WWW.MASH.DOBROTA.BIZ
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - онлайн публикации
 

Pages:   || 2 |

«Макаревич Ольга Александровна СТИМУЛЯЦИЯ МИГРАЦИИ И ИЗМЕНЕНИЕ СЕКРЕЦИИ МСК ЧЕЛОВЕКА ПРИ СОКУЛЬТИВИРОВАНИИ С МАКРОФАГАМИ 03.03.04 – Клеточная биология, цитология, гистология ДИССЕРТАЦИЯ ...»

-- [ Страница 1 ] --

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ИМЕНИ М.В. ЛОМОНОСОВА

На правах рукописи

Макаревич Ольга Александровна

СТИМУЛЯЦИЯ МИГРАЦИИ И ИЗМЕНЕНИЕ СЕКРЕЦИИ МСК ЧЕЛОВЕКА

ПРИ СОКУЛЬТИВИРОВАНИИ С МАКРОФАГАМИ

03.03.04 – Клеточная биология, цитология, гистология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

Кандидат биологических наук В.Ю. Сысоева Москва, 2016

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общие принципы регенерации ткани

1.2. Мезенхимные стромальные клетки (МСК): определение и общие положения

1.3. Источники получения МСК

1.4. Роль МСК в регенерации и репарации: секреторные свойства.................. 16

1.5. Взаимодействие МСК и клеток иммунной системы

1.5.1. Регуляция МСК с участием факторов, секретируемых клетками иммунной системы

1.5.2. Влияние МСК на развитие иммунного ответа: иммуносупрессивные свойства

1.5.3. Взаимодействие МСК с макрофагами

1.6. Моделирование воспалительного окружения с помощью THP-1.............. 32



1.7. Миграция МСК in vitro и in vivo

1.7.1. Общие положения

1.7.2. Механизм хоуминга МСК

1.7.3. Хемотаксис МСК: хемокины и факторы роста

1.7.4. Гаптотаксис: роль внеклеточного матрикса

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Культивируемые клетки

2.2. Выделение мезенхимных стромальных клеток из жировой ткани............. 53

2.3. Иммунофенотипирование МСК

2.4. Выделение фибробластов дермы человека

Запуск макрофагальной дифференцировки THP-1 и анализ профиля 2.5 .

экспрессии макрофагов

Культивирование МСК в среде, кондиционированной THP-1................ 55 2.6 .

–  –  –

Выделение РНК из клеток

2.8 .

Количественная ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени.. 57 2.9 .

Анализ профиля экспрессии генов с применением системы RT2 Profiler 2.10 .

PCR Array

Обработка результатов количественного анализа уровня экспрессии 2.11 .

генов..………………………………………………………………………………..59 Коллекционирование кондиционированной среды

2.12 .

Анализ уровня белков в кондиционированной среде методом ИФА...... 60 2.13 .

Scratch assay (модель раны монослоя)

2.14 .

Миграция в системе xCELLigence

2.15 .

Иммуноцитохимия

2.16 .

Электрофорез белков и иммуноблоттинг

2.17 .

Статистическая обработка

2.18 .

3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Иммунофенотипирование МСК

–  –  –

3.3. Анализ уровня провоспалительных цитокинов и хемокинов, секретируемых макрофагами

–  –  –

IL6

IL1

3.6. Анализ профиля экспрессии генов хемокинов и их рецепторов МСК после сокультивирования с помощью системы RT2 Profiler PCR Array

2.6.1. Экспрессия генов хемокинов

2.6.2. Экспрессия генов рецепторов к хемокинам



3.7. Анализ уровня хемокинов в среде сокультивирования МСК и макрофагов.………………………………………………………………………….79 CCL2 (MCP-1)

CCL3 (MIP-1)

CCL1

3.8. Анализ экспрессии генов металлопротеиназ и системы урокиназы, отвечающих за клеточную миграцию, в МСК после сокультивирования.......... 81

3.9. Изменение морфологии МСК при сокультивировании с макрофагами..... 82 Исследование изменений фокальных контактов МСК в условиях 3.10 .

