосредственно в чашку В чашку наливают тонкий слой среды и дают Петри и заливают охлажденной до 45 0С ему застыть. Культуру вносят на первый слой и заливают охлажденной до 45 0С агаризованной питательной средой .

агаризованной питательной средой .

Поверхностный способ посева Стерильную твердую питательную среду расплавляют на водяной бане в колбе и охлаждают до температуры 50 °С .

В боксовом помещении, вынимают чашки Петри из бумаги, в которой они стерилизовались, и ставят их на ровную горизонтальную поверхность .

Берут колбу с охлажденной до температуры 50 °С питательной средой, вынимают ватную пробку, обжигают на пламени горелки края пробирки и держат ее в наклонном положении .

Приоткрывают крышку чашки Петри левой рукой, а правой рукой наливают среду на дно чашки Петри, заполняя всю ее поверхность .

Оставляют чашку Петри на столе до полного застывания среды, затем ставят в термостат на 15…20 мин для подсушивания или оставляют открытыми в течение 1 ч под УФ-лампами .

Посев на чашки с агаром производят втиранием стеклянным или металлическим шпателем .

На поверхность агарв вносят градуированной пипеткой олпределенный объем КЖ с м/о (объем зависит от густоты посевного материала). При посеве шпателем его вынимают из бумаги и берут в правую руку. Приоткрывают крышку чашки Петри левой рукой и вносят в нее шпатель .

Размазывают каплю посевного материала шпателем вращательными движениями по поверхности агаровой пластинки .

Надавливать шпателем на твердую среду не следует, так как можно ее повредить. Шпатель стерилизуют в пламени спиртовки, предварительно обмакнув его в 96 % этиловый спирт .

Лабораторная работа – 33 Посев микроорганизмов на плотную питательную среду с помощью автоматической пипетки .

М/о на плотные питательные среды с помощью автоматической пипетки высевают глубинными и поверхностными методами. Все операции такие же как при высеве градуированной пипеткой, где минимальный объем 0,1 мл (100 мкл), а при посеве автоматической пипеткой количество посевного материала может быть от 1 мкл .

Лабораторная работа – 34 Анализ воздуха на микробиологическую обсемененность .

Воздух является неблагоприятной средой для развития микроорганизмов, однако, они находятся в нем постоянно. Частые обитатели атмосферы – дрожжи, грибы, споровые палочки, пигментные и патогенные микроорганизмы (м/о), попадающие в воздух с пылью .

Воздух производственных помещений постоянно проверяется на наличие микрофлоры .

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.2.2942-11 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ .

БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. МЕТОДЫ САНИТАРНОБАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ,

ВОЗДУХА И КОНТРОЛЯ СТЕРИЛЬНОСТИ В ЛЕЧЕБНЫХ ОРГАНИЗАЦИЯХ

Исследования бактериальной обсемененности воздушной среды проводят в помещениях лечебных организаций в зависимости от их функционального назначения на санитарномикробиологические показатели:

- общее количество микроорганизмов в 1 куб. м воздуха (КОЕ/куб. м);

- количество колоний S.aureus в 1 куб. м воздуха (КОЕ/куб. м);

- количество плесневых и дрожжевых грибов в 1 куб. м воздуха .

Для определения общего количества микроорганизмов в 1 куб. м воздуха забор проб проводят на питательный агар типа МПА, СПА, ГРМ-агар и другие, приготовленные согласно инструкциям по применению. Посевы инкубируют при температуре 37 °С в течение (48 +/- 2) ч, подсчитывают количество выросших колоний и производят перерасчет на 1 куб. м воздуха. При наличии роста колоний дрожжевых и плесневых грибов их подсчитывают и делают пересчет на 1 куб. м воздуха. В протоколе количество дрожжевых и плесневых грибов указывают отдельно .

Помещению присваивается статус стерильного (нет микроорганизмов), класса А (например, операционная, 500 колониеобразующих единиц), Б, В и Г .

Определение микрофлоры воздуха производится по методу Коха. Этот метод основан на принципе оседания микроорганизмов под действием силы тяжести на горизонтальную поверхность стерильной питательной среды в чашке Петри .

Суть метода:

1. Расплавляют на электроплитке питательные среды МПА и РПА до крупной пены, охлаждают до 45-50 0С .

2. Соблюдая стерильность, охлажденные МПА и РПА разливают в стерильные чашки Петри. Горло колбы обжигают на пламени спиртовки. Крышку чашки сдвигают и помещают рядом, вносят на дно стерильной чашки Петри по 25-30 мл среды, это на толщину около 0,5 см. Дают возможность застыть на ровной поверхности стола в боке в течение 60 мин при включенных лампах УФ-света .

3. Для заражения, чашки Петри застывшим агаром, открывают в исследуемом помещении или на улице на 5-20 мин, в зависимости от предполагаемого загрязнения воздуха .

Крышку чашки Петри снимают и переворачивая, ставят рядом .

4. По истечении определенного времени, зараженные чашки Петри закрывают крышкой и помещают в термостат при температуре 25-28 0С .

5. Через 2-3 суток подсчитывают число колоний микроорганизмов, развившихся на агаровой пластинке чашки Петри .

6. Находят площадь чашки Петри по формуле: S =. r2

7. Определение обсеменённости воздуха производятся по формуле:

k. 100 см2. 5 мин. 1000 л А = ----------------------------------S. замин. 10 л где: А – количество микроорганизмов в 1 м3 воздуха;

k – среднее количество колоний на чашке;

S – площадь чашки;

замин – время, то количество минут (от 5-20 мин), на которое открывали чашку .

Принято считать, что в 1 м3 воздуха содержится столько микроорганизмов, сколько их оседает на площади 100 см2 за 5 мин из 10 л воздуха .

Критериями для оценки чистоты воздуха служат такие показатели:

Операционные до начала работы - не более 500 м/о в 1 м3 Операционные во время работы - не более 1000 м/о в 1 м не более 1000 м/о в 1 м3 Родильные комнаты Палаты для недоношенных детей - не более 750 м/о в 1 м3

В учебных заведениях:

Оценка воздуха Летний режим Зимний режим количество м/о в 1 м3 количество м/о в 1 м3 Чисто до 1500 до 4500 Условно чисто 1500-2500 4500-7000 Грязно свыше 2500 свыше 7000 Содержание микроорганизмов в воздухе зависит от времени года. Воздух закрытых помещений зимой богаче микроорганизмами, чем летом, т.к. зимой человек проводит большую часть в помещении, чем летом .

Для уменьшения количества микроорганизмов в воздухе необходимо:

систематически проветривать помещение;

проводить ежемесячную тщательную влажную уборку и дезинфекцию помещения;

проводить своевременную окраску, побелку стен и потолка;

территория должна содержаться в чистоте, озеленена, дороги асфальтированы .

Лабораторная работа – 35 Отбор и приготовление проб к проведению анализов на микробиологическую обсемененность жидких объектов окружающей среды .

Отбор проб производится в соответствии с требованиями ГОСТ Р 51592-2000 «Вода .

Общие требования к отбору проб» .

1. Подготовка посуды для отбора проб и анализа Используется полиэтиленовая посуда, а при наличии в воде нефти, углеводородов, моющих средств и пестицидов используются банки из темного стекла .

Посуда для отбора проб и анализа должна быть химически чистой. Она промывается смесью бихромата калия и серной кислоты (хромовой смесью), тщательно водопроводной водой, затем 3 - 4 раза дистиллированной водой. Не разрешается пользоваться поверхностно-активными веществами и органическими растворителями .

Посуду для отбора проб сушат на воздухе, а используемую для анализа, за исключением мерной, сушат в сушильном шкафу при 160 °С в течение 1 часа. Запрещается сушить колбы на колышках. Сосуды для отбора проб должны быть четко промаркированы .

Колбы для инкубации на определение БПК (биологическое потребление кислорода) объемом 250 мл должны быть откалиброваны с точностью до 0,1 мл. Колбу тщательно моют, высушивают (снаружи и изнутри) и взвешивают вместе с пробкой на технических весах с точностью до 0,01 г. Затем наполняют ее дистиллированной водой до краев и закрывают стеклянной пробкой так, чтобы под пробкой не оставалось пузырьков воздуха. Обтирают склянку досуха и снова взвешивают с точностью до 0,01 г .

Разность в весе даст массу воды в объеме склянки, которую для перевода на объем следует разделить при температуре воды 15 °С - на 0,998, при 20 °С - на 0,997 и при 25 °С - на 0,996 .

Химически чистая посуда для определения БПК должна храниться с закрытыми стеклянными притертыми пробками или завинчивающимися крышками .

2. Отбор проб

2.1. Для отбора глубинных проб воды из озер, водохранилищ, прудов и рек следует использовать батометры системы Молчанова, Рутнера или Скадовского-Зернова .

Для отбора проб поверхностных пресных вод с глубины не более 0,5 м используется бутыль с привязанной пробкой, которую помещают в футляр или пробоотборник с грузом. Футляр снабжен петлей, к которой привязывают веревку с размеченными отрезками, указывающими глубину погружения. На требуемой глубине, с помощью привязанной к пробке веревки выдергивают пробку из горла бутыли. После заполнения бутыли водой (на поверхности воды не появляются пузырьки воздуха) ее поднимают на поверхность .

2.2. Пробы сточной воды с глубины 0,5 м отбираются пробоотборником любого типа .

2.3. Отбор природных и сточных вод следует производить в местах наибольшего перемешивания .

2.4. На очистных сооружениях отбирать пробы для анализа на БПК следует до системы хлорирования, т.к. активный хлор является мешающим определению веществом. Если необходимо проанализировать пробу после хлорирования, следует удалить из исследуемой воды свободный хлор .

2.5. При взятии проб измеряют температуру воды. Для этого используют термометр от 0 до 100 °С, 2-го класса точности по ГОСТ 28498. Для определения температуры на месте взятия пробы, 1 л воды наливают в склянку, нижнюю часть термометра погружают в воду и через 5 мин отсчитывают показания, держа его вместе со склянкой на уровне глаз. Точность определения ±0,5 °С .

2.6. Не допускается консервирование проб, предназначенных для определения в них БПК .

2.7. Отобранные пробы наливают, предварительно ополаскивая отбираемой водой, в банки или флаконы объемом 1,5 л, заполняя их до краев и закрыв без пузырей воздуха пришлифованными стеклянными пробками или полиэтиленовыми крышками. Под полиэтиленовые крышки подкладываются тефлоновые или из алюминиевой фольги прокладки .

Пробы упаковываются в деревянные ящики для переноски проб и прокладываются бумагой или ветошью .

При транспортировке не держать пробы на свету .

2.8. При отборе пробы составляется протокол по утвержденной форме, в котором указывается цель пробоотбора, число, время, место отбора пробы, температура воды, предполагаемые загрязняющие вещества, номер пробы, ФИО отбиравшего. На бутыль наклеивается этикетка с указанием номера пробы, места и даты отбора .

2.9. Для анализа воды на микробиологическую обсеменность используют стерильную посуду, отбирают в асептических условиях, не допуская кантоминации (не внести из воздуха микроорганизмов) .

3. Хранение проб Необходимо анализировать пробы тотчас же после отбора. В том случае, если обработать пробу сразу после отбора невозможно, ее следует хранить не более 24 часов при температуре 4 °С .

4. Предварительная обработка пробы БПК определяют в натуральной (взболтанной) пробе при осуществлении экоаналитического контроля за соблюдением нормативов качества .

БПК определяют в отстоянной и фильтрованной пробе при осуществлении производственного контроля за эффективностью технологического процесса очистки сточных вод на разных стадиях .

4.1.Определение в натуральной (взболтанной) пробе. В лаборатории перед началом определения проба тщательно перемешивается (с помощью встряхивающего аппарата или вручную) .

4.2.Определение после отстаивания. Проба отстаивается в цилиндрах в течение 2 часов .

Сифоном отбирают в бутыль для анализа верхние 3/4 прозрачного слоя жидкости над осадком, не захватывая взмученный осадок .

4.3.Определение в фильтрованной пробе. Проба тщательно перемешивается и фильтруется через обеззоленный фильтр «синяя лента» .

4.4. Для проверки воды на микробиологическую обсеменность необходим быстрый анализ, с учетом высева на разные питательные среды и разные температуры культивирования .

Лабораторная работа – 36 Анализ воды на микробиологическую обсемененность .

Степень загрязненности водоемов органическими веществами и наличие в них микроорганизмов соответствует определенным зонам сапробности .

Для экологической характеристики загрязнения водоемов введены понятия трех зон сапробности:

1. Олигосапробная – содержит небольшое количество органических веществ и мало бактерий от 10 до 1000 в 1 мл. В этой зоне происходят процессы окисления нитритов и нитратов, соединений железа двухвалентного (Fe+2) в трехвалентное (Fe+3) .

2. Мезосапробная – зона более загрязненной воды, где происходит распад белков и углеводов. Количества бактерий в 1 мл этой воды достигает 100 000 (1х105) .

3. Полисапробная – зона сильнейшего загрязнения, где резко выражены гнилостные процессы анаэробного типа. Число бактерий в ней доходит до 1 млн. и более в 1 мл .

Количественный учет бактерий (обсемененность) в воде дает возможность определить её чистоту .

В качестве твердой питательной среды используют стерильные МПА, РПА или Эндо-агар .

Для исследования в стерильные колбочки или пробирки берут водопроводную, воду из открытого водоема или любую исследуемую воду в объеме 5-10 мл и закрывают их стерильными ватно-марлевыми пробками. Пробы воды хранят при температуре не выше +4 0С и не более 3-х часов .

Для количественного учета необходимо исследуемую воду (загрязненную) развести .

Разведения производят следующим образом:

Готовят ряд пробирок с 4,5 мл стерильной водопроводной воды. Пробирки нумеруют .

Стерильной пипеткой берут 0,5 мл исследуемой воды и вносят в пробирку № 1 (с 4,5 мл стерильной водопроводной воды), обжигая при этом пробку и горло пробирки в пламени спиртовки (разведение 1 это 1:10) .

Берут новую стерильную пипетку, перемешивают содержимое пробирки № 1 путем продувания воздуха, отбирают 0,5 мл и переносят в пробирку № 2 (разведение 2 то 1:100) .

И так далее из пробирки № 2 в пробирку № 3 (разведение 3 это 1:1000) .

Воду из водопровода и артезианских колодцев можно исследовать без разведения .

Воду открытых водоемов следует разводить не менее чем до 1:1000 .

Из пробирки последнего разведения после перемешивания воды, микроорганизмы высевают одним из следующих способов:

1. Методом поверхностного посева. В стерильную чашку Петри выливают расплавленную на электроплитке и охлажденную МПА в количестве 25-30 мл, чашку закрывают и дают пластинке застыть. На дне чашки делают надпись: какая вода, какое разведение, какое количество, фамилию. Затем из пробирки последнего разведения, стерильной пипеткой берут 0,2 мл воды, приподнимают крышку чашки, выливают на поверхность агара воду из пипетки, не касаясь кончиком агара. Берут стеклянный шпатель, обмакивают его в 96 % спирт, обжигают в пламени спиртовки, слегка охлаждают от агар, где нет капли воды и тщательно растирают воду по поверхности агара. Чашку закрывают, а шпатель обмакивают его в 96 % спирт, обжигают в пламени спиртовки. Дают возможность воде впитаться в агар, чашку переворачивают вверх дном (чтобы избежать конденсации паров воды на крышке) и помещают в термостат при температуре 22-25 0С .

2. Методом однослойного агара. На дне чашки делают надпись: какая вода, какое разведение, какое количество, фамилию. 1 мл воды из пробирки последнего разведения, стерильной пипеткой выливают на дно стерильной чашки Петри и сверху заливают расплавленной и охлажденной питательной средой (около 20-30 мл), температура которой не должно превышать 45 0С. Чашку закрывают и осторожными круговыми движениями и покачиванием перемешивают воду с агаризованной питательной средой, чтобы равномерно распределить по дну чашки. Дают возможность среде с агаром застыть в течение 20 мин, чашку переворачивают вверх дном (чтобы избежать конденсации паров воды на крышке) и помещают в термостат при температуре 22-25 0С .

3. Методом двухслойного агара. В стерильную чашку Петри выливают расплавленную на электроплитке и охлажденную МПА в количестве 10-15 мл, чашку закрывают и дают пластинке застыть. На дне чашки делают надпись: какая вода, какое разведение, какое количество, фамилию. Из пробирки последнего разведения, стерильной пипеткой берут 1 мл воды и вносят в пробирку со стерильной расплавленной средой, температура которой не должно превышать 45 0С .

Закрыть пробирку пробкой, быстро перемешать её содержимое, вращая пробирку между ладонями и выливают содержимое пробирки на застывшую поверхность питательного агара в чашку Петри .

Чашку закрывают и осторожно наклоняя, разравнивают внесенное по всей поверхности, дают пластинке застыть в течение 20 мин, чашку переворачивают вверх дном (чтобы избежать конденсации паров воды на крышке) и помещают в термостат при температуре 22-25 0С .

Последний способ обеспечивает наиболее лучшее размешивание исследуемой воды с питательной средой .

Повторность посева должна быть не менее трехкратной .

Через 3-5 суток развившиеся в чашке Петри колонии подсчитывают и определяют количество бактерий в 1 мл воды (среднее количество колоний умножают на разведение) .

Формула расчета количество бактерий в 1 мл воды:

Кср х 10Р ОБ = -------------------V где: ОБ – обсемененность или количество бактерий в 1 мл воды Кср – среднее количество колоний в чашке, кл .

Р – высеваемое разведение положительным знаком показателя V – высеваемый объем на чашку, мл Кср = (К1 + К2 + К3) : 3, если находят среднее по трем чашкам ОБср = (ОБ1 + ОБ2 + ОБ3) : 3, если находят среднее по трем разведениям

Данные исследования можно оформить в виде таблицы:

Исследуемая Среда Разведение Высеваемый Количество Обсемененность вода объем колоний на или количество чашках бактерий в 1 мл воды Номер Разбавление 1 2 3 среднее без 1 1:10 2 1:100 3 1:1000 ОБср Лабораторная работа – 37 Отбор и приготовление проб к проведению анализов на микробиологическую обсемененность твердых объектов окружающей среды .

Алгоритм

1. Выбор объекта

2. Подготовка тары

3. Взятие пробы

4. Транспортировка и хранение пробы

5. Подготовка пробы к анализу

6. Перевод твердой пробы в жидкую, измельчение

7. Тщательное суспендирование

8. Приготовление разведения

9. Высев на соответствующие питательные среды

10. Маркировка чашек, пробирок (место отбора, объект, дата, время, ФИО)

11. Подращивание в термостате при соответствующих температурах

12. Учет выросших колоний, расчеты

13. Заполнение протокола Лабораторная работа – 38 Анализ почвы на микробиологическую обсемененность .

Почва является благоприятной средой для развития и накопления многих видов бактерий, грибов, простейших и вирусов. Это обусловлено тем, что в почве сосуществуют одновременно лито-, гидро- и атмосфера в виде твердой органно-минеральной части, почвенного раствора и газов. В ней протекают одновременно противоположные биологические процессы – синтез и распад веществ, окисление и восстановление, развитие аэробных и анаэробных микроорганизмов и др .

Состав почвенного раствора определяет рост, размножение и метаболизм микроорганизмов. В почве обитает большое количество автотрофных микроорганизмов, способных синтезировать органические вещества (фотоавтотрофы – ассимилируют СО2, серобактерии, железобактерии, водород- и метаноокисляющие бактерии). Большинство микроорганизмов в почвах располагаются в микроочагах, в зависимости от состава органических веществ, а также от взаимоотношений между микроорганизмами .

Наибольшее количество микроорганизмов обитает в верхнем 10-сантиметровом слое почвы, богатом органическими остатками. На поверхности корней и в прикорневой зоне (ризосфере) сосредоточено огромное количество микроорганизмов. Количество грибов в почве значительно меньше (0,5 – 0,8 % от общего числа), но в кислых почвах – до 3 % .

Роль почвенных микроорганизмов в природе чрезвычайно велика: они снабжают растения питательными веществами, витаминами и минеральными веществами, обеспечивают круговорот веществ, выделяют в атмосферу СО2, освобождают почву от токсичных веществ и т.д .

Бактериологическое исследование почвы включает:

1. определение общего количества сапрофитных микроорганизмов;

2. определение количества микробов различных физиологических групп (аммонифицирующих, азотфиксирующих и др.);

3. определение микробов-антагонистов и выявление их активности;

4. определение санитарно-показательных микробов (кишечной палочки) .

При специальных эпидемиологических и эпизоотологических обследованиях проводят определение в почве патогенных микроорганизмов .

Для бактериологического исследования почву берут в стерильные мешочки из синтетической ткани или в стеклянные банки с притертой пробкой. Пробы берут с помощью стерильной ложечки, совочка или ножа. Для взятия проб из глубины пользуются специальным буром Френкеля. Бактериологическое исследование почвы проводят в день взятия образцов .

Определяют микробное число – общая микробная обсемененность, это общее количество микроорганизм в 1 г почвы .

Ход работы:

Из каждого образца почвы, подлежащих бактериологическому исследованию, берут навески по 1 г, помещают их в колбу с стерильным изотоническим (ФР) раствором хлорида натрия (100 мл), это разведение 1:100 (102). Содержимое колбы энергично встряхивают в течение 3-5 мин до получения равномерной взвеси. Приготовленную таким образом гомогенную смесь оставляют на 5 мин при комнатной температуре .

Готовят несколько разведений взвеси почвы. Из последних разведений высевают по 0,1 мл на питательные среды в чашки Петри. В качестве твердой питательной среды используют стерильные МПА, РПА или Сабуро .

–  –  –

Рис. 1. Приспособления для взятия проб почвы: а – бур Некрасова; б – бур Френкеля; в – щуп Рождественского .

Лабораторная работа – 39 Анализ смыва с рук на микробиологическую обсемененность .

Смывы с оборудования и инвентаря производят перед началом работы либо после санитарной обработки в санитарные дни .

Смывы с рук следует производить перед началом работы, после пользования туалетом .

Взятие смывов с рук персонала, спецодежды, инвентаря и оборудования производят с помощью стерильных ватных тампонов на стеклянных (лучше металлических) палочках или марлевых салфеточек размером 5 x 5 см, завернутых в бумажные пакеты .

Непосредственно перед взятием смыва увлажняют тампон или салфетку стерильной 0,1 % пептонной водой или физиологическим раствором, предварительно разлитым по 5 мл в стерильные пробирки или чашки Петри .

Салфетки при этом захватывают прокаленным пинцетом. После взятия смыва тампон или салфетку помещают в ту же пробирку или чашку Петри, из которой проводили увлажнение. При контроле жирных поверхностей пользуются сухими тампонами или салфетками .

Смывы с крупного оборудования и инвентаря берут с поверхности в 100 см2 в разных местах исследуемого предмета. Для ограничения поверхности используют шаблон (трафарет) площадью 25 см2 .

При взятии смывов с мелких предметов обтирают всю рабочую поверхность предмета, причем одним тампоном протирают три одноименных объекта (например, три ложки); у ножей протирают рабочую часть их и нижнюю часть ручки (примерно наполовину) .

При взятии смывов с рук протирают тампоном ладони обеих рук, проводя не менее 5 раз по одной ладони и пальцам, затем протирают участки между пальцами, ногти и под ногтями .

При взятии смывов с санитарной одежды протирают 4 площадки по 25 см 2: нижнюю часть каждого рукава и 2 площадки с верхней и передней части спецовки .

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ СМЫВОВ:

Материалом посева при исследовании смывов является смывная жидкость, используемая для увлажнения тампона или марлевой салфетки .

Смывы с рук и оборудования анализируют не реже одного раза в неделю в каждой смене на обнаружение бактерий группы кишечной палочки и определение наличия коагулазоположительных стафилококков .

а) Для выявления наличия коагулазоположительных стафилококков производят посев непосредственно тампоном на чашки с молочно - солевым агаром. Если смывы производят марлевыми салфетками, то посев на плотные питательные среды удобнее осуществлять нанесением на поверхность среды в количестве 0,1 мл смывной жидкости, которую затем тщательно растирают шпателем по всей поверхности агара .

В качестве среды накопления для стафилококков применяют солевой питательный бульон с 6,5 % хлористого натрия, разлитым по 5 мл в пробирки, куда помещают оставшуюся смывную жидкость .

б) Для выявления наличия бактерий группы кишечных палочек посев производят посев на среду Эндо нанесением на поверхность среды в количестве 0,1 мл смывной жидкости, которую затем тщательно растирают шпателем по всей поверхности агара .

Или осуществляют посев в среду накопления, для чего тампон, которым производили ранее посев на молочно - солевой агар (или марлевую салфетку), погружают в среду Кесслер, разлитую в пробирки по 5 - 10 мл .

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ:

1. Молочно - солевой агар: к 100 мл стерильного мясопептонного агара, содержащего 6,5 % поваренной соли, добавляют 10 мл снятого стерильного молока, pH 7,4 .

2. Снятое молоко: молоко центрифугируют, удаляют сливки, разливают в пробирки по 5,0 и 10,0 мл и стерилизуют при 121 град. 10 минут .

3. Солевые питательные бульоны: к 100 мл мясопептонного бульона, pH 7,4 добавляют 6,5 % поваренной соли. Разливают в по 5 мл. Стерилизуют при 121 град. 20 минут .

4. Среда Кесслер (модифицированная): к 1 литру воды добавляют 10 г пептона и 50 мл бычьей желчи или других сельскохозяйственных животных. Кипятят при помешивании 20 - 30 минут, фильтруют через вату, прибавляют 2,5 г глюкозы, объем доводят до 1 литра, устанавливают pH 7,4 - 7,6, добавляют 2 мл 1 % водного раствора кристаллического фиолетового, разливают по 5 – 10 мл в пробирки с поплавками. Стерилизуют при 121 град. 15 - 20 минут. Готовая среда должна иметь темно - фиолетовый цвет .

5. Среда Эндо .

6. Среда МПА .

Коагулазоположительные стафилококки – это патогенные кокки, способные вызывать образование гноя (некроза тканей), содержат фермент коагулазу, которая коагулирует плазму крови, гемолиз эритроцитов .

Заболевания, вызываемые стафилококками:

1. Фурункулы, карбункулы, панариции, абсцессы .

2. Воспалительные процессы различных органов и тканей: ангины, циститы, пиелиты, остеомиелиты, холециститы, маститы и т.п. .

3. Вторичные инфекции при заболеваниях, осложнения при ранениях и т.д .

4. Сепсис и септикопиемия .

5. Пищевые токсикоинфекции .

Основными воротами стафилококковой инфекции является поврежденная кожа и слизистая оболочка .

Культуральные свойства: на МПА колонии стафилококка выпуклые, круглые, блестящие, с ровными краями, диаметр их 2-2,5 мм. Колонии имеют различный цвет – золотистый, лимонножелтый, белый, что зависит от образования пигмента .

Задание для самостоятельной работы:

Провести определение общего микробной обсемененности рук определить наличие бактерий группы кишечной палочки определить наличие коагулазоположительных стафилококков

1. Приготовить среду Эндо .

2. Расплавить колбы с МПА и молочно-солевым агаром .

3. Приготовить чашки Петри с питательными средами .

Внести в стерильную пробирку 5 мл стерильного физ.раствора .

4 .

Приготовить смыв с рук .

5 .

Сделать надписи на дне чашки: фамилию какая среда и какое количество .

6 .

Провести высев нужного количества смыва (по 0,2 мл) на поверхность застывшего агара, 7 .

растирая шпателем Дригальского до полного втирания в агар .

Поставить чашки в термостат при температуре 37 0С на 48 часов .

8 .

Опишите полученные колонии, подсчитайте и запишите результаты .

9 .

РЕЗУЛЬТАТЫ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ СМЫВОВ С РУК

за _____________________ 20___ г .

Количество смывов с рук – Общая микробная обсемененность на среде МПА: – (расчет по формуле ОМО = К х 5 мл : 0,2 мл) Выделено наличие бактерий группы кишечных палочек на среде Эндо: – (На среде Эндо E.coli – дает колонии с металлическим блеском, вокруг которых среда краснеет вследствие образования кислоты, или розовые колонии с темно-красным центром.) Выделено наличие коагулазоположительных стафилакоков на молочно-солевом агаре: – Дальнейший ход исследования на обнаружение стафилококков и бактерий группы кишечных палочек при необходимости производят, как указано в ГОСТах .

Лабораторная работа – 40 Анализ молока на микробиологическую обсемененность .

Молоко представляет собой биологическую жидкость, которая образуется в молочной железе млекопитающих .

В молоке более 150 различных компонентов, в том числе 25 минеральных веществ (Ca, Mg, Na), более 60 жирных кислот, 20 аминокислот, десятки ферментов, гормонов, витаминов, несколько видов молочного сахара .

Цвет нормального молока белый со слегка желтоватым оттенком из-за присутствия жира .

Молоко – хорошая среда для обитания микроорганизмов – шаровидных и палочковидных бактерий, дрожжей, плесени, кроме этих видов в молоке обнаружены бактериофаги «пожирающие» молочно-кислые бактерии, задерживающие брожение .

В молочно-кислых продуктах находится большое количество микроорганизмов, которые придают им вкусовые качества и определенную консистенцию (это специфическая микрофлора), но могут содержаться и микроорганизм или их споры из внешней среды (это неспецифическая микрофлора), которая может быть опасна. Приводит к непригодности продуктов к употреблению, возникновению у людей пищевых токсикоинфекций и др.заболеваний .

Микробиологическое обследование проводят

1. в плановом порядке для контроля за соблюдением санитарно-гигиенического режима в процессе приготовления, хранения и реализации, особенно тех продуктов, которые не подвергаются термической обработке .

2. в случае сомнения в качестве продукта .

3. при возникновении пищевой интоксикации или заболевания, которые связаны с употребляемой продукцией .

Определяют микробное число – общая микробная обсемененность, это общее количество микроорганизм в 1 мл или 1 г продукта и коли-титр и коли-индекс у молока .

Коли-титр – называют наименьший объем, в котором обнаружена одна E.coli (если пропущено через фильтр (блестящей на сетку, блестящей на агар) 500 мл молока и на среде Эндо – 1 кол., то коли-титр будет 500). И коли-индекс – показывает количество E.coli в 1 л продукта, если коли-титр 500, то коли-индекс 2. Коли-индекс м.б.от 33 до 333, т.е. не более 3-х E.coli в 1 мл в молочных продуктах, а в детских смесях не более 1 .

Микробное число у кисломолочных продуктов не определяют, только коли-титры .

На среде Эндо E.coli – дает колонии с металлическим блеском, вокруг которых среда краснеет вследствие образования кислоты, или розовые колонии с темно-красным центром. В молочных продуктах м.б. и Salmonella – бесцветные колонии на Эндо, т.к не ферментирует лактозу .

Ход работы:

Подготовка молока и молочных продуктов к бактериальному анализу .

В качестве твердой питательной среды используют стерильные МПА, РПА или Эндо-агар .

Для исследования продуктов жидкой и полужидкой консистенции готовят ряд разведений в стерильной водопроводной воде, начиная от 1:10 и заканчивая разведением в зависимости от предполагаемой степени загрязнения .

Образцы масла навеской 1 г помещают в стерильную посуду, расплавляют на водяной бане при температуре 45 0С, до образования однородной массы и разведения проводят в 9 мл подогретой до 45 0С стерильной водопроводной воде. Полученное, таким образом, основное разведение (1:10) используют для изготовления всех других разведений .

Разведения производят обычным образом .

Из пробирки последнего разведения после перемешивания, микроорганизмы высевают одним из следующих способов:

1. Методом поверхностного посева .

2. Методом однослойного агара .

Повторность посева должна быть не менее трехкратной .

Через 2-3 суток развившиеся в чашке Петри колонии подсчитывают .

Формула определения общего микробного числа в 1 мл или в 1 г исследуемого продукта:

Кср х 10Р ОМ = -------------------V где: ОМ – обсемененность или общее микробное число в 1 мл Кср – среднее количество колоний в чашке, кл .

Р – высеваемое разведение положительным знаком показателя V – высеваемый объем на чашку, мл Кср = (К1 + К2 + К3) : 3, если находят среднее по трем чашкам ОМср = (ОМ1 + ОМ2 + ОМ3) : 3, если находят среднее по трем разведениям

Задание для самостоятельной работы:

Провести определение общего микробного числа и коли-титра у молока .

1. Расплавить колбы с МПА и Эндо-агаром .

2. Залить чашки Петри охлажденными МПА и Эндо-агаром .

3. Высушить агар в чашках Петри .

4. Сделать разведение исследуемого молока с 1-го по 3-е разведение .

5. Сделать высев 2 и 3 разведения по 1 мл на плотные питательные среды методом однослойного агара и поверхностным методом .

6. Сделать надписи на дне чашки: какое разведение, какое количество, фамилию .

7. Поставить чашки в термостат при температуре 25-28 0С на 48 часов .

Лабораторная работа – 41 Анализ мяса на микробиологическую обсемененность .

Бактериологическое исследование мяса и колбасных продуктов предусматривает определение общего числа бактерий, присутствия бактерий группы кишечной палочки, наличие бактерий рода сальмонеллы .

Из каждого образца мяса и мясных продуктов, подлежащих бактериологическому исследованию, берут навески по 20 г, помещают их в стерильные фарфоровые ступки и растирают с 2-3 г стерильного кварцевого песка, добавляя небольшими порциями стерильный изотонический (ФР) раствор хлорида натрия (до 80 мл). Приготовленную таким образом гомогенную смесь оставляют на 15 мин при комнатной температуре .

Ход работы:

Определяют микробное число – общая микробная обсемененность, это общее количество микроорганизм в 1 г продукта .

В качестве твердой питательной среды используют стерильные МПА, РПА или Эндо-агар .

Из каждого исследуемого образца продукта делают два посева по 0,1 г и 0,01 г, чтобы получить на чашках от 30 до 300 колоний .

Для высева 0,1 г – стерильной пипеткой отбирают 0,5 мл исходной взвеси и переносят её в стерильную чашку Петри .