сокультивирования с макрофагами

Подвижность МСК в среде кондиционированной макрофагами 3.11 .

(ненаправленная миграция)

–  –  –

Направленная миграция МСК на хемокины и факторы роста................ 88 3.13 .

Предварительное сокультивирование с макрофагами не влияет на 3.14 .

скорость хемотаксиса МСК по градиенту хемокинов

–  –  –

При сокультивировании с макрофагами в МСК возрастает уровень 3.16 .

экспрессии гена PDGFR и его белка

Блокирующие антитела к PDGF-BB не влияют на скорость миграции МСК 3.17 .

через фибронектин

–  –  –

При сокультивировании с макрофагами в МСК возрастает уровень 3.19 .

экспрессии генов интегринов 3, 4, 5, 1 и уровень белка - интегрина 1 (CD29)………………………………………………………………………………..95 При связывании МСК с фибронектином увеличивается уровень 3.20 .

фосфорилированного Akt под действием макрофагов

При сокультивировании МСК с макрофагами изменяется уровень 3.21 .

экспрессии генов белков внеклеточного матрикса

4. ОБСУЖДЕНИЕ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования Мезенхимные стромальные клетки (МСК) являются одним из наиболее перспективных объектов в регенеративной медицине и клеточной терапии заболеваний человека. Известно, что МСК играют центральную роль в регенеративных процессах в организме, принимая участие, как в физиологической, так и в репаративной регенерации. При этом механизмы, за счет которых МСК регулируют регенеративные процессы (оказывая иммуномодулирующее действие, стимулируя реваскуляризацию и нейрогенез, активируя пролиферацию региональных стволовых клеток и формируя внеклеточный матрикс) представляются ключевыми как для фундаментальной науки, так и для новой области трансляционной науки – регенеративной медицины .

Долгое время считалось, что основной вклад в регенерацию МСК вносят, мигрируя в зону повреждения и дифференцируясь в ее функциональные элементы для замещения утраченных компонентов ткани. Однако при трансплантациях МСК оказалось, что лишь относительно небольшая доля клеток способна к интеграции в ткани реципиента. В исследованиях на животных с системным введением МСК при инфаркте миокарда (Ko, et al. 2008), неврологических заболеваниях (Safford, et al .

2004) и аутоиммунных расстройствах (Gonzlez, et al .



2009) практически не было обнаружено встраивания этих клеток в зону повреждения. В настоящее время наиболее вероятным механизмом влияния МСК на репарацию называют их паракринную активность, поскольку среди секретируемых ими факторов обнаружено несколько десятков белков, регулирующих процессы репарации и иммуномодуляции (Kalinina, et al. 2015). В свете этих данных актуальным остается вопрос о механизмах запускающих изменения в секреции МСК в тканях под влиянием воспалительного процесса .

Еще одной важной частью действия МСК в регенеративных процессах является их способность к хоумингу – направленной миграции в зону повреждения. Хоуминг МСК - это сложный процесс, который зависит от скоординированного взаимодействия между хемокинами, рецепторами хемокинов, молекулами адгезии и протеазами. Существует гипотеза, что воспалительное окружение способно активировать хоуминг МСК, но выявление механизмов данного процесса in vivo затруднено, особенно при системном введении клеток. Поэтому актуальной остается проблема разработки моделей in vitro взаимодействия МСК с иммунными клетками для установления механизмов запуска миграции МСК в зону повреждения. Таким образом, выяснение молекулярных механизмов активации МСК при воспалении имеет большое значение, как с фундаментальной точки зрения, так и для разработки новых терапевтические стратегий или оптимизации эффективности уже существующих методов клеточной терапии .

Цель исследования Выявить изменения секреторной и миграционной активности, происходящие в МСК под влиянием воспалительных факторов, выделяемых макрофагами, и исследовать механизмы их активации .

Задачи исследования

1. На модели экспериментального воспаления in vitro оценить влияние паракринных факторов, выделяемых макрофагами, на продукцию цитокинов и хемокинов МСК человека .

2. Проанализировать изменения миграционной активности МСК при бесконтактном сокультивировании с макрофагами .

3. Выявить механизмы влияния макрофагов на миграцию МСК .

4. Определить влияние бесконтактного действия макрофагов на продукцию МСК белков внеклеточного матрикса .

Научная новизна Исследованы изменения морфологии, секреции и миграции МСК при бесконтактном сокультивировании с макрофагами. Впервые показано, что хемокины, вырабатываемые моноцитами в первые сутки после активации макрофагальной дифференцировки, вызывают рост уровня экспрессии генов провоспалительных хемокинов и цитокинов в МСК. Впервые показано, что паракринные факторы макрофагов приводят к повышению чувствительности МСК к одному из основных хемоаттрактантов МСК – PDGF-BB. В работе предложен возможный молекулярный механизм, объясняющий данный феномен. Впервые показана роль фибронектина в активации хоуминга МСК в провоспалительном окружении .

Практическая значимость работы Разработана in vitro модель экспериментального воспаления, которая может быть использована для исследования механизмов активации МСК при развитии воспаления. Экспериментальные результаты работы и полученные данные о механизме хоуминга МСК могут быть использованы для оптимизации протоколов клеточной терапии и повышения ее эффективности и безопасности. Полученные фундаментальные данные о механизмах активации МСК и роли PDGF могут быть использованы для разработки новых подходов к стимуляции эндогенной регенерации .

Степень достоверности и апробация результатов Полученные в ходе работы результаты были доложены на российских и зарубежных международных конференциях. Результаты были представлены на конгрессе ведущего научного сообщества – Федерации Европейского сообщества биохимиков (FEBS) в 2012 году и опубликованы в сборнике тезисов этого мероприятия. Также результаты были доложены на Всероссийской научной конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина» в 2010 и 2011 гг., Научной конференции молодых ученых «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (2011 г.), конференциях «Биологическая подвижность: фундаментальная и прикладная наука» (2012 г.) и «Физиологические механизмы регуляции деятельности организма» (2012 г.) .

Результаты, полученные во время работы над диссертацией, были использованы при выполнении государственного контракта по соглашению о субсидии № 14.607.21.0045 от 22 августа 2014 г. "Получение композиций, содержащих секретируемые компоненты стволовых клеток" (уникальный идентификатор проекта RFMEFI60714X0045) .

По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них – 5 в резензируемых журналах, входящих в перечень ВАК РФ .

Апробация работы состоялась 18 ноября 2014 г на совместном заседании кафедры биохимии и молекулярной медицины, лаборатории генных и клеточных технологий, лаборатории постгеномных технологий факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова и лаборатории ангиогенеза ФГБУ РКНПК МЗ РФ .

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Общие принципы регенерации ткани 1.1 .

Под термином «регенерация» подразумевается способность живых организмов восстанавливать поврежденные ткани и органы. В зависимости от факторов, вызвавших повреждение, регенерация может быть как физиологической, так и репаративной. Физиологическая регенерация - это восстановление и обновление всех тканей, которое происходит на протяжении всей жизни. Классический пример физиологической регенерации – это гемопоэз, который происходит в костном мозге с участием гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), открытых Александром Александровичем Максимовым в начале двадцатого века (Maximow 1909). Позднее в костном мозге Александром Яковлевичем Фриденштейном были обнаружены отличные от гематопоэтических клетки (Friedenstein, et al. 1966), также обладающие свойством стволовости – мезенхимные клетки (МСК). Позднее было показано, что МСК костного мозга играют ключевую роль в создании и поддержании ниши для ГСК костного мозга (Freidenstein, et al. 1968; Horwitz, et al. 2011) и в репаративной регенерации, которая происходит в результате повреждения ткани (Horwitz, et al .