Для высева 0,01 г – берут ту же взвесь в объеме 0,5 мл и вносят в пробирку с 4,5 мл ФР .

После тщательного перемешивания, из пробирки набирают 0,5 мл и переносят во вторую чашку Петри .

Обе чашки заливают 25-30 мл расплавленного и охлажденного до 45 0С агаризованной питательной среды, плавно круговыми движениями перемешивают содержимое чашки, дают возможность застыть. Через 20 мин на поверхность агара наливают около 10 мл расплавленного охлажденного голодного агара, для образования слоя в 3-4 мм, предотвращающего ползущий рост протеи. Чашки помещают в термостат вверх дном при температуре 37 0С .

Повторность посева должна быть не менее трехкратной .

Через 2-3 суток развившиеся в чашке Петри колонии подсчитывают .

–  –  –

Задание для самостоятельной работы:

Провести определение общего микробной обсемененности мяса .

1. Расплавить колбы с МПА, Эндо-агаром, голодный агар .

2. Взвесить навеску массой 20 г .

3. Растереть навеску в ступке с 2-3 г кварцевого песка .

4. Небольшими порциями добавлять ФР и оставить взвесь на 15 мин .

5. Сделать разведение взвеси 1:10 .

6. В 1 чашку Петри внести 0,5 мл взвеси, во 2 чашку – 0,5 мл разведения .

7. Залить чашки Петри охлажденными МПА или Эндо-агаром .

8. Высушить агар в чашках Петри .

9. Сверху на поверхность залить голодным агаром

10. Сделать надписи на дне чашки: какое количество, фамилию .

11. Поставить чашки в термостат при температуре 37 0С на 48 часов .

Лабораторная работа – 42 Анализ рыбы на микробиологическую обсемененность .

Микрофлора рыбы в значительной части холодолюбивая. Попадая в условия более высокой температуры после вылова рыбы, эта микрофлора чрезвычайно быстро развивается. Слизь и не удаляемое содержимое кишечника являются хорошей питательной средой, поэтому порча рыбы происходит одновременно с поверхности и изнутри. Очень быстро развиваются микробы, находящиеся в жабрах. Обильно обсеменяется рыба различной микрофлорой и при разделке (с ножей, столов, досок, рук, палубы и др.), переработке и хранении .

При нарушении санитарных режимов в рыбе и устрицах обнаруживают сальмонеллы брюшного тифа, шигеллы, а в некоторых случаях и вирионы – вызывающие тяжелейшие заболевания .

Бактериологическое исследование свежей и свежемороженой рыбы, рыбных продуктов и моллюсков предусматривает определение общего числа бактерий, присутствия бактерий споровых и бесспоровых палочек, в том числе и гнилостных, микрококков, сарцины, наличие бактерий рода протеи и палочки ботулинуса (наиболее опасный, так как размножается при консервировании в анаэробных условиях – выделяя смертельный экзотоксин) .

Определяют микробное число – общая микробная обсемененность, это общее количество микроорганизм в 1 г продукта .

Ход работы:

Из каждого образца свежей и свежезамороженной рыбы, подлежащих бактериологическому исследованию, берут навески по 10 г, помещают их в стерильные фарфоровые ступки и растирают с 2-3 г стерильного кварцевого песка, добавляя небольшими порциями стерильный изотонический (ФР) раствор хлорида натрия (до 90 мл). Приготовленную таким образом гомогенную смесь оставляют на 15 мин при комнатной температуре .

В качестве твердой питательной среды используют стерильные МПА, РПА или Сабуро .

Из каждого исследуемого образца продукта делают два посева по 0,05 г и 0,005 г, чтобы получить на чашках от 30 до 300 колоний .

Для высева 0,05 г – стерильной пипеткой отбирают 0,5 мл исходной взвеси и переносят её в стерильную чашку Петри .

Для высева 0,005 г – берут ту же взвесь в объеме 0,5 мл и вносят в пробирку с 4,5 мл ФР .

После тщательного перемешивания, из пробирки набирают 0,5 мл и переносят во вторую чашку Петри .

Обе чашки заливают 25-30 мл расплавленного и охлажденного до 45 0С агаризованной питательной среды, плавно круговыми движениями перемешивают содержимое чашки, дают возможность застыть. Через 20 мин на поверхность агара наливают около 10 мл расплавленного охлажденного голодного агара, для образования слоя в 3-4 мм, предотвращающего ползущий рост протеи. Чашки помещают в термостат вверх дном при температуре 30 0С .

Повторность посева должна быть не менее трехкратной .

Через 2-3 суток развившиеся в чашке Петри колонии подсчитывают .

Формула определения общего микробного числа в 1 г исследуемого продукта:

Кср х 1 г ОМ = -------------------м где: ОМ – обсемененность или общее микробное число в 1 г Кср – среднее количество колоний в чашке, кл .

м – высеваемое количество, г Кср = (К1 + К2 + К3) : 3, если находят среднее по трем чашкам ОМср = (ОМ1 + ОМ2 + ОМ3) : 3, если находят среднее по трем разведениям

Данные исследования можно оформить в виде таблицы:

–  –  –

Задание для самостоятельной работы:

Провести определение общего микробной обсемененности рыбы .

1. Расплавить колбы с МПА, Сабуро, голодный агар .

2. Взвесить навеску рыбы массой 10 г .

3. Растереть навеску в ступке с 2-3 г кварцевого песка .

4. Небольшими порциями добавлять ФР и оставить взвесь на 15 мин .

5. Сделать разведение взвеси 1:10 .

6. В 1 чашку Петри внести 0,5 мл взвеси, во 2 чашку – 0,5 мл разведения .

7. Залить чашки Петри охлажденными МПА или Сабуро .

8. Высушить агар в чашках Петри .

9. Сверху на поверхность залить голодным агаром

10. Сделать надписи на дне чашки: какое количество, фамилию .

11. Поставить чашки в термостат при температуре 30 0С на 48 часов .

Лабораторная работа – 43 Приготовление диагностической среды Эндо .

Эндо среда (S. Endo) — дифференциально-диагностическая среда для выделения и идентификации кишечных бактерий при бактериологических исследованиях пищевых продуктов, сточных вод и пр. Названа по имени предложившего её японского бактериолога Сигэру Эндо (1869—1937). Обладает слабыми селективными свойствами, компоненты среды подавляют рост грамположительных бактерий .

Состав среды Эндо: пептона — 1 %, лактозы — 1 %, двузамещенного фосфорнокислого калия (К2НРO4) — 0,35 %, агар-агара — 1,5 %. Все ингредиенты, за исключением лактозы, растворяют в воде при кипячении или в автоклаве. Во избежание карамелизации сахара лактозу добавляют после растворения всех остальных компонентов среды. Кроме лактозы, среда не должна содержать никаких других углеводов, поэтому при ее изготовлении не рекомендуется использование мясной воды; можно применять любой пептон или гидролизат белков. Индикатор готовят ex tempore и добавляют к расплавленной питательной основе. Среда может быть использована сразу после приготовления без предварительной стерилизации; при необходимости ее стерилизуют в течение 30 мин. при t° 110°; рН готовой среды 7,4—7,6 .

Индикатором служит соединение основного фуксина с сернистокислым натрием .

Приготовление индикатора: 0,25 г безводного сернистокислого натрия или 0,5 г кристаллического (из расчета на 100 мл среды) растворяют в 5 мл дистиллированной воды и добавляют спиртовой (1—2 %) раствор основного фуксина до тех пор, пока раствор из красного не превратится в бледно-розовый .

Приготовленный индикатор добавляют к расплавленной питательной основе и после тщательного перемешивания среду разливают в стерильные чашки Петри, которые подсушивают в термостате при 37° в течение 30 мин. в открытом состоянии. Готовая к употреблению среда Эндо имеет бледно-розовый цвет либо бесцветна; она должна быть использована в течение суток, так как при длительном хранении происходит покраснение среды и она становится непригодной .

Колонии бактерий, сбраживающих лактозу, на среде Эндо приобретают интенсивно красный цвет с зеленым металлическим блеском. Бактерии, не сбраживающие лактозу, формируют бесцветные либо цвета окружающей среды колонии .

В среде Эндо основной фуксин, в химическом отношении являющийся производным солянокислого розанилина, при соединении с сернистокислым натрием вследствие редуцирования обесцвечивается. При росте бактерий, разлагающих лактозу, промежуточный продукт (ацетальдегид), возникающий в результате окисления сахара, реагирует с сернистокислым натрием и фуксин вновь приобретает красный цвет .

Широкое распространение получил сухой агар Эндо, приготовляемый по специальной прописи и выпускаемый в виде порошка. Это сухой препарат, производства НПО «Питательные среды», г. Махачкала. Состав и способ приготовления: указаны на банке. 40 г/л порошка растворяют в дистиллированной воде, кипятят 3-5 мин не допуская пригорания. Среду не автоклавируют, а используют свежеприготовленной .

На среде Эндо Escherichia coli – дает колонии с металлическим блеском, вокруг которой среда краснеет вследствие образования кислоты, или розовые колонии с темно-красным центром .

Salmonella – дает бесцветные колонии, так как не ферментирует лактозу .

Тифо-паратифозные и дизентерийные бактерии на среде Эндо образуют бесцветные колонии, кишечная палочка и другие разлагающие лактозу микроорганизмы — красные .

Необходимо помнить, что фуксин обладает бактериостатическим действием, которое более выражено при температуре 37°. Поэтому учет результатов следует производить дважды: через 24 часа после инкубации в термостате и 24—48 часов выдерживания посевов при комнатной температуре .

Лабораторная работа – 44 Выделение бактерий группы кишечной палочки .

К основным группам санитарно-показательных микроорганизмов (СПМ) относят Escherichia coli, бактерии рода Enterococcus, бактерии рода Proteus, Clostridium perfringens, термофилы, бактерии рода Salmonella, вирусы .

Все санитарно-показательные микроорганизмы расценивают как индикаторы биологического загрязнения. Группа А включает обитателей кишечника человека и животных;

микроорганизмы расценивают как индикаторы фекального загрязнения. В группу входят так называемые бактерии группы кишечной палочки (БГКП) – эшерихии, энтерококки, протеи, сальмонеллы, а также сульфитвосстанавливающие клостридии (включая Clostridium perfringens), термофилы, бактериофаги, бактероиды, синегнойная палочка, кандиды, акинетобактеры и аэромонады .

I. Escherichia coli является родоначальником всех СПМ. В зависимости от цели и объекта к СПМ с бродильным методом обнаружения кишечной палочки (БГКП) предъявляют различные требования. Их условно подразделяют на 3 подгруппы и при различных обстоятельствах используют факт их наличия для бактериологической характеристики объекта или субстрата .

К 1 подгруппе относят БГКП, обладающие следующими свойствами: они должны сбраживать лактозу и глюкозу или только глюкозу до газа при 370С и не проявлять оксидазную активность. В эту группу входят Escherichia coli, клебсиеллы, цитробактеры, энтеробактеры, и другие представители семейства Enterobacteriaceae. Такие требование к санитарно-показательным БГКП предъявляют при исследовании объектов и субстратов, «чистых» по своей природе или ставших чистыми после их обработки, например термической. Во всех этих продуктах не должно быть никаких БГКП (ни оксидаза-отрицательных, ни оксидаза-положительных) .

2 подгруппа включает БГКП, указывающие на неопределенное по времени фекальное загрязнение. Микроорганизмы должны сбраживать лактозу и глюкозу до газа при 43-44,5 0С. В эту подгруппу входят бактерии (E. coli,, клебсиеллы, цитробактеры, энтеробактеры и др.), сохранившие способность к газообразованию при повышенном температурном режиме. Подобные требования предъявляют к БГКП при невозможности уберечь субстрат от загрязнения. При этом следует ограничиться определением лишь показателей эпидемиологического неблагополучия .

К 3 подгруппе относят БГКП, указывающие на свежее фекальное загрязнение .

Отличительной особенностью E. сoli этой группы является способность расщеплять лактозу до газа при 43-44,5 0С .

В отечественной практике о давности фекального загрязнения судят по сопоставлению индекса Escherichia coli и Clostridium perfringens Высокое значение индекса и низкое значение указывают на давнее загрязнение. Если оба показателя имеют высокое значение, это свидетельствует о свежем фекальном загрязнении .

Материал для исследования: смывы с поверхностей исследуемых предметов .

Метод: санитарно-бактериологический .

Методика посева смывов на бактерии группы кишечных палочек При плановых санитарно-гигиенических обследованиях для выявления БГКП производят посевы смывов на среды Кесслера с лактозой или Кода, при этом в пробирку со средой опускают тампон и переносят оставшуюся смывную жидкость .

Посевы на средах Кесслера или Кода инкубируют при 37 °С, через 18—24 часа со среды Кесслера производят высев на плотную дифференциальную среду Эндо, со среды Кода высев производят в случае изменения окраски среды или ее помутнения .

Посевы помещают в термостат при температуре 37 °С на 24 часа, после чего просматривают. Из колоний, подозрительных или типичных для БГКП, готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. Обнаружение грамотрицательных палочек указывает на наличие БГКП .

Результат: дается информация об отсутствии или наличии в смывах бактерий группы кишечных палочек .

Интерпретация: результат отрицательный .

Лабораторная работа – 45 Приготовление разведений клеток микроорганизмов .

Оборудование и материалы: стерильные пробирки, пипетки на 1 мл, 2 мл, 5 мл, спиртовки, спички, 96 % этиловый спирт, резиновые груши, колбы с физиологическим р-ром (ФР), штативы, чашки Петри, агаризованная питательная среда, электроплитка, 0,5 % р-р хлорамина, х\б тряпки .

Приготовление разведения клеток – это подготовительных этап для определения титра культуры .

!

Чтобы получить изолированные колонии необходимо культуру или материал, содержащий микроорганизмы развести .

Разведение проводят в стерильной водопроводной воде или в физиологическом растворе, пользуясь некоторым постоянным коэффициентом разведения, чаще всего равны 10 .

Методика приготовления разведений Для приготовления разведений стерильный физиологический раствор (ФР) разливают стерильной пипеткой по 4,5 мл (или по 9 мл) в сухие стерильные пробирки, закрытые ватномарлевыми пробками .

Стерильной пипеткой на 1 мл или 2 мл, тщательно перемешав содержимое пробирки с исходной суспензией КЖ, отбирают 0,5 мл (или 1 мл) и переносят в первую пробирку ряда разведений – это первое разведение, 1:10 .

Полученную в первом разведении суспензию с помощью новой стерильной пипетки тщательно перемешивают, вбирав в пипетку и выпуская из нее полученную взвесь. Эту процедуру выполняют 3-5 раз, что обеспечивает хорошее перемешивание суспензии и уменьшает адсорбцию клеток на стенках пипетки .

Затем этой пипеткой отбирают 0,5 мл (или 1 мл) и переносят во вторую пробирку ряда разведений – это второе разведение, 1:100 .

Полученную во втором разведении суспензию с помощью новой стерильной пипетки тщательно перемешивают, отбирают 0,5 мл (или 1 мл) и переносят в третью пробирку ряда разведений – это третье разведение, 1:1000 и так далее .

Степень разведения определяется плотностью исходной суспензии микроорганизмов, т.е .

число разведений тем больше, чем больше плотность исходной суспензии .

Примечание:

1. Для приготовления каждого разведения используется новая стерильная пипетка .

2. Суспензия клеток перед отбором 0,5 мл (или 1 мл) тщательно перемешивается .

3. Все операции выполняются в зоне стерильности .

Задание для самостоятельной работы

–  –  –

I этап. ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАЗВЕДЕНИЯ КЛЕТОК ПО СХЕМЕ

6 .

Если по 4,5 мл физ. р-ра, тогда по 0, 5 мл по пробиркам Лабораторная работа – 46 Определение титра культуры чашечным методом .

Оборудование и материалы: стерильная посуда: пробирки, чашки Петри, пипетки на 1 мл, 2 мл, 5 мл, спиртовки, спички, резиновые груши, колбы с физ. р-ром, штативы, суспензия клеток, колбы с МПА, эл.плитка, 0,5 % р-р хлорамина, вата .

Титр культуры: количество клеток или жизнеспособных спор, содержащихся в 1 мл культуральной жидкости (КЖ) .

Число клеток в единице объема можно определить путем учета их роста на питательных средах (чашечный метод) Сущность чашечного метода заключается в высеве определенного объема ! исследуемой суспензии микроорганизмов на плотную питательную среду в чашки Петри и последующем подсчете выросших колоний. При этом, исходя из того, что каждая колония является результатом размножения одной клетки .

Чтобы получить изолированные колонии необходимо культуру или материал, содержащий микроорганизмы развести .

Чашечный метод широко используется для определения количества микроорганихмов в почве и других естественных субстратах .

Работа по определению титра культуры чашечным методом включает III этапа I этап. ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАЗВЕДЕНИЯ КЛЕТОК Методику приготовления разведений вы освоили на прошлом уроке по схеме .

II этап. ВЫСЕВ РАЗВЕДЕНИЯ Высевать суспензию можно поверхностным способом и методом глубинного агара Высев на плотные питательные среды обычно проводят из последних 2 – 3-х пробирок ряда разведений. Из каждого разведения делают 2-3 параллельных высева .