2008) (рисунок 1) .

Рисунок 1. Гемопоэтические и стромальные клетки в костном мозге принимают участие в физиологической регенерации .

© 2001 Terese Winslow .

Репарация тканей всегда начинается с развития воспалительной реакции .

Иммунные клетки, которые с первых минут появляются в зоне повреждения, вырабатывают факторы роста и цитокины. Эти белки стимулируют наступление следующей фазы регенерации – пролиферации и миграции клеток. В ходе этой фазы в зону повреждения начинают прорастать сосуды и нервы, сюда мигрируют как тканеспецифичные предшественники, формирующие функциональные элементы ткани, так и стромальные клетки, восстанавливающие каркас ткани (рисунок 2). По существующей гипотезе, важную роль в этом процессе играют МСК, которые способны взаимодействовать с иммунными клетками (Meirelles, et al. 2009) и модулировать воспалительный процесс с одной стороны, а с другой - стимулировать прогресс пролиферативной фазы регенерации за счет привлечения в поврежденную зону различных клеточных типов и поддержания их жизнеспособности, секреции внеклеточного матрикса и факторов роста (Brooke, et al. 2007). Конкретные механизмы стимуляции регенерации ткани с участием МСК широко обсуждаются в настоящее время .

Рисунок 2. Схема событий при репаративной регенерации ткани .

Мезенхимные стромальные клетки (МСК): определение и общие 1.2 .

положения Мезенхимные стромальные клетки (МСК) были открыты и охарактеризованы А.Я. Фриденштейном в 1966 году (Friedenstein, et al. 1966), когда впервые он обнаружил эти клетки в костном мозге. Позднее эти клетки были обнаружены и описаны во многих органах и тканях и выделены в культуру. Полученные из разных источников, МСК характеризуются рядом общих свойств, среди которых фибробластоподобная морфология и высокая адгезия к пластику. Показано, что при определенных условиях относительно легко вызвать дифференцировку МСК in vitro в остео-, хондро-, и адипогенном направлениях (Caplan 1991). Исследования прошлых лет указывают, что помимо классических направлений дифференцировки МСК могут превращаться в миоциты (Bacou, et al. 2004), эндотелиальные (Oswald, et al. 2004) клетки сосудов, кардиомиоциты (Rangappa, et al. 2003), а также дифференцироваться в нейрональном направлении (Safford, et al. 2004) (рисунок 3) .

Рисунок 3. Направления дифференцировки МСК, выделенных из жировой ткани .

Адаптировано из обзора Калининой с соавт. (Kalinina, et al. 2011) Однозначного маркера для МСК, культивируемых in vitro, не существует .

Список существующих маркеров постоянно меняется и дополняется, однако согласно существующему Положению Международного Общества клеточной терапии (International Society for Cellular Therapy Statement), более 95% МСК человека должны экспрессировать такие маркеры как CD73 (экто-5’-нуклеаза), CD90 (THY1 - антиген тимоцитов) и CD105 (эндоглин), при этом экспрессия таких маркеров как CD14, CD19, CD34, CD45, CD79 и HLA-DR (человеческий лейкоцитарный антиген) (маркеры гематопоэтических стволовых клеток) должна наблюдаться не более чем у 1-2% клеток (Dominici, et al. 2006). Кроме того к маркерам МСК некоторые исследователи относят CD44, CD71, ганглиозид GD2, STRO-1 и другие молекулы .

Такое определение МСК не является исчерпывающим. Так, согласно некоторым исследованиям, свежевыделенные МСК костного мозга и жировой ткани, и могут содержать клетки несущие маркер CD34, характерный, для гемопоэтических стволовых клеток (Lin, et al. 2012). Ко второму пассажу клетки несущие данный маркер исчезают из популяции. (Lin, et al. 2012). По данным других исследователей, популяция МСК может содержать примеси клеток экспрессирующие маркеры CD45, или CD31, характерные для лейкоцитов и клеток эндотелия, соответственно. Кроме того, популяция МСК содержит около 0,3% клеток, несущих комбинацию маркеров, характерных для стволовых мезенхимных клеток (СD271, СD56 и MSCA-1 - антиген мезенхимных стволовых клеток) (Battula, et al. 2009). Количество разных субпопуляций в составе гетерогенной популяции МСК может существенно отличаться и по мнению исследователей зависит от типа ткани, донора и способа выделения клеток. Эти данные показывают, что определение МСК требует дальнейшей доработки и обсуждения .

In vivo МСК могут располагаться периваскулярно (Lin, et al. 2008) (рисунок 4), кроме того, показано, что большинство этих клеток in vitro экспрессируют поверхностные маркеры NG2 (антиген нейронов и глиальных клеток) и PDGFR (CD140b, рецептор фактора роста, выделенного из тромбоцитов) (Maumus, et al. 2011;

Traktuev, et al. 2008), что позволяет некоторым исследователям причислять их к перицитам (Shi, et al. 2003) .

А. Б .

Рисунок 4. Морфология культивируемых МСК, (А); МСК в жировой ткани мыши, иммунофлуоресценция, красный – CD31, зеленый – МСК, синий – ядра DAPI (Б) .

Масштабный отрезок 100µм .

Источники получения МСК 1.3 .

Впервые МСК были выделены и охарактеризованы в костном мозге, и большая часть исследований проведена на этих клетках. Позднее МСК были обнаружены во многих органах и тканях, таких как жировая ткань (Zuk, et al. 2001), плацента (In 't Anker, et al. 2004), кожа (Shih, et al. 2005), пуповина (Sarugaser, et al. 2005), пуповинная кровь (Erices, et al. 2000), пульпа зуба (Gronthos, et al. 2000), амниотическая жидкость (In 't Anker, et al. 2003), синовиальная мембрана (De Bari, et al. 2001), скелетные мышцы (Lecourt, et al. 2010), эндометрий (Chan, et al. 2004) и других .

Фенотипически МСК, выделенные из костного мозга (МСК-КМ) и жировой ткани (МСК-ЖТ), имеют много общих характеристик. В таблице 1 представлена экспрессия поверхностных маркеров этих двух видов клеток. Однако вопрос об идентичности (в первую очередь функциональной) до сих пор остается открытым. Безусловно, преимущества использования МСК жировой ткани для терапевтических целей очевидны. Если количество МСК в костном мозге относительно невелико (1 из 25.000-100.000 ядерных клеток в костном мозге, что позволяет выделять порядка 100клеток из 1 мл аспирата) и при этом уменьшается с возрастом пациента, то в сильно васкуляризированной жировой ткани число МСК достигает 2% от всех ядерных клеток, что позволяет выделить около 5000 клеток из 1 г жировой ткани (Strem, et al. 2005) .

Таблица 1. Набор поверхностных маркеров, характерных для МСК, выделенных из жировой ткани (ADSCs – adipose derived stem cells) и МСК костного мозга (MSCs – mesenchymal stem cells) .

Адаптировано из работы Strem и соавт. (Strem, et al. 2005) .