Посев из разведений можно делать одной пипеткой полностью пустой, но начинать следует обязательно с большего разведения .

Засеянные чашки ставят в термостат с необходимой температурой .

III этап. ПОДСЧЕТ ВЫРОСШИХ КОЛОНИЙ И РАСЧЕТ ТИТРА КУЛЬТУРЫ

Колонии бактерий подсчитывают через 1 – 3 суток, колонии грибов и дрожжей – через 5 – 7 суток, колонии актиномицетов через 7 – 15 суток инкубации в термостате .

Подсчет колоний проводят полуавтоматическими счетчиками или карандашом по стеклу .

Лучшим считается то разведение, при высеве которого на плотной питательной среде вырастает от 20 до 200 колоний .

При глубинном методе посева подсчитываются и глубинные и поверхностные колонии .

Расхождение между параллелями не должно превышать 30 % .

–  –  –

2 чашка 3 чашка высев 6 разведения по 0,2 мл Лабораторная работа – 47 Количественное определение бактерий по камере Горяева – Тома .

Оборудование и материалы:

Микроскоп, осветитель, спиртовка, спички, камера Горяева, покровные шлифованные стекла, микробиологическая петля, салфетки, штатив, пробирка с суспензией дрожжевых клеток, пипетки на 1 мл или 2 мл .

Для количественного определения бактерий используется камера Горяева-Тома. Счетная камера представляет собой толстое предметное стекло, разделенное бороздками. На центральной части камеры нанесены 2 сетки. Часть камеры с сеткой углублена по сравнению с остальной поверхностью камеры, величина углубления называется глубиной сетки (h) и равняется 0,1 мм .

Сетка камеры имеет большие и малые квадраты, площади которых соответственно равны 1/25 мм2, 1/400 мм2. (смотри схему)

Подготовка камеры к работе:

1. Притереть покровное стекло к камере до появления колец Ньютона .

2. Заполнить камеру суспензией клеток из приготовленного 1-го или 2-го разведения м/б петлей или пипеткой. При заполнении следить за тем, чтобы пространство между сеткой и покровным стеклом было заполнено полностью (не должно быть воздуха) .

3. Дать возможность клеткам осесть 3-5 мин, чтобы они при микроскопировании были видны в одной плоскости .

4. Поместить камеру под малое увеличение (8х) микроскопа и найти левый верхний большой квадрат сетки (1) .

5. Найти 1 квадрат под средним увеличением (40х) .

6. Подсчитать число клеток .

Количество клеток обычно подсчитывают в 13 больших или 52 малых квадратах камеры .

Клетки, лежащие внутри и на верхних и правых границах квадрата учитываются, а находящиеся на левой и нижней границах – нет .

Формула расчета титра культуры:

a x 1000 T = ----------- x 10Р (общая формула) sxh Т = а х 10Р х 4 х 106 (упрощенная при подсчете по малым квадратам)

–  –  –

Приготовить 1-ое и 2 –ое разведение исходной культуры .

1 .

Подготовить камеру Горяева к работе .

2 .

Заполнить камеру суспензией клеток 2-го разведения 3 .

Подсчитать число клеток в 13 больших квадратах сетки (52 малых) 4 .

Рассчитать среднее количество клеток в малом квадрате 5 .

Подсчитать титр культуры по упрощенной формуле 6 .

СХЕМА КАМЕРЫ ГОРЯЕВА

–  –  –

Т = а х 10р х 4 х 106, где Т – титр культуры а – среднее количество клеток в квадрате р – разведение исходной культуры =10р Лабораторная работа – 48 Получение накопительной культуры .

Оборудование и материалы: электроплитки, весы технические, автоклав, плоскодонные колбы, воронки, вата, мерные цилиндры на 100 и 500 мл, ватно-марлевые пробки, бумажные колпачки, нитки, ножницы, чашки Петри, фильтровальная бумага, термостат .

Реактивы и компоненты: водопроводная вода, вода дистиллированная, сено, клубни картофеля, мел, универсальная индикаторная бумага, 10 % р-р HCl, 10 % р-р NaOH В природе микроорганизмы находятся в биоценозах (природных сообществах) состоящих обычно из многих видов. Для изучения микроорганизмов в лабораторных условиях используют чистые культуры, содержащие популяцию микроорганизмов одного вида .

Накопительными культурами называют культуры, в которых преобладает одна физиологическая группа или даже один вид микроорганизма .

Для получения накопительных культур создают элективные условия, обеспечивающие преимущественное развитие лишь данной группы или данного вида микроорганизма и неблагоприятные условия для развития сопутствующих форм микробов .

Накопительную культуру можно получить посевом исследуемого материала на питательную среду, которая по химическому составу одним м/о способствует росту, другим нет .

Элективные (избирательные) условия предусматривают ряд факторов, например: потребность микроорганизмов в питательном субстрате, отношение к кислороду, кислотности среды (рН), температуре, способность к образованию спор, добавлением антибиотиков и т.д .

О развитии накопительной культуры в жидкой среде судят визуально по характерным признакам изменения питательной среды, образованию пленки, выделению пигмента, появлению мути, образованию газов, а также по микроскопированию микроорганизмов на прижизненных и окрашенных препаратах .

Размножаясь на плотной среде, бактерии дают начало видимым невооруженным глазом колониям, каждая из которых обычно представляет собой скопление клеток одного вида .

На основе накопительных культур далее выделяют чистые культуры микроорганизмов. Путем пересева отдельных колоний удается выделить чистые культуры .

Ход работы:

Получение накопительной культуры сенной палочки

Приготовление сенного отвара:

Конические колбы вместимостью 250 мл заливают 100-150 мл водой дистиллированной, закрывают ватно-марлевыми пробками и кипятят в течение 15-20 мин (проваривают колбы) .

Сено из разнотравья мелко нарезают, взвешивают 10 г и помещают в колбу вместимостью 500 мл, добавляют щепотку мела (для нейтрализации среды), заливают 250 мл водопроводной воды, закрывают ватно-марлевыми пробками и кипятят в течение 15-20 мин, пока среда не приобретет цвет настоя крепкого чая. Проверить рН отвара и при необходимости довести до 7,0Полученный отвар фильтруют через слой ваты в проваренные колбы, разливают слоем 1,0-1,5 см, закрывают ватно-марлевыми пробками .

Сенной отвар помещают в термостат при 22-25 0С или вблизи радиатора центрального отопления на 2 и более суток .

Получение накопительной культуры картофельной палочки Промытые водопроводной водой клубни картофеля, не очищая, нарезают кружочками по 0,5 см. Поверхность натирают мелом (для нейтрализации среды) и помещают в стерильные чашки Петри на двойной слой фильтровальной бумаги, смоченной стерильной дистиллированной водой .

Чашки с картофельной средой помещают в термостат при 27-30 0С на 3-4 суток .

Задания для самостоятельной работы Проварить коническую колбу вместимостью 250 мл .

1 .

Приготовить сенной отвар .

2 .

Разлить сенной отвар в проваренную колбу .

3 .

Поместить колбу с отваром в термостат .

4 .

Подготовить картофельную среду и поместить в чашку Петри .

5 .

Поместить чашку Петри со средой в термостат .

6 .

Лабораторная работа – 49 Изучение накопительной культуры .

Оборудование и материалы:

Термостат, колбы с сенным отваром, чашки Петри с картофельной средой .

Bacillus subtilis – сенная палочка, так как накопительные культуры получают из сенного отвара, Bacillus subtilis var mesentericus – картофельная палочка. Аэробные спорообразующие бактерии – грам-положительные палочки, образующие споры овальной или цилиндрической формы, не толще материнской клетки. Оба микроорганизма живут в почве и разрушают продукты растительного опада и образовавшиеся микробные метаболиты постепенно превращаются в перегной .

Bacillus subtilis – короткая, подвижная, спорообразующая палочка с закругленными концами, величиной 3-5х0,6 мк. Овальная спора расположена в центре бактерий. На плотных средах образует плотные, мелкие, морщинистые колонии, срастающиеся с агаром. Температурный оптимум 37-50 0С, а температурный максимум роста – 60 0С. Каталазо-положительная (способность разлагать перекись водорода до атомарного кислорода) .

Bacillus subtilis var mesentericus – небольшая (1,5 – 5 мк), подвижная, перетрихиально жгутиковая, спорообразующая палочка, часто соединенная в цепочки. Аэроб, оптимум развития 35-45 0С. На картофельных питательных средах образует тонкие, сухие колонии с морщинистой поверхностью, похожие на брыжейку (отсюда видовое название mesentericus). Каталазоположительная .

Ход работы:

Изучение полученной накопительной культуры сенной палочки (Bacillus subtilis) Внимательно рассмотрите поверхность сенного отвара, убедитесь в наличии роста, так как

– через 2 суток на поверхности среды должна была развиться беловатая пленка Bacillus subtilis, которая при старении на 3 - 4-е сутки, становится серовато-зеленоватой. Другие микроорганизмы при этом вырастают редко и в небольших количествах .

1. Опишите пленку или колонию по следующей схеме:

величина (определяется диаметром колонии, крупные более 4 мм, средние от 2 до 4 мм, мелкие от 1 до 2 мм, карликовые до 1 мм) форма очертания (правильно округлая, неправильно округлая, ризоидная, розеткообразная и др.) прозрачность определяется степенью прохождения света (прозрачные, полупрозрачные, непрозрачные) цвет определяется пигментированием (бесцветные, белые, желтые, зеленые и др.) поверхность (гладкая «блестящая» S-форма, шероховатая или морщинистая R-форма матовая, сухая влажная) рельеф характеризуется приподнятостью над поверхностью питательной среды и контуром формы в вертикальном разрезе (плоские, выпуклые (каплеобразные), с вдавленным центром или двояковыпуклые, погруженные в среду) консистенция (жидкая, пастообразная, слизистая, кожистая, сухая) определяется посредством прикосновения бактериологической петлей к колонии при взятии материала для посева или изготовления мазка

2. Приготовьте два мазка и проведите окраску по методам Грама и Циля-Нильсена .

3. Сделайте вывод .

4. Сделайте пересев частицы колонии Bacillus subtilis истощающимся штрихом на чашки Петри с МПА и поместите в термостат при 27 0С на 1 сутки Изучение полученной накопительной культуры картофельной палочки (Bacillus subtilis var mesentericus) Внимательно рассмотрите поверхность картофеля в чашке Петри, убедитесь в наличии роста, так как – через 4 суток на поверхности ломтиков картофеля должна образоваться плотная морщинистая пленка, окраска которой может быть разной: беловато-серой, розоватой, желтобурой, черной, что зависит от разновидностей культуры, получившей преимущественное развитие .

1. Опишите пленку или колонию по выше описанной схеме .

2. Приготовьте два мазка и проведите окраску по методам Грама и Циля-Нильсена .

3. Сделайте вывод .

4. Сделайте пересев частицы колонии Bacillus subtilis var mesentericus истощающимся штрихом на чашки Петри с МПА и поместите в термостат при 27 0С на 1 сутки Вопросы для самостоятельной работы

1. Какие отличия во внешнем виде колоний полученных на сенном отваре и на ломтике картофеля?

2. Есть ли отличии в окраске клеток из колоний полученных на сенном отваре и на ломтике картофеля?

Лабораторная работа – 50 Исследование биохимических свойств бактериального штамма .

Материалы:

спиртовка, спички, штатив для пробирок, пробирка с ночной культурой – суспензией дрожжевых клеток, маркер по стеклу, микробиологическая петля, пробирки со средой Гисса, содержащей различные углеводные субстраты .

Все работы по приготовлению растворов и питательных сред и работы с штаммами микроорганизмов проводить в специально отведенных помещениях в спец.одежде (белых халатах) .

Углеводные среды предназначены для дифференцировки бактерий по их способности ферментировать те или иные из углеводных субстратов .

Для основы использует среда Гисса, к которой добавлены разные углеводы .

ХОД РАБОТЫ:

Приготовление сред Гисса с углеводами.Взвешивают 2,4 г пептона, 1,2 г натрия хлористого (NaCI) и растворяют в 240 мл очищенной воды. Приливают 0,4 мл красителя 1 % водного фенолового красного, добавляют 1,7 г агара-агара порошкового и расплавляют при нагревании и помешивании. Отливают в 7 стаканов по 30 мл (каждый стакан подписывают), остаток 30 мл это контроль без углеводов. В каждый подписанный стакан помещают по 0,3 г глюкозы, арабинозы, лактозы, маннита, сахарозы, рамнозы и 0,15 г мальтозы. Растворяют при нагревании. Затем среды разливают по 4 мл в 7 стерильных пробирок и стерилизуют при 112 0С 20 мин. Хранить в холодильнике при температуре 4 0С в течение 3 месяцев .

Посев ночной культуры. Взять бактериологической петлей в зоне пламени горелки 1 типичную колонию с чашки Петри с МПА (РПА, Сабуро) с отдельными колониями штамма .

Засеять в пробирку с L-бульоном для получения ночной культуры исследуемого штамма .

Пробирки в наклонном положении помещают в термостат с рабочей температурой 32 0С. Рост в течение ночи - 16-18 час. Микроскопия на однородность культуры .

Посев на среды Гисса. Обжечь бактериологическую петлю в пламени горелки и остудить на внутренней поверхности пробирки с ночной культурой. Из тщательно перемешанной ночной культуре петлей отобрать каплю суспензии и в зоне пламени горелки сделать посев уколом в пробирки средами Гисса. Посеянные пробирки поместить в термостат с рабочей температурой 32 С. Учет провести через сутки, на 3 и 7 день .

Ферментация окислительно-восстановительный процесс обмена веществ, заканчивающийся образованием как восстановленных, так и окисленных продуктов. Конечные продукты ферментации углеводов и спиртов в основном сводятся к образованию нескольких кислот, спиртов, альдегидов и газообразных веществ (Н2 и СО2). Образование кислот отмечают по изменению цвета индикатора от пурпурного при рН 6,8 до желтого при рН - 5,2 .

Таблица Учет роста на средах Гисса Свойства 1 день 3 дня 7 дней

1. Глюкоза газообразование кислота

2. Лактоза газообразование кислота

3. Маннит газообразование кислота

4. Сахароза газообразование кислота

5. Цитрат газообразование кислота

6. Ацетат газообразование кислота

7. Мальтоза газообразование кислота Лабораторная работа – 51 Метод определения антибиотикоустойчивости микроорганизмов

Материалы:

спиртовка, спички, штатив для пробирок, пробирка с ночной культурой – суспензией дрожжевых клеток, маркер по стеклу, стерильная пипетка на 1 мл, чашка Петри с дисками антибиотиков, пинцет, пробирка с расплавленным полужидким агаром .

ХОД РАБОТЫ:

1. Подготовка чашек Петри с МПА и пробирок с п/ж агаром. (делается заранее) Питательную среду МПА в колбе расплавить на электроплитке. Охладить до 42-45 0С .

Разлить питательный агар в стерильные чашки Петри и дать возможность содержимому чашек застыть в течение 60 мин .

Расплавить полужидкий агар МПА в пробирках на водяной бане .

2. Проведение процедуры .

На дне чашки Петри с застывшим агаром сделать маркировку:

К расплавленному полужидкому (п/ж) агару МПА охлажденному до 42-45 0С асептически, в зоне пламени спиртовки, внести стерильной градуированной пипеткой 0,2 мл ночной культуры (суспензии клеток пекарских дрожжей) .

Тщательное и очень быстрое перемешивание, вращательными движениями между ладонями рук, чтобы не образовалось пены .

Обожечь края пробирки в пламени горелки и вылить содержимое пробирки на нижний застывший слой агара в чашку Петри .

Круговыми движениями равномерно распределить содержимое пробирки по поверхности нижнего агара .

Дать время для застывания верхнего слоя в течение 5 мин .

Разложить бумажные диски с антибиотиками по поверхности верхнего агара. Для этого обожечь пинцет в пламени горелки, остудить на воздухе около пламени и взять из пронумерованной чашки бумажный диск и приподняв крышку чашки Петри с агаром опустили диск на место пронумерованное на чашке. Слегка прижать диск к агару .

Пинцет обжечь, взять другой диск и поместить на следующее пронумерованное место .

Каждый диск пропитан антибиотиком определенной дозы 25-30 мкг .

Чашки поместить в термостат и инкубировать в течение 3 суток при 28 0С .

3. Замер зоны лизиса .

Через 3 суток в верхнем слое бактериальные клетки дадут сплошной рост .

Вокруг некоторых дисков с антибиотиками образуется зона отсутствия роста – это зона лизиса, зона чувствительности к данному антибиотику .

4. Учет и представление результатов Замерить линейкой диаметр зоны, это и есть степень чувствительности к антибиотику .

Данные занести в таблицу .

Пример:

Антибиотик Зона Признак лизиса R S в мм устойчивость чувствиительность

1. Пенициллин 0 +

2. Стрептомицин 17 +

3. Тетрациклин 32 +

4. Мономицин 0 +

5. Неомицин 19 +

6. Олеандомицин 18 + Лабораторная работа 52 Открытие углеводов

Цель работы:

1 ознакомить студентов с методиками проведения качественных реакций на углеводы;

2 закрепить представления об особенностях строения молекул углеводов;

3 выработать навыки обращения с химической посудой, реактивами;

4 ознакомить со способами утилизации отработанных реактивов;

5 привить навыки работы со справочной литературой и оформления отчета по лабораторной работе. К природным высокомолекулярным соединениям относятся углеводы, белки, нуклеиновые кислоты .

Углеводы (сахара) – обширная группа природных органических соединений, химическая структура которых часто отвечает общей формуле Сm(H2O)n, т.е. углерод + вода. Используемый термин возник более 100 лет назад, когда так называли природные соединения, отвечающие формуле (СН2О)n, т.е. гидраты углерода. Углеводы включают соединения, начиная с низкомолекулярных, содержащих всего несколько атомов углерода, до веществ, молекулярная масса которых достигает нескольких миллионов .

Реактивы и оборудование: 0,5 г -нафтола, спирт,. 0,5 г резорцина, 20% соляная кислота, 0,25 г орцина, 30% соляная кислота ( = 1,15 г/мл), 10% раствор хлорного железа, 13,3 г кристаллического сульфата меди, дистиллированная вода, едкий натр, глицерин, 1% раствор сахарозы, 1% спиртовой раствор тимола, 1% раствор фруктозы, 1% раствор пентозы, концентрированная соляная кислота, анилин, 10 % раствор гидроокиси натрия, фильтровальная бумага, 10% раствор уксусной кислоты, 1% раствор глюкозы, мальтозы, сахарозы и крахмала, 10% раствор гидроокиси натрия и 5% раствор сульфата меди, безводный карбонат натрия .

По химической природе углеводы представляют собой альдегиды или кетоны многоатомных спиртов. Для жизнедеятельности организма большое значение имеют отдельные представители моносахаридов (глюкоза, галактоза, фруктоза, рибоза, дезоксирибоза и др.), олигосахаридов (сахароза, лактоза и др.), полисахаридов (гликоген, крахмал), в том числе мукополисахаридов (гиалуроновая кислот, гепарин, хондроитинсульфаты и др.) .

Приготовление реактивов: 0,5 г -нафтола растворяют в 50 мл спирта. Перед употреблением разводят водой в 5 раз .

Реактив Селиванова: 0,5 г резорцина растворяют в 100 мл 20% соляной кислоты .

Орциновый реактив: 0,25 г орцина растворяют в 125 мл 30% соляной кислоты ( = 1,15 г/мл) к раствору добавляют 1 мл 10% раствора хлорного железа. Хранят в темной плотно закрытой склянке .

Реактив Гайнеса: а) 13,3 г кристаллического сульфата меди растворяют в 400 мл дистиллированной воды; б) 50 г едкого натра растворяют в 400 мл воды; в) 15 г глицерина растворяют в 800 л воды. Для приготовления реактива Гайнеса смешивают реактивы «а» и «б», после чего к ним прибавляют реактив «в» .

Открытие крахмала Ход работы. В пробирку вносят 10 капель 1% раствора крахмала и каплю 1% раствора йода в йодиде калия. Наблюдается сине-фиолетовое окрашивание .

Реакция на обнаружение углеводов. С помощью реакции с -нафтолом или тимолом обнаруживаются незначительные количества углеводов или углеводных компонентов в сложных соединениях .

Ход работы. В две пробирки вносят по 10 капель 1% раствора сахарозы. Затем в одну из них добавляют 3 капли 1% спиртового раствора -нафтола, а в другую – такое же количество 1% спиртового раствора тимола. В обе пробирки осторожно наслаивают по 0,5 мл концентрированной серной кислоты и на границе двух жидкостей наблюдают фиолетовое окрашивание в пробирке с

-нафтолом и красное в пробирке с тимолом .

Открытие фруктозы (реакция Селиванова). Кетогексозы (фруктоза) при нагревании с соляной кислотой и резорцином дают вишнево-красное окрашивание .

Ход работы. В пробирку наливают 10 капель реактива Селиванова и 2 капли 1% раствора фруктозы и осторожно нагревают. Развивается красное окрашивание .

2. Во второй стадии реакции оксиметилфурфурол, конденсируясь с резорцином, дает красное окрашивание .

Открытие пентоз. Пентозы при нагревании с концентрированными кислотами теряют воду и превращаются в фурфурол, который при взаимодействии с орцином дает зеленое окрашивание, а с анилином – красное .

Ход работы. В пробирку наливают 10 капель орцинового реактива, нагревают до кипения и быстро добавляют 2-3 капли мочи или раствора пентозы. Развивается сине-зеленое окрашивание .

Пробирку с 10 каплями 1% раствора пентозы (рибоза, арабиноза, ксилоза) и 10 каплями концентрированной соляной кислоты осторожно нагревают до кипения, и после охлаждения вносят в нее 5 капель анилина и 5 капель ледяной уксусной кислоты. Раствор окрашивается в красный цвет .

Открытие лактозы. Ход работы. К 1 мл мочи добавляют 0,5 мл концентрированного аммиака и 3 капли 10 % гидроокиси натрия. Нагревают до кипения. Появляется ярко-желтое окрашивание, свидетельствующее о наличии в моче лактозы и галактозы .

Открытие мукополисахаридов. Ход работы. 15 капель мочи наносят на фильтровальную бумагу и высушивают. Затем опускают в раствор толуидинового синего, после чего бумагу отмывают 10% раствором уксусной кислоты. Пурпурная окраска свидетельствует о наличии в моче мукополисахаридов .

Задание 1. Обнаружение лактозы и мальтозы .

Лактоза и мальтоза с аммиаком в щелочной среде образуют окрашенное соединение .

Реактивы: концентрированный раствор аммиака, 1% раствор лактозы, 1 % – й раствор мальтозы, 20 % – й раствор гидроксида калия .

Оборудование: штатив, пробирки, спиртовки, пипетки на 1 мл, 0,5 мл, 50 мкл .

Ход работы В две пробирки, содержащие по 1 мл лактозы и мальтозы, добавляют по 0,5 мл раствора аммиака, 50 мкл гидроксида калия и нагревают на водяной бане до появления красно–коричневого цвета .

Задание 2. Обнаружение восстанавливающих сахаридов реакцией Троммера .

Моносахариды и некоторые дисахариды, в молекулах которых есть карбонильная группа, в щелочной среде восстанавливают оксид меди (II) в оксид меди (I) .

Реактивы: 1 % – й растворы глюкозы, мальтозы, сахарозы, крахмала, 10 % –й раствор гидроксид натрия, 5 % – й раствор сульфата меди .

Ход работы В 4 пронумерованные пробирки внести по 10 капель одного из углеводов: глюкозы, мальтозы, сахарозы и крахмала. Добавить по 10 капель гидроксида натрия и по 2 капли сульфата меди, нагревают до кипения. В пробирках с мальтозой и глюкозой выпадает осадок оксида меди (I) кирпично–красного цвета .

Задание 3. Обнаружение крахмала .

Крахмал с раствором йода образует окрашенное соединение синего цвета .

Реактивы: 1 % – й раствор крахмала, 1% – й раствор йода .

Ход работы К 10 каплям раствора крахмала добавить 1 – 2 капли йода. Наблюдается ярко–синее окрашивание .

Лабораторная работа 53 Свойства углеводов Среди различных свойств углеводов их способность восстанавливать металлы из окислов широко используется для открытия углеводов в клинике, в частности для обнаружения глюкозы в крови и моче .

Реакции на восстанавливающие свойства сахаров. Моносахариды, как и некоторые дисахариды, имеющие свободную карбонильную группу (мальтоза, лактоза), обладают способностью восстанавливать в щелочной среде металлы из окислов в закисную форму или в свободное состояние .

а) Реакция Троммера. Глюкоза в щелочной среде восстанавливает окись меди в закись, а сама окисляется до глюконовой кислоты:

CuSO4 + 2NaOH Cu(OH)2 + Na2SO4

–  –  –

б) Проба Гайнеса Принцип метода заключается в способности глюкозы восстанавливать при нагревании в щелочной среде гидрат окиси меди в закись меди красного цвета .

Ход работы. К 3-4 мл реактива Гайнеса прибавляют 8-12 капель мочи. Нагревают верхнюю часть смеси. Наблюдают переход бледно-голубого цвета в желтый, а затем в красный .

в) Реакция «серебряного зеркала»

Ход работы. В большую пробирку поместите 3 капли 0,2 н. раствора AgN03, 5 капель 2 н .

NaOH и добавляйте по каплям 2 н. NH4OH до полного растворения образующегося осадка .

Полученный бесцветный раствор — аммиачный раствор гидрата окиси серебра:

AgN03 + NaOH — AgOH + NaN03, AgOH + 2 NH4OH - [Ag(NH3) 2 ]OH + H20, аммиачный раствор серебра [Ag(NH3)2]OH + 3H20 — Ag20 + 4 NH4OH .

Затем к аммиачному раствору гидрата окиси серебра добавьте 3—4 капли 0,5% -го раствора глюкозы и слегка подогрейте на спиртовке. Металлическое серебро выделится либо в виде осадка черного цвета, либо в виде блестящего зеркального налета, если стенки пробирки химически чисты (пробирки помыты с помощью «хромовой смеси», а не моющими синтетическими средствами порошками) .

Аналогичный опыт проделайте с 0,5%-м раствором фруктозы .

Ориентировочный экспресс-метод определения сахаров

В клинике важное значение имеют методы, позволяющие быстро определять примерное количество сахара в моче. Данный метод основан на способности образовывать соединения различной окраски в зависимости от количества сахара в присутствии сульфата меди и карбоната натрия .

Ход работы. В ступке растирают в тонкий порошок 1 г сульфата меди с 10 г безводного карбоната натрия Na2CO3. На предметное стекло насыпают немного порошка и наносят несколько капель мочи. Подогревают до кипения. Синий цвет означает отсутствие сахара, желто-зеленый цвет свидетельствует о наличии сахара в моче в пределах 0,5% (5 г\л), зеленый – 1% (10 г\л), красно-коричневый – до 2% (20 г\л) и интенсивно-красный цвет- свыше 2% (20 г\л) .

Контрольные вопросы 1 Укажите правила техники безопасности при выполнении опытов 2 Дайте определение и проведите классификацию углеводов .

3 Функции углеводов в организме .

4 Классификация моносахаридов .

5 Строение молекулы глюкозы (доказательства строения, открытая, циклическая, проекционная формулы и формула Хеуорса) 6 Химические свойства глюкозы (реакции окисления, алкилирования, ацилирования, уменьшения и увеличения цепи) 7 Фруктоза: строение и свойства .

8 Сахароза: строение, свойства, гидролиз .

9 Крахмал: строение, амилоза, амилопектин, физические и химические свойства .

Лабораторная работа 54 Определение глюкозы Расщепление глюкозы по гликолитическому дихотомическому пути Опыт 1 Определение концентрации глюкозы в крови бензокаиновым методом Концентрация глюкозы определяется по оптической плотности окрашенного раствора, образующегося при взаимодействии глюкозы, содержащейся в безбелковом фильтрате крови, с бензокаиновым реактивом .

Ход работы 0,1 мл безбелкового фильтрата крови переносят микропипеткой в сухую пробирку, приливают 2 мл бензокаинового реактива с помощью градуированной пробирки (соблюдать осторожность, так как реактив содержит концентрированную уксусную кислоту), нагревают в кипящей водяной бане 15 мин. Развивается желто-коричневая окраска .

После охлаждения раствора определяют его оптическую плотность на фотоэлектроколориметре против дистиллированной воды при синем светофильтре, в кюветах толщиной 5 мм. Используя калибровочный график, построенный по стандартному раствору глюкозы, определяют концентрацию глюкозы в исследуемой крови .

Делают заключение о количестве глюкозы в исследуемой пробе крови .

Результаты вносят в таблицу и на их основании строят сахарные кривые, откладывая на оси абсцисс время взятия крови, а на оси ординат — найденное содержание Сахара в крови (ммоль/л):

–  –  –

При анализе сахарных кривых обращают внимание на следующие параметры:

а) начальное содержание сахара в крови;

б) быстроту и высоту подъема;

в) продолжительность гиперглюкоземии и характер ее снижения .

Кривая здорового человека отличается быстрым подъемом, максимальный подъем наблюдается около 30 мин, количество сахара может при этом удвоиться. При сахарной болезни уровень сахара в крови возрастает дольше и достигает максимума через 3(У—60) мин или еще позднее, причем достигает очень высоких цифр — до 14 ммоль/л и более .

Понижение кривой имеет также диагностическое значение. У здоровых людей количество сахара уменьшается быстро и через 1,5—2,5 ч возвращается к исходной величине, а иногда оказывается и низке ее. При диабете повышение держится 5—7 ч и возвращается к исходной величине очень медленно. При сахарном диабете происходит снижение толерантности организма к глюкозе .

График 1 - динамика изменений концентрации глюкозы в крови в норме .

Количественное определение глюкозы Глюкоза при нагревании с ортотолуидиновым реактивом дает зеленую окраску, интенсивность которой пропорциональна концентрации глюкозы .

Реактивы: ортотолуидиновый реактив, стандартный раствор глюкозы 1 мг/мл, раствор глюкозы неизвестной концентрации .

Оборудование: Спектрофотометр, пипетки, водяная баня, штатив, пробирки .

Ход работы К 0,2 мл стандартного раствора глюкозы и 0,2 мл раствора с неизвестной концентрацией добавить по 2 мл ортотолуидинового реактива. Пробирки со смесью поместить в кипящую водяную баню на 8 минут. Пробирки вынуть, охладить под струей водопроводной воды до комнатной температуры .

Оптическую плотность раствора измеряют при длине волн 590 – 650 нм.

Расчет ведут по формуле:

Ех Сх = * Сст Ест где:

Сх – концентрация глюкозы в исследуемом растворе (мг/мл);

Сст – концентрация глюкозы в стандартном растворе (мг/мл);

Ех – оптическая плотность исследуемого раствора;

Ест – оптическая плотность стандарта .

Расщепление глюкозы по пентозофосфатному пути. Глюконеогенез Опыт 1 Качественная реакция на рибозу Ход работы К 0,5 мл 0,1%-го раствора РНК добавляют равный объем орцинового реактива (1 г орцина в 500 мл 30% -го НСl + 5 мл 10% -го FeCl). Кипятят 10 мин. на кипящей водяной бане .

В присутствии рибозы развивается зеленое окрашивание .

Под влиянием концентрированной НС1 от рибозы отщепляются 3 молекулы воды и образуется метилфурфурол, который с орцином дает зеленое окрашивание .

Лабораторная работа – 55 Обнаружение липидов .

Цель работы:

1 ознакомить студентов с методиками проведения качественных реакций на липиды;

2 закрепить представления о структурах липидов;

3 выработать навыки обращения с химической посудой, реактивами; ознакомить со способами утилизации отработанных реактивов;

4 привить навыки работы со справочной литературой и оформления отчета по лабораторной работе .

Липиды (от греч. липос – жир) – низкомолекулярные органические соединения, практически нерастворимые в воде, которые могут быть извлечены из клеток неполярными органическими растворителями (хлороформ, бензол, петролейный эфир). Отличительным свойством липидов является их гидрофобность (липофильность). Липиды представляют собой разнородные химические соединения

I Простые липиды:

1 ацилглицеролы (жиры, триглицериды и т.п.);

2 воска .

II Сложные липиды:

1 фосфолипиды

• глицерофосфолипиды (фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол, фосфатидилглицерол, кардиолипин, плазмалоген);

• сфингофосфолипиды (сфингомиелин);

2 стероиды (холестерол, эргостерол, ланостерол, стигмастерол, экдистероиды);

3 гликолипиды (цереброзиды, ганглиозиды, сульфатиды) .

Для характеристики жира используют константы или жировые числа:

Кислотное число – масса КОН (мг), необходимая для нейтрализации свободных жирных кислот в 1 г жира .

Число омыления – это масса КОН (мг), необходимая для гидролиза нейтральных липидов (омыления) и нейтрализации всех жирных кислот (в том числе и свободных), содержащихся в 1 г жира. Чем выше число омыления, тем больше низкомолекулярных кислот входит в состав жира .

Йодное число – это масса йода (г), связываемая 100 г жира. Йодное число характеризует степень ненасыщенности, так как присоединение йода происходит по месту разрыва кратных связей в остатке жирной кислоты. Чем больше йодное число, тем выше ненасыщенность жира .

Липиды широко применяют в медицине и технике. Из них получают основу для мазей, мыло (соли жирных кислот), масляные краски, олифу и т.п .

Реактивы и оборудование:

Жиры (говяжий, свиной, бараний) 10 г, масло (подсолнечное, касторовое, растительное) 10 г, толуол, ацетон, петролейный эфир, диэтиловый эфир, гексан, этиловый спирт, серная кислота (конц.), соляная кислота (0,5н), соляная кислота (разб. 1:1), гидроксид калия (водный 0,1 н), гидроксид калия, (спиртовой раствор 0,5н), раствор гидроксида натрия (разб.), раствор карбоната натрия 10%, гидросульфат калия (безвод.), раствор нитрата серебра, аммиак (водный раствор), раствор фуксинсернистой кислоты, спиртовой раствор йода (0,2н), раствор тиосульфата натрия (0,1н), раствор крахмала 1 %, бромная вода, раствор гидроксида натрия 35 %; пробирки, колбочки для титрования, держатель, спиртовка, водяная баня, кристаллизатор со льдом, часовое стекло, бюретки .