Транскриптомный и протеомный профиль МСК, выделенных из костного мозга и жировой ткани, во многом схож, однако существуют отличия (Izadpanah, et al. 2006; Park, et al. 2007). Группа ученых проанализировала экспрессию 384 генов в двух этих типах клеток. 3,4% всех проанализированных генов экспрессировались только в одной из популяций МСК, а 9,7% генов обладали разным уровнем экспрессиии в костномозговых МСК и МСК выделенных из жировой ткани (Nol, et al. 2008). Гены, экспрессированные только в костномозговых МСК, относились к WNT-сигналингу (WNT11, WNT7B, SOX6), в то время как МСК, выделенные из жировой ткани экспрессировали гены, вовлеченные в межклеточные взаимодействия (CCL3, FGF9, IL1R2, KDR) и контроль транскрипции. Протеомный анализ (2D электрофорез) показал, что 23% белков секретируются одним типом МСК, а 18% белков секретируются МСК-КМ и МСК-ЖТ на разном уровне (Nol, et al. 2008). Как будет рассмотрено дальше, секреция белков является одним из основных механизмов участия МСК в репарации и регенерации, поэтому выявление таких различий является важной частью исследования этих типов клеток .

Роль МСК в регенерации и репарации: секреторные свойства 1.4 .

Мезенхимные клетки играют важную роль как в физиологической (Chan, et al .

2004), так и в регенеративной репарации, т.е. восстановлении ткани после повреждения. Многими исследователями на моделях in vivo была показана эффективность введения МСК для восстановления ткани после определенных повреждений, в том числе для лечения трофических язв и ожогов (Kim, et al. 2009;

Natesan, et al. 2011), инфаркта миокарда (Gimble, et al. 2007; Madonna, et al. 2009;

Nombela-Arrieta, et al. 2011; Pittenger, et al. 2004), повреждения легких (NombelaArrieta, et al. 2011), мышц, печени и почек (Nauta 2007; Nombela-Arrieta, et al. 2011), спинного и головного мозга (при инсультах и нейродегенеративных заболеваниях) (Hofstetter, et al. 2002; Riordan, et al. 2009; Sasaki, et al. 2009; Yoon, et al. 2007; Zuk 2010). Кроме того, доказана способность МСК стимулировать ангиогенез (Gimble, et al. 2007; Miyahara, et al. 2006; Nakagami, et al. 2006; Rehman, et al. 2004; Rubina, et al .

2009) и восстановление периферической иннервации (Carlson, et al. 2011; Kucerova, et al. 2007; Lopatina, et al. 2011; Pittenger, et al. 2004; Traktuev, et al. 2008) .

По данным NIH (National Institute of Health) (СlinicalTrials.gov) на конец 2016 года в мире проводится более 5776 клинических исследований с применением стволовых клеток, из которых значительная часть (666, около 11,5%) проводятся с использованием мезенхимных стромальных клеток. МСК стали одним из наиболее распространенных и эффективных объектов для клеточной терапии благодаря безопасности их использования в практике, перспективным клиническим эффектам и относительно невысоким экономических затратам, с которыми связано их применение. Однако до сих пор механизмы действия МСК in vivo продолжают обсуждаться, и наше представление о них меняется в свете накапливаемой информации .

Впервые МСК были успешно применены в клинике в середине 1990х, когда аутологичные клетки были использованы в терапии пациентов с раком молочной железы, которым проводилась аутологичная трансплантация гематопоэтических клеток (I стадия исследования) (Lazarus, et al. 1995). Предложенный механизм основывался на способности МСК мигрировать в костный мозг и восстанавливать его микроокружение. После того, как была показана их безопасность, была проведена II фаза испытаний, в которой показали, что совместное введение МСК и ГСК приводит к уменьшению периода встраивания ГСК и восстановления гемопоэза (Ko, et al .

2000). Таким образом была показана способность МСК при системном введении мигрировать в ткань и поддерживать гемопоэз .

Изучение механизма реализации этой функции МСК привели к обнаружению в костном мозге популяции МСК, экспрессирующих один из белков промежуточных филаментов - нестин. Авторы показали, что именно нестин-положительные клетки обладают свойствами стволовости и выполняют функцию регуляции состояния ГСК, т.е. участвуют в создании кроветворной ниши (Mendez-Ferrer, et al. 2010). В дальнейшем такие клетки (MSC-nestin+) были обнаружены в жировой ткани, причем доказано их происхождение из нервного гребня (Sowa, et al. 2013) .