Опыт 1 Растворимость жиров и масел

а) в 5 пробирок поместите по небольшому кусочку твердого жира (свиного, говяжьего и т.п.) и прилейте по 1 мл: 1 – воды, 2 – этанола, 3 – толуола, 4 – петролейного эфира, 5 – ацетона .

Если жир не растворяется, пробирку поместите в водяную баню на 5 минут. Сделайте вывод о растворимости жира на холоде и при нагревании .

б) в 5 пробирок поместите по 0,5 мл растительного масла (подсолнечного, оливкового, кукурузного и т.п) и прилейте по 1 мл: 1 –воды, 2 – этанола, 3 – толуола, 4 – петролейного эфира, 5 – ацетона. Если масло не растворяется, пробирку поместите в водяную баню на 5 минут .

Сделайте вывод о растворимости растительного масла на холоде и при нагревании .

Опыт 2 Гидролиз жиров и масел

а) В 2 пробирки поместите по небольшому кусочку жира и прилейте в 1 пробирку 1…2 мл раствора щелочи (NaOH разб.), а во вторую – 1…2 мл соляной кислоты (1:1). Пробирки встряхните. Если изменений не наблюдается, поместите пробирки в водяную баню на 5…10 мин .

Сделайте вывод о гидролизе жиров на холоду и при нагревании .

б) в 2 пробирки поместите по 0,5 мл растительного масла и прилейте в 1 пробирку 1…2 мл раствора щелочи (NaOH разб.), а во вторую – 1…2 мл соляной кислоты (1:1). Пробирки встряхните. Если изменений не наблюдается, поместите пробирки в водяную баню на 5…10 мин .

Сделайте вывод о гидролизе растительного масла на холоде и при нагревании .

Опыт 3 Выделение жира из молока К 6 мл цельного молока прибавляют 2 мл 10 %-ного раствора Na2CO3, хорошо перемешивают и взбалтывают с 5 мл эфира. Эфирный слой помещают в чашечку для выпаривания на водяную баню (под тягой). После испарения эфира остается сливочное масло – молочный жир .

Опыт 5 Определение ненасыщенности кислот в составе жира В пробирку поместите 2–3 капли масла (жира) и 8 – 10 капель бромной воды. Пробирку встряхните .

Аналитический эффект: Обесцвечивание бромной воды Контрольные вопросы 1 Укажите правила техники безопасности при выполнении опытов .

2 Дайте определение и проведите классификацию липидов .

3 Укажите функции липидов в организме .

4 Особенности высших жирных кислот, входящих в состав липидов человека .

5 Приведите примеры качественных реакций, доказывающих непредельный характер ВЖК .

6 Напишите структурные формулы представителей простых и сложных липидов: ТАГ, фосфолипидов, холестерина .

7 Какие реакции лежат в основе омыления жира?

8 Какие числа характеризуют состав и строение липидов?

9 Перечислите компоненты, участвующие в переваривании жиров .

10 Значение ВЖК, холестерина в метаболических процессах .

Лабораторная работа – 56 Обратимые реакции осаждения белков Для осаждения белков нужно лишить его факторов, удерживающих белок в растворе, используя различные агенты, снижающие заряд или разрушающие гидратную оболочку белковой частицы. Реакции осаждения могут быть обратимыми и необратимыми .

Обратимые реакции осаждения не приводят к глубоким изменениям структуры белка, поэтому получаемые осадки могут быть вновь растворены в первоначальном растворителе. Белки при этом сохраняют свои начальные нативные, включая биологические, свойства .

Под действием факторов осаждения белки выпадают в осадок, но после прекращения действия (удаления) этих факторов белки вновь переходят в растворимое состояние и приобретают свои нативные свойства .

При обратимом осаждении макромолекулы белка в основном не подвергаются глубокой денатурации, а осадки могут быть снова растворены в первоначальном растворителе. Обратимое осаждение вызывается действием нейтральных солей аммония, щелочных и щелочно-земельных металлов (высаливание), спирта, ацетона, эфира и некоторых других органических растворителей .

Высаливание. Насыщенным раствором сульфата аммония осаждается альбуминовая фракция белков, полунасыщенным раствором - глобулиновая фракция .

Сущность реакции заключается в дегидратации молекул белка .

Реактивы:

1) неразведенный яичный белок;

2) насыщенный раствор сульфата аммония;

3) NaOH, 10% раствор,

4) CuSO4, 1% раствор;

5) дистиллированная вода;

6) сульфат аммония в порошке .

7) раствор яичного белка с добавлением хлорида натрия (белок одного куриного яйца отделяют от желтка и растворяют в 230 см3 дистиллированной воды, к которой прибавляют 100 см3 насыщенного раствора хлорида натрия, раствор фильтруют через марлю, сложенную в 3–4 слоя, и хранят в холодильнике) Оборудование: пробирки; воронка для фильтрования; бумажные фильтры .

Ход определения .

1 опыт. В пробирку наливают 30 капель неразведенного яичного белка и добавляют равное количество насыщенного раствора сульфата аммония. Содержимое пробирки перемешивают .

Получают полунасыщенный раствор сульфата аммония, при этом глобулиновая фракция осаждается, а альбуминовая остается в растворе. Последнюю отфильтровывают, затем смешивают с порошком сульфата аммония до тех пор пока не прекратится растворение соли, при этом выпадает осадок - глобулины .

2 опыт. Осаждение белков сульфатом аммония .

В пробирку отмерьте 2–3 см3 раствора яичного белка, добавьте равный объем насыщенного раствора сульфата аммония и смесь перемешайте .

Выпадает осадок глобулинов, альбумины остаются в растворе. Осадок отфильтруйте на бумажном фильтре .

К фильтрату добавьте порошок сульфата аммония до получения насыщенного раствора (последняя порция не растворяется) .

Выпадает осадок альбуминов, который также отфильтруйте .

Фильтр с осадком альбуминов промойте 5 см3 воды, собирая фильтрат в чистую пробирку .

Проделайте с фильтратом биуретовую реакцию. Произошло ли растворение альбуминов?

3 опыт. Осаждение белков спиртом .

Органические растворители вызывают осаждение белков вследствие разрушения гидратной оболочки макромолекул .

В пробирку налейте 1 см3 раствора яичного белка с добавлением хлорида натрия .

По каплям прилейте 4–6 см3 спирта и сильно взболтайте. Через 5–8 мин. выпадает осадок белков .

Лабораторная работа – 57 Необратимые реакции осаждения белков .

Необратимые реакции вызывают глубокие изменения структуры белка, поэтому получаемые осадки не могут быть растворены в первоначальных растворителях, наступает денатурация белка. Денатурацией называют такое изменение белка, при котором он утрачивает свои естественные биологические и физико-химические свойства, становится менее гидрофильным и теряет способность растворяться в воде .

Практическое значение реакций осаждения белков состоит в том, что они дают возможность:

1) изучить свойства белков,

2) освободить жидкость от присутствия белка,

3) установить наличие белка в моче при патологических состояниях,

4) разделить отдельные белковые фракции на альбумины и глобулины .

Почти все белки денатурируют при нагревании (50-55оС и выше). Механизм тепловой денатурации связан с перестройкой структуры белковой молекулы, в результате которой белок теряет свои нативные свойства, уменьшается его растворимость (уменьшение гидрофильных свойств ведет к нарушению гидратной оболочки). Присутствие солей и концентрация водородных ионов играют важную роль в выпадении в осадок денатурированного при нагревании белка .

Наиболее полное и быстрое осаждение происходит в изоэлектрической точке белка, то есть при такой величине рН, при которой коллоидные частицы белка являются наименее устойчивыми .

Поэтому для полного осаждения белка при нагревании следует создавать реакцию среды, соответствующую его изоэлектрической точке .

Белки, обладающие кислыми свойствами, осаждают в слабокислой среде, белки, обладающие щелочными свойствами, – в слабощелочной. В сильнокислых и сильнощелочных растворах денатурированный при нагревании белок не выпадает в осадок, так как частицы белка перезаряжаются (или происходит усиление имеющегося заряда) и несут в первом случае положительный, во втором - отрицательный заряд, что повышает их устойчивость в растворе в результате электростатических сил отталкивания. Поэтому в сильно кислых и сильно щелочных растворах белки обычно не выпадают в осадок при нагревании. Однако в сильно кислых растворах белки могут коагулировать при добавлении достаточного количества какой-либо нейтральной соли. Степень влияния ионов нейтральных солей на осаждаемость белков зависит от их способности адсорбироваться на частицах белка .

Адсорбированные ионы солей (если они противоположны по знаку заряду коллоидной частицы) нейтрализуют заряд частицы. Наступает момент, когда силы притяжения между молекулами превышают силы отталкивания и белок выпадает в осадок .

Исследуемый материал: раствор яичного белка Реактивы: 1%-ный раствор CH3COOH, 10%-ный раствор NaOH, насыщенный раствор NaCl .

Оборудование: пробирки, капельницы, спиртовка .

ХОД РАБОТЫ .

1. В 5 пробирок наливают по 5 капель раствора яичного белка (без NaCl) .

В первой пробирке нейтральный раствор нагревают до кипения. Жидкость мутнеет, поскольку разрушаются водные оболочки вокруг молекул белка и происходит укрупнение его частиц. Мицеллы белка несут заряд и удерживаются во взвешенном состоянии .

Во 2-ой пробирке раствор белка нагревают до кипения и прибавляют 1 каплю 1% раствора уксусной кислоты для слабого подкисления. Через некоторое время выпадает хлопьевидный осадок белка. Частицы белка теряют заряд и приближаются к изоэлектрическому состоянию .

В 3-ю пробирку добавляют 5 капель 1%-го раствора уксусной кислоты для получения сильнокислой реакции среды. При кипячении жидкости осадка не образуется, поскольку белковые мицеллы перезаряжаются и несут положительный заряд, что повышает их устойчивость .

В 4-ю пробирку добавляют 2 капли 10%-го раствора NaOH, создавая щелочную среду. При кипячении жидкости осадка не образуется, поскольку в щелочной среде отрицательный заряд на частицах белка увеличивается .

В 5-ю пробирку наливают 5 капель 1%-го раствора уксусной кислоты и 2 капли насыщенного раствора NaCl и нагревают. Выпадает белый хлопьевидный осадок белка, так как частицы белка теряют заряд вследствие взаимодействия белка с разноименно заряженными ионами хлористого натрия .

2. Осаждение белков солями тяжелых металлов .

Метод основан на связывании ионов тяжелых металлов с функциональными группами боковых радикалов аминокислот в молекуле белка, в результате чего разрушается ее пространственная структура и происходит осаждение денатурированного белка. При добавлении избытка солей тяжелых металлов (кроме AgNO3 и HgCl2) происходит растворение первоначально образующегося осадка из-за абсорбции иона металла и приобретении вследствие этого белковой молекулой положительного заряда .

К 5 каплям исследуемого раствора белка прибавляют осторожно 1 каплю 10% раствора сульфата меди. Образуется бледно-голубой осадок, нерастворимый в воде. К другой такой же порции раствора белка приливают вначале 1 каплю 10% раствора сульфата меди, а затем еще 10 капель и наблюдают растворение осадка в избытке реактива .

3. Осаждение белков концентрированными минеральными кислотами .

Метод основан на способности минеральных кислот вызывать нейтрализацию зарядов и разрушение пространственной структуры белка, что приводит к его денатурации и осаждению .

Ортофосфорная кислота осадка не дает. В избытке всех минеральных кислот, за исключением азотной, выпавший осадок белка растворяется .

К 5 каплям концентрированной азотной кислоты осторожно по стенке наклоненной пробирки приливают 5 капель исследуемого раствора белка так, чтобы жидкости не смешивались .

На границе двух жидкостей образуется осадок в виде небольшого белого кольца. Осторожно встряхивают пробирку и добавляют избыток азотной кислоты. Осадок не исчезает, так как в избытке азотной кислоты он не растворяется .

4. Осаждение белков органическими кислотами .

Метод основан на способности органических кислот нейтрализовать заряд молекулы белка и разрушать ее пространственную структуру, что приводит к денатурации и осаждению белка .

Органические кислоты вызывают необратимое осаждение белков .

Трихлоруксусная кислота способна осаждать только белки и не осаждает продукты распада белков. При использовании трихлоруксусной кислоты удается отдельно определить содержание азота белков и азота других азотсодержащих веществ: пептидов, мочевины, аминокислот .

К 5 каплям исследуемого раствора белка добавляют 2 капли 10 % раствора трихлоруксусной кислоты. Выпадает осадок белка .

5. Осаждение белков органическими растворителями .

Метод основан на способности органических растворителей нарушать гидрофобные взаимодействия внутри белковой молекулы и вызывать ее денатурацию, что приводит к снижению растворимости и выпадению денатурированного белка .

При осаждении спиртом раствор белка должен быть нейтральным или слабокислым, но не щелочным. Реакция происходит лучше в присутствии электролита хлорида натрия вследствие снятия заряда с частиц белка .

Реакция осаждения белка спиртом при кратковременном действии спирта на холоду обратима. Если осадок быстро отделить от спирта, то белок сохранит нативное состояние и может быть вновь растворим в воде. При длительном воздействии спирта наступает необратимая реакция осаждения, то есть денатурация белка .

К 5 каплям раствора исследуемого белка приливают 15-20 капель этилового спирта (или ацетона). Раствор мутнеет. Добавляют 1 каплю насыщенного раствора хлорида натрия. При стоянии выпадает осадок белка .

Оформление работы. Записать в таблицу результаты осаждения белков при кипячении в различных средах и указать в каждом случае причину появления или отсутствия осадка белка .

ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКА ПРИ КИПЯЧЕНИИ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ РЕАКЦИЯХ СРЕДЫ

Щелочная Нейтральная Слабокислая Сильнокислая Сильнокислая среда среда среда среда среда+электролит Лабораторная работа – 58

КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ НА БЕЛКИ И АМИНОКИСЛОТЫ

Цель работы: закрепить знания по аминокислотному составу белков и приобрести навыки проведения цветных реакций на белки и отдельные аминокислоты .

При взаимодействии белка с отдельными химическими веществами возникают окрашенные продукты реакции. Образование их обусловлено присутствием в молекуле белка той или иной аминокислоты, имеющей в боковом радикале определенную химическую группировку. Некоторые реакции присущи не только белкам, но и другим веществам, содержащим те же химические группировки, поэтому для установления наличия белка недостаточно проведения одной какойнибудь реакции .

Значение цветных реакций состоит в том, что они дают возможность установить белковую природу вещества и доказать присутствие некоторых аминокислот в различных природных белках. На основании цветных реакций разработаны методы количественного определения белков и аминокислот .

Исследуемый материал: сыворотка или плазма крови, 1 % раствор яичного белка (белок одного куриного яйца растворяют в 20-кратном объеме дистиллированной воды, фильтруют через марлю) .

Реактивы:

1. 10 % раствор NaOH .

2. 1 % раствор CuSO4 .

3. 0,1 % водный раствор нингидрина .

4. Концентрированная азотная кислота .

5. Ледяная уксусная кислота .

6. Концентрированная серная кислота .

7. 5 % раствор ацетата свинца .

Оборудование:

1. Штатив с пробирками .

2. Пипетки .

3. Песчаная баня или спиртовка .

Ход работы:

1. Биуретовая реакция на пептидную группу .

Метод основан на способности пептидных групп образовывать в щелочной среде с ионами Cu2+ комплексное соединение фиолетового цвета с красным или синим оттенком в зависимости от числа пептидных связей в белке. В сильно щелочной среде пептидные группы полипептидов переходят в енольную форму, в которой и взаимодействуют с ионом Cu2+, образуя окрашенный биуретовый комплекс.

Ковалентные связи этого комплекса образованы за счет енольного гидроксила, а координационные – за счет атомов азота амино- и иминогрупп, имеющих неподеленные электронные пары:

–  –  –

OH OH OH OH рибоза рибоновая кислота 2CuOH H2O + Cu2O К 10 каплям гидролизата добавляют 5 капель 10 % раствора NaOH до щелочной среды и добавляют по каплям 7 % раствор сульфата меди CuSO4 до появления голубой мути, далее пробирку нагревают до кипения, при этом выпадает желтый осадок CuOH или образуется осадок меди Cu2O красного цвета .

Внимание!

Избыток CuSO4 мешает реакции, так как образующийся при нагревании Cu(OH)2 дает оксид меди (II) CuO черного цвета .

3. Молибденовая проба на фосфорную кислоту .

Метод основан на обнаружении фосфорной кислоты по реакции с молибдатом аммония, в результате которой образуется фосфомолибденовый комплекс, который в свою очередь под действием восстановителей (аскорбиновая кислота) переходит в молибденовую синь .

H3PO4 +2(NH4)2MoO4 + 21HNO3 (NH4)3(PO412MoO3) + 21NH4NO3 + 12H2O Берут 10 капель гидролизата, добавляют 10 капель раствора молибдата аммония, перемешивают содержимое встряхиванием и наливают 10 капель раствора аскорбиновой кислоты. Вновь перемешивают и оставляют стоять до развития специфического окрашивания .

4. Биуретовая реакция на белок .

К 5 каплям гидролизата добавляют 10 капель 10 % раствора NaOH до щелочной среды (проверить рН) и прибавляют 1 каплю 1 % раствора CuSO4. В пробирке наблюдается характерное окрашивание .

Указания к составлению отчета: При составлении отчета написать в тетради схему полного распада нуклеопротеидов и химические формулы компонентов нуклеотидов .

Контрольные вопросы:

1) Какие белки входят в состав нуклеопротеидов и в чем состоит их особенность?

2) Какие типы нуклеиновых кислот вы знаете и какова их биологическая роль?

3) Какие углеводы и азотистые основания входят в состав ДНК и РНК?

Лабораторная работа – 60 Обнаружение действия ферментов .

Цель работы – закрепить знания о строении, свойствах и механизмах действия ферментов, которые необходимы для изучения обмена веществ и приобрести навыки исследования ферментов .

Кинетика ферментативных реакций – это раздел энзимологии, который изучает зависимость скорости реакций, катализируемых ферментами, от химической природы реагирующих веществ и от условий их взаимодействия. Изучение кинетики ферментативных реакций показывает их отличия от неорганических катализаторов .

Опыт 1. Действие амилазы слюны на крахмал .

Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры

1. Предварительно прополоскав рот, набрали 2-4 мл слюны и поместили в маленький мерный цилиндр. В цилиндр добавили воды, доведя объем до 10 мл .

2. Смешали 5 мл раствора крахмала с 1 мл раствора фермента в маленькой мензурке. Через 30 с после перемешивания взяли каплю полученного раствора и проверили ее на содержание крахмала, перемешав её с каплей раствора йода на предметном стекле. Если крахмал еще присутствует, то необходимо проверять раствор через каждые 30 с до тех пор, пока крахмал станет необнаруживаем. Записали общее время, необходимое для полного гидролиза крахмала .

3. Вновь смешали 5 мл раствора крахмала с 1 мл раствора фермента и разделили полученный раствор поровну в 2 пробирки. Одну из пробирок поместили в стаканчик с холодной водой (35-40оС). Каждые 30 с отбираем по 1 капле смеси растворов из каждой пробирки и смешиваем на предметном стекле с каплей йода до тех пор, пока крахмал станет необнаруживаем .

Записали в каждом случае общее время, необходимое для гидролиза крахмала. Делаем вывод, что амилаза наиболее эффективна при температуре 35-40 0С (температуре тела) .

Указания к составлению отчета: Написать уравнение гидролиза крахмала под действием амилазы. Сделать вывод о зависимости ферментативной реакции от температуры и причинах этой зависимости .

Опыт 2. Действие дегидрогеназы на метиленовый синий (стиральная синька)

1. Небольшое количество аптечного формалина (с учетом его исходной концентрации) развели водой до получения 0,5%-ного раствора формальдегида .

1. В 2 пробирки налили по 5 мл некипяченого молока, добавили по 15 капель 0,5%-ного раствора формальдегида и по несколько капель раствора метиленового синего. Наблюдаем, что краситель постепенно бледнеет и в конце концов обесцвечивается. Это объясняется тем, что благодаря содержащейся в молоке дегидрогеназе атомы водорода формальдегида присоединятся к молекуле красителя .

3. В каждую пробирку добавили немного растительного масла, чтобы изолировать полученную смесь от воздуха и предотвратить окисления красителя .

4. Одну пробирку поставили в пустой стаканчик, а другую в стаканчик с теплой водой (35С). Наблюдаем, что в пробирке, помещенной в воду, краситель обесцвечивается быстрее, чем в первой (т.к. наиболее эффективна дегидрогеназа в условиях, близких к температуре млекопитающих) .

5. С помощью резиновой груши и стеклянной трубки через реакционную смесь продули воздух, наблюдаем восстановление цвета красителя (происходит его окисление) .

Опыт 3. Действие каталазы на перексид водорода

1. В 5 пробирок налили по 2 мл раствора пероксида водорода .

2. В первую пробирку опустили кусочек сырого мяса. Наблюдаем выделение пузырьков газа. К отверстию пробирки поднесли тлеющую лучинку, наблюдаем вспыхивание и горение лучинки .

3. Во вторую пробирку опустили кусочек сырого картофеля и поднесли тлеющую лучинку .

Вновь наблюдаем выделение пузырьков газа и вспыхивание лучинки .

4. В третью пробирку опустили измельченный на терке картофель и поднесли тлеющую лучинку. Наблюдаем более интенсивное выделение газа, т. к. реакция катализируется, каталазой содержащейся в клетках не только поверхности одного куска, их стало больше (увеличилась площадь поверхности) .

5. В четвертую и пятую пробирки опустили по кусочку вареного мяса и картофеля .

Ничего не происходит, т.к. при варке ферменты разрушаются и не катализируют реакцию разложения пероксида водорода .

Опыт 4. Определение оптимума рН активности амилазы Метод основан на определении скорости гидролиза крахмала -амилазой слюны в зависимости от рН .

Ферменты очень чувствительны к изменению кислотности среды, в которой они действуют .

Можно считать, что для каждого фермента имеется определенная концентрация протонов, при которой он наиболее активен. Изменение кислотности среды в ту или иную сторону от оптимума рН вызывает понижение активности фермента .

Оборудование: штатив с пробирками; песчаная баня или спиртовка; водяная баня с термометром или термостат на 38 ОС; стакан со льдом или снегом; часы; предметные стекла и стеклянные палочки .

Фосфатный буфер с рН 5,0; 5,8; 6,2; 6,6; 7,0; 7,4; 8,0 и 8,4 (Готовят раствор № 1: 9,072 г КН2РО4 растворяют в 1 литре воды .

Готовят раствор № 2: 11,866 г Na2HPO4·2H2O растворяют в 1 литре воды .

Растворы с определенным значением рН получают совместным смешиванием растворов № 1 и № 2 согласно таблице) .

Таблица Приготовление буферных растворов с определенным значением рН рН Объем раствора № 1, мл Объем раствора № 2, мл 5,0 91,05 0,95 5,8 92,10 7,90 6,2 81,60 18,40 6,6 62,90 37,1 7,0 38,80 61,20 7,4 18,20 81,80 8,0 3,10 96,90 8,4 - 100,00 Ход работы. В восемь пробирок вносят по 2 мл буферного раствора соответственно с рН 5,0; 5,8; 6,2; 6,6; 7,0; 7,4; 8,0 и 8,4. Во все пробирки добавляют по 5 мл 0,2%-го раствора крахмала (на 0,1%-м растворе NaCl) и по 1 мл слюны, разбавленной в 3 раза. Пробы тщательно перемешивают (избегая образования пены!) и помещают в термостат (37оС) .

Через 3 минуты из пятой пробирки отбирают 1 каплю раствора и наносят на предметное стекло, смешивая с 1 каплей раствора Люголя. Если образуется синее, фиолетовое или фиолетовокрасное окрашивание, реакцию с раствором Люголя повторяют через каждые 3 минуты, пока окраска смеси не станет буро-красной. В этот момент все пробы извлекают из термостата и добавляют в них по 5 капель раствора Люголя, тщательно перемешивают. В пробе с оптимальным рН, где скорость реакции была максимальной, раствор окрашивается в желтый цвет, что свидетельствует о полном расщеплении крахмала .

Указания к составлению отчета. Сделать вывод о зависимости скорости ферментативной реакции от рН среды .

Лабораторная работа – 61 Качественные реакции на витамины (группы А) .

Цель работы – приобрести умения качественного определения витаминов, необходимые для проведения анализов биологических материалов .

Витаминами называют преимущественно незаменимые низкомолекулярные органические вещества, имеющие разнообразную химическую природу и участвующие в регуляции биохимических процессов на уровне ферментов (как составная их часть). Витамины не являются пластическим материалом и не расходуются в качестве источников энергии .

1. Проба Друммонда на ретинол (витамин А) .

Метод основан на способности концентрированной серной кислоты отнимать воду от ретинола с образованием окрашенных продуктов .

Ход работы: В пробирку вносят 2 капли рыбьего жира, 5 капель хлороформа и 1капли концентрированной серной кислоты. Появляется голубое окрашивание, переходящее в буро-красное .

Витамин А содержится в рыбьем жире, телячьей и свиной печени, яичном желтке, сливочном масле, жирных сырах, брынзе, рыбьей икре. Предшественник витамина А (каротин) содержится в красном перце, моркови, щавеле, абрикосах, зеленом луке, крапиве, шпинате, салате, красных помидорах, зеленом горошке, черной смородине, чернике, крыжовнике, петрушке .

Свойства витамина А Каротин превращается в организме в Витамин А (ретинол) под действием специального фермента в присутствии гормонов щитовидной железы. Попав в клетки-мишени, витамин А проникает в ядро и вызывает активацию генов, контролирующих развитие клеток соединительной, хрящевой и костной ткани, эпителия; деление клеток иммунной системы; повышение способности синтеза в печени различных веществ (в том числе протромбина и других факторов свертывания крови), синтез половых гормонов и глюкокортикоидов, обеспечивающих адекватную реакцию организма на стресс. Кроме того, витамин А участвует в поддержании нормальной функции сетчатки глаза и мембран – вкусовых, обонятельных и статокинетических рецепторов, обеспечивающих реакцию человека на изменение положения тела в пространстве .

Суточная потребность в препарате витамина А:

Взрослые: 1,5 мг (5000 МЕ) .

Женщины в период беременности и кормления грудью: 2 мг (6600 МЕ) .

Новорожденные: 0,5 мг (1500 МЕ) .

Дети и подростки: 0,5-1,5 мг (1500-5000 М Е) .

Основные эффекты препаратов витамина А:

1. Адаптационно-трофический эффект. Улучшение состояния нервной системы, нормализация обмена веществ и питания тканей .

2. Антиинфекционный эффект. Повышение устойчивости организма к инфекции, стимуляция выработки противомикробных и противовирусных антител, усиление способности лейкоцитов захватывать и переваривать микроорганизмы; повышение защитных свойств кожи и слизистых оболочек, нейтрализация бактериальных токсинов .

3. Дермопротекторный эффект. Нормализация обменных процессов в коже, ногтях, волосах .

Признаками гиповитаминоза (дефицита) витамина А являются: сухость и шелушение кожи, образование угрей, фурункулез, сухость и тусклость волос, ломкость ногтей, их исчерченность, снижение аппетита, повышенная утомляемость, сухость конъюнктивы, нарушение сумеречного зрения «куриная слепота», усиление камнеобразования в желчевыводящих и мочевых путях, частые инфекционные заболевания верхних дыхательных путей и желудочно-кишечного тракта .

Поэтому показаниями к применению препаратов витамина А являются:

1) глазные болезни: (нарушение сумеречного зрения и цветовосприятия, сухость конъюнктивы, ячмени);

2) кожные болезни (кератозы, угри, нарушения роста ногтей, вялая эпителизация ожогов и ран);

3) воспалительные заболевания верхних дыхательных путей, синуситы;

4) заболевания пищеварительного тракта (стоматит, гастрит, язва желудка, энтерит, колит, холецистит, заболевания печени);

5) гинекологические заболевания;

6) гиперфункция щитовидной железы;

7) пониженное обоняние и вкус, отосклероз;

8) интенсивные нагрузки на организм .

Медикаментозные взаимодействия препаратов витамина А При применении витамина А необходимо учитывать его взаимодействие с другими витаминами. Так, ретинол ослабляет действиевитамина Д во всех случаях, кроме рахита, и усиливает выведение витамина С. Витамин Д, в свою очередь, ослабляет действие ретинола, витамин Е усиливает его всасывание и разрушение, а витамин С снижает способность печени накапливать витамин А. Исходя из этого, были созданы препараты, содержащие в комплексе бета-каротин, витамины С и Е, селен и другие минералы (Триовит, Три-Ви Плюс и др.) .

Препараты витамина А Производится достаточно много препаратов витамина А: Рыбий жир является основным источником ретинола. Препараты каротина (Каротолин) и масляные растворы ретинола (Ретинола ацетат, Ретинола пальмитат). Комбинированные препараты витаминов А и Е (Аевит) .

Аекол. Содержит в своем составе ретинол и каротин в сочетании с витаминами Е (токоферол) и К (нафтохинон). Такая комбинация повышает эффективность действия входящих в его состав компонентов. Аекол применяют при заболеваниях печени и для стимуляции процессов заживления ран и ожогов .

Рыбий жир. Натуральный препарат, каждая капсула которого содержит 500 мг концентрата рыбьего жира травоядных рыб Северного моря. Рыбий жир содержит полиненасыщенные жирные кислоты Омега-3 (около 40%), которые существенно снижают агрегационную способность тромбоцитов, тем самым предупреждая тромботические заболевания (в том числе тромбозы коронарных сосудов у пациентов с нарушениями свертываемости крови), атеросклероз сосудов. Рыбий жир уменьшает расстройства сократительной функции сердца, способствует снижению смертности при инфарктах миокарда, предупреждает развитие, ограничивает рост и метастазирование рака молочной железы, а также эффективен при опухолях толстой кишки. Препарат принимают по 1-2 капсулы в день после еды в течение длительного времени. Упаковка Рыбьего жира в капсулы защищает препарат от окисления. Три-ви плюс. Антиоксидантный комплекс, в состав которого входят витамины С, Е, бета-каротин, а также минералы цинк, медь и селен .

Три-Ви Плюс применяют для замедления процессов старения организма у лиц пожилого возраста, профилактики осложнений лучевой и химиотерапии онкологических заболеваний, профилактики заболеваний, вызванных стрессами, переутомлением, тяжелой физической нагрузкой, неблагоприятной экологической обстановкой, а также для повышения устойчивости к гриппу, простудным заболеваниям, инфекциям. Принимают по 1 таблетке в сутки во время еды .

Гипервитаминоз А вызывает оранжевое окрашивание кожи ладоней, подошв, повышение внутричерепного давления, головную боль, упадок сил, сонливость, вялость, снижение артериального давления крови, увеличение частоты сердечных сокращений, нарушение функции печени и увеличение ее размеров, снижение содержания белков в крови, нарушения в свертывающей системе крови, кровоизлияния под кожу и слизистые, подавление активности витамина Д, вымывание кальция из костей, развитие остеопороза, нарушение развития плода .

Лабораторная работа – 62 Качественные реакции на витамины (группы Д) .

Цель работы – приобрести умения качественного определения витаминов, необходимые для проведения анализов биологических материалов .

Витаминами называют преимущественно незаменимые низкомолекулярные органические вещества, имеющие разнообразную химическую природу и участвующие в регуляции биохимических процессов на уровне ферментов (как составная их часть). Витамины не являются пластическим материалом и не расходуются в качестве источников энергии .

2. Обнаружение кальциферола (витамин Д) .

Метод основан на взаимодействии кальциферола с бромом с образованием окрашенных продуктов .

Ход работы: В сухую пробирку помещают 2 капли рыбьего жира и 5 капель раствора брома в хлороформе, перемешивают. Через некоторое время наблюдают зеленоватое окрашивание .

Витамин Д регулирует фосфорно-кальциевый обмен, вызывает повышение синтеза различных кальций-связывающих белков, что ведет к усилению всасывания кальция в кишечнике и почках и его отложению в костной ткани .

Показания к применению препаратов витамина Д

Основными показаниями к применению препаратов витамина Д являются:

1) рахит и симптоматический остеопороз (возникающий при сахарном диабете, ацидозе, болезни щитовидной и паращитовидной желез);

2) кариес и дефектное развитие зубов;

3) спазмофилия (мышечные судороги тонического характера);

4) переломы (применение витамина Д ускоряет образование костной мозоли) .

Дополнительными показаниями к применению препаратов витамина Д являются кожные экссудативные процессы, частично связанные с нарушением кальциевого обмена (экземы, нейродермит, экссудативный диатез). Кроме того, избыточно высокие дозы витамина Д могут назначаться больным с туберкулезом легких и кожи, а также при системной красной волчанке .

Препараты витамина Д назначают с целью повышения всасывания кальция в кишечнике у больных, длительно получающих кортикостероиды, а также для коррекции остеопороза у лиц пожилого возраста и у женщин в постменопаузе. В профилактических целях принимать витамин Д могут принимать женщины в период беременности и маленькие дети .

Дозы препаратов Витамина Д Соответствующие дозы и схемы применения препаратов витамина Д должны назначаться врачом с учетом содержания кальция и фосфора в плазме крови .

Суточная потребность в витамине Д:

Взрослые: 2,5 мкг (100 МЕ) .

Женщины в период беременности и кормления грудью: 10-12,5 мкг (400-500 МЕ) .

Новорожденные: 10 мкг (400 МЕ) .

Дети и подростки: 12,5 мкг (400 МЕ) .

Основные эффекты препаратов витамина Д:

1. Остеопластический .

2. Миотонический .