Другой особенностью МСК, определяющей их участие в регенеративных процессах считается их способность к дифференцировке в функционально активные элементы ткани. В 1995 году было проведено исследование, которое показало распределение генетически меченых МСК, введенных системно. Клетки, введенные мыши в хвостовую вену, были обнаружены в костном мозге, селезенке, костях, легких и хрящах животных-реципиентов (Pereira, et al. 1995). Авторы показали, что раз МСК способны мигрировать в костную ткань in vivo и дифференцироваться в кость in vitro, в модели несовершенного остеогенеза у мышей они будут способны встраиваться в костную ткань и вносить свой вклад в синтез нормального коллагена (Pereira, et al .

1998). Эти исследования на мышах стали отправной точкой для первого клинического исследования по пересадке костного мозга детям, страдающим несовершенным остеогенезом. При этом впервые костный мозг был использован не как источник ГСК, а как источник МСК (Horwitz, et al. 1999). В следующем исследовании была показана эффективность введения аллогенных культивированных МСК при несовершенном остеогенезе (Horwitz, et al. 2002). В обоих исследованиях был показан благотворный эффект введения МСК на толщину костей и минерализацию, что дало основания полагать, что МСК могут участвовать в формировании костной ткани .



Таким образом, в пользу эффективности введения МСК, говорило предположение о дифференцировке введенных клеток в функциональные компоненты поврежденной ткани в зависимости от микроокружения. Однако исследования достоверно подтвердили лишь дифференцировку МСК in vivo в клетки мезенхимной линии. Важно отметить, что есть лишь два заболевания, при которых системное введение МСК приводит именно к встраиванию клеток в ткань. У человека

– это несовершенный остеогенез (Horwitz, et al. 2002) и реакция трансплантат против хозяина - GVHD (Le Blanc, et al. 2004). Несмотря на то, что in vivo в популяции мезенхимных клеток обнаруживается экспрессия маркеров кардиомиоцитов, нейронов, глии (астроцитов и олигодендроцитов), эти данные не подтверждены появлением, например, функциональных кардиомиоцитов, дифференцированных из экзогенных МСК. В доклинических исследованиях системного введения МСК при остром инфаркте миокарда, нейрональных заболеваниях и аутоиммунных расстройствах практически не обнаруживали встраивания этих клеток в поврежденную зону. Таким образом, данный механизм встраивания МСК и дифференцировки их в функциональные элементы ткани, вероятно, не является основным при трансплантации МСК .

Другим механизмом, определяющим участие МСК в репарации, может быть слияние клеток. Во-первых, в 2007 году было показано, что трансплантированные МСК могут служить донорами митохондрий для клеток поврежденных тканей, таким образом, поддерживая их аэробный метаболизм (Gimble, et al. 2007). Позднее был зафиксирован факт слияния МСК с клетками других тканей (нейронами, кардиомиоцитами, гепатоцитами) (Alvarez-Dolado, et al. 2003; Nombela-Arrieta, et al .

2011). Другая группа исследователей, обнаружившая встраивание экзогенных МСККМ в зону инфаркта миокарда, обсуждает возможность слияния МСК и кардиомиоцитов (Hatzistergos, Однако доля встроившихся в et al. 2010) .

–  –  –

1. Антиапоптотический и протективный эффекты При введении МСК для лечения острых повреждений тканей в первую очередь исследователи ожидают снижение уровня гибели клеток реципиента, и этот эффект наблюдается как во многих моделях in vivo, так и в экспериментах по сокультивированию клеток. Так, в модели острого повреждения почек введенные МСК прикреплялись к сосудам микроциркуляторного русла почек и снижали уровень апоптоза среди близлежащих клеток. С целью выявить протективные факторы, авторы проанализировали среду, кондиционированную МСК, и обнаружили в ней факторы VEGF (фактор роста эндотелия сосудов), HGF (фактор роста гепатоцитов) и IGF-1 (инсулиноподобный фактор роста-1), которые стимулируют рост и выживаемость эндотелиальных клеток (Tgel, et al. 2007). МСК снижают уровень апоптоза фибробластов, облученных ультрафиолетом, и опухолевых клеток эпителия легких, культивируемых в условиях низкого pH и гипоксии Авторы считают, что за этот эффект может отвечать станниокальцин-1, секретируемый МСК .