Признаки гиповитаминоза витамина Д: проявляется рахитом у детей и остеомаляцией у взрослых и сопровождается низким содержанием неорганического фосфора в плазме крови, нормальным или низким содержанием в плазме кальция, гипокальциурией, гиперфосфатурией и аминоацидурией. Кроме того, наблюдаются нарушения функции нейромышечного аппарата (вялость скелетной мускулатуры), нарушение нервной регуляции пищеварительного тракта .

У новорожденных и недоношенных детей запасы витамина Д невелики или отсутствуют .

Клиника рахита при рождении никогда не отмечается, а развивается только, по крайней мере, с третьей недели жизни. Принято считать, что в женском молоке содержится только 4% суточной потребности младенца в витамине Д. Большая его часть находится в молоке в виде водорастворимого субстрата. Известно, что низкое содержание кальция в женском молоке ограничивает всасывание витамина Д даже при достаточном его содержании в пище ребенка .

Причины гиповитаминоза витамина Д:

1) нехватка солнечного облучения, не синтезируется достаточное количество витамина Д;

2) нарушение всасывания витамина Д при обтурационной желтухе и стеаторее;

3) нарушение почечного и печеночного метаболизма витамина;

4) применение высоких доз глюкокортикоидов (ингибируют метаболизм витамина Д);

5) применение вазелинового масла (нарушает всасывание витамина Д) .

Применяют различные препараты витамина Д. Наиболее активными являются кальцитриол и альфакальцидол, требования к дозированию которых должны выдерживаться особенно строго .

Часто применяют препараты эргокальциферола (витамин Д2) и холекальциферола (витамин Д3) .

Препараты дигидротахистерола не имеют принципиальных преимуществ по действию .

Альфакальцидол и кальцитриол – препараты, применение которых целесообразно только при выраженных нарушениях фосфорного обмена .

Альфа-Д3-ТЕВА. Действующее вещество препарата – альфакальцидол, являющийся предшественником витамина Д. Этот препарат эффективно применяют при основных типах и формах остеопороза (в том числе постменопаузного, сенильного, стероидного и ювенильного);

остеодистрофии при хронической почечной недостаточности; гипопаратиреозе и псевдогипопаратиреозе; рахите и остеомаляции, связанных с недостаточностью питания или всасывания; гиперпаратиреозе (с поражением костей). После приема внутрь альфакальцидол становится биологически активным только после биотрансформации в печени или непосредственно в костях, что значительно снижает риск развития гиперкальциемии .

Противопоказаниями к приему препарата являются: гиперчувствительность, гиперкальциемия, гиперфосфатемия (кроме таковой при гипопаратиреозе), гипермагниемия, интоксикация витамином Д. Побочные эффекты при приеме препарата не отличаются от возникающих при применении других форм витамина Д, но возникают значительно реже, так как в данном препарате используется наиболее удачный метаболит витамина Д .

Вигантол. Полученный из натурального сырья витамин Д2 (холекальциферол) в каплях не содержит консервантов и красителей, искусственных добавок. Может применяться у недоношенных, новорожденных и грудных детей. Вигантол способствует правильному формированию опорно-двигательного аппарата и структуры зубов. Применяется для профилактики и лечения рахита, спазмофилии и остеомаляции. Препарат обычно хорошо переносится. В редких случаях встречается повышенная чувствительность к витамину Д2. В случае передозировки возможно повышение уровня кальция в крови и/или моче. Соблюдение особой осторожности необходимо у пациентов, получающих лечение тиазидными препаратами, страдающих саркоидозом, а также с ограниченной подвижностью (гипсовая повязка). При приеме Вигантола рекомендуется контролировать уровень кальция в крови и моче. Не следует применять препарат при наличии почечных известковых камней .

Эргокальциферол. Витамин Д2 имеет множество лекарственных форм для профилактического и лечебного использования: драже по 500 МЕ; раствор в масле по 500 или 1000 МЕ в капсулах; раствор в масле 0,0625%, 0,125% или 0,5% (одна капля содержит соответственно 625, 1250 или 5000 МЕ); раствор в спирте 0,5% (одна капля содержит около 4000 МЕ). Препараты витамина Д хранят в условиях, исключающих действие света и воздуха, инактивирующих их; кислород воздуха окисляет витамин Д, а свет превращает его в ядовитый токсистерин .

На рынке представлены комбинированные препараты, содержащие холекальциферол и витамин Д: Витрум Кальциум+Д3, Кальций-Д3 (Никомед), Кальций Седико. Oдновременное поступление в организм кальция и витамина Д, содержащихся в этих препаратах, особенно эффективно для лечения заболеваний, требующих применения витаминов группы Д .

Гипервитаминоз Д и у детей, и у взрослых развивается достаточно редко и только при длительном ежедневном потреблении его в дозе 5 000 ЕД или более. Избыточный прием витамина Д может привести к гиперкальциемии, сохраняющейся иногда в течение нескольких месяцев после прекращения приема из-за длительного периода полувыведения витамина Д, торможению роста у детей, отложению кальция в стенках артерий и почечных канальцев, гипертонии, аритмиям, нарушениям функции печени, потере аппетита, тошноте. Изменения со стороны ЦНС свидетельствуют о тяжелой гиперкальциемии (более 150 мг/л), которая требует срочной коррекции .

Лабораторная работа – 63 Качественные реакции на витамины (группы Е) .

Витамин Е содержится в растительных маслах (подсолнечном, кукурузном, облепиховом, соевом), молоке, яйцах .

Биологическая роль витамина Е заключается в защите мембран клеток от повреждения. Кроме того, витамин Е (токоферол) стимулирует синтез некоторых белков, включая белки скелетных и гладких мышц, миокарда и ферменты синтеза половых гормонов – гонадотропинов, а также гема и гем-содержащих белков (гемоглобин, миоглобин, цитохромы, каталаза, пероксидаза). Кроме того, витамин Е повышает безопасность применения НПВП и сердечных гликозидов, снижая их токсичность .

Суточные дозы витамина Е:

Взрослые: 10-20 мг .

Женщины в период беременности и кормления грудью: 15-30 мг .

Новорожденные: 4-5 мг .

Дети и подростки: 7-15 мг .

Применение препаратов витамина Е показано:

1) недоношенным детям, при искусственном вскармливании;

2) при проведении сеансов кислородотерапии под избыточным давлением для профилактики токсического действия кислорода;

3) при комплексном лечении различных анемий, особенно связанных с разрушением эритроцитов;

4) при лечении различных гипотрофий и дистрофий миокарда;

5) для стимуляции синтеза антител и неспецифических факторов резистентности к инфекции;

6) при лечении некоторых форм бесплодия и при патологии беременности (способствует нормальному развитию и функции плаценты) .

Витамин Е применяют также при профилактике и лечении рахита (усиливает лечебное действие витаминов Д и С) и для предотвращения осложнений при передозировке витаминов Д и А .

Препараты витамина Е Витрум витамин Е. Мощный природный антиоксидант. Нейтрализует свободные радикалы, превращая их в безвредные вещества, которые выводятся из организма .

Замедляет процессы старения, обладает омолаживающим зффектом; предупреждает развитие атеросклероза, снижает риск развития ишемической болезни сердца, инсулинозависимость, усиливает иммунитет, снижает утомляемость, уменьшает влияние канцерогенных веществ, восстанавливает репродуктивные функции, повышает мужскую потенцию, снимает усталость .

Является прекрасным средством для лечения ожогов. Витрум Витамин Е выпускается в капсулах .

Доппельгерц витамин Е форте. Растительный препарат витамина Е, полученный из молодых ростков злаков. Применяется при гиповитаминозах, в период выздоровления после заболеваний, протекавших с лихорадочным синдромом, при высоких физических нагрузках, в пожилом возрасте, при заболеваниях связочного аппарата и мышц. Эффективен при климактерических вегетативных нарушениях, дегенеративных и пролиферативных изменениях суставов и связочного аппарата позвоночника и крупных суставов. Противопоказания к приему препарата не выявлены .

С осторожностью применяют при тяжелом кардиосклерозе, инфаркте миокарда, повышенном риске развития тромбоэмболий. Поскольку многие соли железа разрушают витамин Е, препараты, содержащие железо, следует принимать внутрь с интервалом в несколько часов до или после приема капсул препарата. Каждая капсула содержит 147 мг (200 МЕ) растительного витамина Е .

Рекомендуемая дозировка: 100-300 мг в сутки. Капсулы не разжевываются .

Супер формула антиоксидантов. Эта специальная суперформула содержит повышенные дозы важнейших антиоксидантов (витамина А – 20 000 МЕ, витамина Е – 200 МЕ, витамина С – 200 мг) В сочетании с минералами (селен – 100 мг, цинк – 12 мг, кальций – 15 мг) и комплексом продления жизни. Также добавлены концентраты моркови, апельсинов и миндаля. Препарат выпускается в капсулах, которые рекомендуется применять по 2 в день .

Гипервитаминоз Е. Длительный прием витамина Е в дозах от 100 до 800 мг не вызывает побочных реакций. Возможны проявления токсического действия витамина Е при парентеральном введении больших доз (креатинурия, потенцирование коагулопатии при недостаточности витамина К и ухудшение заживления ран), возможно также снижение эффективности фагоцитоза, повышение риска септических осложнений .

Опыт 1. Реакция витамина Е с азотной кислотой .

Витамин Е окисляется концентрированной азотной кислотой в хиноидное соединение, окрашенное в красный или красно-коричневый цвет .



Pages:   || 2 |



Похожие работы:

«ОГУК "Орловская областная публичная библиотека им. И. А. Бунина" Отдел экологической информации и сельскохозяйственной литературы Год планеты Земля (Информационно-библиографическое пособие) Орел 2008 г. Год планеты Земля: информационно библиографическое пособие / Орл. о...»

«Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Ставропольский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации Кафедра гистологии МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦ...»

«ISSN 0869-4362 Русский орнитологический журнал 2012, Том 21, Экспресс-выпуск 824: 3077-3120 Обзор орнитофауны болгарского горного массива Врачанска-Планина Д.Н.Нанкинов Димитр Николов Нанкинов. Болгарский орнитологический центр, Институт зоологии Болгарской академии наук, бульвар Царя Освободителя, 1, София – 1000, Болгария. E-mail:...»

«УДК 582.26(571.56) ГИДРОФИТЫ И ВИДОВОЙ СОСТАВ ЭПИФИТОНА ОЗЕРА ЧОНО (БАССЕЙН РЕКИ ЯНА) Копырина Л.И. ФГБУН "Институт биологических проблем криолитозоны" СО РАН, Якутск, e-mail: l.i.kopyrina@mail.ru Приведены результаты изучения видового состава эпифи...»

«Инструкция подготовлена в рамках проекта "Azure Flame" при финансовой поддержке "Europe AID", HIVOS. При подготовке инструкции использовался опыт строительства биогазовых установок (БГУ), накопленный сотрудниками Карагандинского Экологического Музея в процессе выполнения проектов "Биогаз" (ПМГ ГЭФ ПРООН), "Биогазовый Цен...»

«Электронный журнал "Язык и текст langpsy.ru" E-journal " Language and Text langpsy.ru "2015. Том 2. № 3. С. 91–96. 2015, vol. 2, no. 3, pp. 91–96. doi: 10.17759/langt.2015020311 doi: 10.17759/langt.2015020311 ISSN: 2312-2757 (online) ISSN: 2312-2757 (online) Лингвоэкология этностереотипов современного медийного простра...»

«Приложение 4 Минимальные баллы. Порядок проведения вступительных испытаний творческой и(или) профессиональной направленности 4.1. Минимальное количество баллов для проводимых организацией самостоятельно общеобразовательных вступительных испыта...»

«ОТЗЫВ официального оппонента на диссертационную работу Дарьи Сергеевны Логвиновой "Роль "существенных" легких цепей миозина в процессе работы миозиновой головки", представленную на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.01.04 – "Биохимия" Акту...»

«Балтийский федеральный университет им. Иммануила Канта XXX МЕЖДУНАРОДНАЯ ШКОЛА-СИМПОЗИУМ ПО ГОЛОГРАФИИ, КОГЕРЕНТНОЙ ОПТИКЕ И ФОТОНИКЕ Материалы школы-симпозиума Россия, Калининград 2—6 октября 2017 года Калининград XXX Школа-симпозиум по голографии, когерентной оптике и фотонике УДК 535.4 ББК 22.343.4 М433...»

«СРГ ПДООС ПОВЕСТКА ДНЯ УЧЕБНОГО СЕМИНАРА "ОЦЕНКА ЭКОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЕКТОВ, ФИНАНСИРУЕМЫХ ЗА СЧЕТ ГОСУДАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ" УЧЕБНЫЙ СЕМИНАР ДЛЯ ЭКСПЕРТОВ МОЛДОВЫ 16 – 19 ЯНВАРЯ 2007 Г., КИШИНЕВ Исходная информация Последние несколько лет совершенствование управления государственными природоохранными расходами, в целом, и государственны...»

«Гевеиноподобные антимикробные пептиды растений Успехи биологической химии, т. 57, 2017, с. 209–244 ГЕВЕИНОПОДОБНЫЕ АНТИМИКРОБНЫЕ ПЕПТИДЫ РАСТЕНИЙ А. А. СЛАВОХОТОВА1, 2, 8 2017 г. А. А. ШЕЛЕНКОВ2, Я. А. АНДРЕЕВ1, 3, Т. И. ОДИНЦОВА2 Институт...»

«Современные проблемы дистанционного зондирования Земли из космоса. 2016. Т. 13. № 5. С. 277–290 Повышение детальности спутникового картографирования теплофизических характеристик земной поверхности С.Г. Крицук, В.И. Горный, И.Ш. Латыпов Санкт-Петербургский научно-исследовательский центр экологической безопас...»

«ДОПОЛНЕНИЕ J ОТЧЕТ О ПРОМЫСЛЕ: DISSOSTICHUS ELEGINOIDES, ОСТРОВА ПРИНС-ЭДУАРД, ИЭЗ ЮЖНОЙ АФРИКИ (ПОДРАЙОНЫ 58.6 И 58.7) TOP 58.6, 58.7, ИЭЗ Южной Африки СОДЕРЖАНИЕ Стр . Информация о промысле Зарегистрированный вылов (временные ряды) ННН вылов Размерный состав уловов (временные ряды) Запасы и районы...»

«Сетевое издание Центра психологического сопровождения образования "ТОЧКА ПСИ" tochkapsy.ru И. Г. Яшина, АНО ЦО "Знак", г. Москва УРОК БИОЛОГИИ В ДЕВЯТОМ КЛАССЕ. СЕЛЕКЦИЯ КАК СОЗДАНИЕ И ИЗМЕНЕНИЕ КУЛЬТУРНЫХ ФОРМ. Н. И. ВАВИЛОВ Тема: Селекция как создание и изменение культурных форм. Н.И.Вавилов Место урока в изучаемом разд...»

«Григорчук Елена Викторовна, учитель начальных классов МБОУ "Заозерненская средняя школа города Евпатории Республики Крым" (nysik69@mail.ru) Классный час для учащихся 3 класса "Люди всей планеты, берегите первоцветы!"Цели: формировать уме...»

«Крестов Павел Витальевич РАСТИТЕЛЬНЫЙ ПОКРОВ И ФИТОГЕОГРАФИЧЕСКИЕ ЛИНИИ СЕВЕРНОЙ ПАЦИФИКИ 03.00.05 – ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Владивосток 2006 Работа выполнена в лаб...»

«Вестник Томского государственного университета. Биология. 2013. № 2 (22). С. 150–159 ФИЗИОЛОГИя РАСТЕНИЙ УДК 581.1 doi: 10.17223/19988591/22/12 Ю.В. Иванов, Ю.В. Савочкин Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН (г. Москва) ИЗОФЕРМЕНТ...»

«GREENPEACE ГРИНПИС Отделение международной неправительственной некоммерческой организации Совет Гринпис – ГРИНПИС 125040, Москва, Ленинградский пр-т, д.26, корп.1, тел./факс (495) 988-74-60 E-mail: info@greenpeace.ru http://www.greenpeace.ru Министру природных ресурсов и охраны № 16/535 окружающей среды Республики Коми...»

«Воронежская область Постановление от 10 мая 2012 года № 382 Об утверждении Положения о департаменте природных ресурсов и экологии Воронежской области Принято Правительством Воронежской области 10 мая 2012 года В ред...»

«Нутриенты 2011, 3, 442-474; doi: 10.3390 / nu3040442 nutrients ISSN 2072-6643 www.mdpi.com/journal/nutrients Обзор Перспективы в отношении иммуноглобулинов в молозиве и молоке Уолтер Л. Херли 1, * и Питер К. Тель 2 1 Отдел изучения животных, Иллинойсский университет в Урбане-Шампейне,...»

«Современные педагогические технологии СОВРЕМЕННЫЕ ПЕДАГОГИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ Мостовая Алла Николаевна учитель биологии МКОУ "СОШ№16" п. Солнечнодольск, Ставропольский край ПРИМЕНЕНИЕ НОВЫХ СТАНДАРТОВ В ОБУЧЕНИИ БИОЛОГИИ В ОБЩЕОБРАЗОВАТЕЛЬНОЙ ШКОЛЕ Если мы б...»




 
2019 www.mash.dobrota.biz - «Бесплатная электронная библиотека - онлайн публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.