МСК, выделенные из жировой ткани, экспрессируют такие молекулы, как HGF, VEGF, TGF (трансформирующий фактор роста ), bFGF (основный фактор роста фибробластов), макрофагальный GM-CSF (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор), причем их концентрация растет в условиях гипоксии. Гипоксия в ткани наблюдается в первое время после повреждения, и секреция МСК анти-апоптотических факторов на этой стадии снижает уровень клеточной гибели в окружающих тканях. На модели ишемии нижней конечности мышей было показано, что введение культивируемых МСК, выделенных из жировой ткани, приводит к снижению размера зоны некроза и улучшению перфузии (Shevchenko, et al. 2013) .

2. Антифибротическое действие Антифибротический эффект МСК был показан на нескольких животных моделях. Основываясь на имеющихся данных, можно сказать, что введение МСК эффективно только на ранних стадиях до развития массивного фиброза (Meirelles Lda, et al. 2009). Недавно была показана роль bFGF и HGF в предотвращении фиброза на мышиной модели ишемии-реперфузии жировой ткани. Блокирующие антитела к bFGF снижали уровень пролиферации CD34+CD31-стромальных/периваскулярных клеток (которые авторы рассматривают как МСК) в поврежденной ткани, что приводило к снижению уровня фиброза. Антитела к HGF не влияли на пролиферацию МСК, но при их инъекции в поврежденную ткань развивался выраженный фиброз (Suga, et al. 2009). Это исследование показывает, что при повреждении ткани стромальные клетки, расположенные периваскулярно, начинают пролиферировать и синтезировать HGF, который обуславливает антифибротический эффект. В свете этих данных можно рассматривать внесение культивированных МСК в зону повреждения с целью локального производства HGF (и, возможно, других антифибротических факторов) для предотвращения развития фиброза. На модели инфаркта у крыс было показано, что трансплантация МСК снижает уровень фиброза в сердечной мышце, а одним из факторов, опосредующих этот эффект, оказался адреномедуллин (Li, et al .

2009) .

3. Стимуляция роста, пролиферации и дифференцировки локальных клетокпредшественников Культивируемые МСК имеют свойство поддерживать гемопоэз in vitro, что обусловлено секрецией ими факторов SCF (фактор стволовых клеток), LIF лейкемию фактор), и (подавляющий IL6 M-CSF (макрофагальный колониестимулирующий фактор). Кроме того этот эффект может быть усилен за счет секреции G-CSF (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор) и GM-CSF, индуцированной IL1 (Majumdar, et al. 2000). In vivo перициты (предполагаемые МСК in vivo) поддерживают пул гематопоэтических клеток через секрецию SDF-1 (стромальный фактор-1) (Sugiyama, et al. 2006). Таким образом, МСК костного мозга не только участвуют в создании ниши для ГСК, но и принимают участие в регуляции гемопоэза. В случае ишемического повреждения мозга у мышей были показаны клетки кровеносных сосудов, синтезирующие SDF-1 и ангиопоэтин-1, которые привлекали и поддерживали нейрональных предшественников (Ohab, et al. 2006) .

Экспрессия SDF-1 и ангиопоэтина-1 является прерогативой перицитов, что указывает на участие этих клеток в привлечении и поддержке нейрональных предшественников .

В отношении других тканей до сих пор остается невыясненным, могут ли МСК принимать учатие в создании ниши для тканеспецифичных предшественников. Так показано, что МСК, выделенные из миокарда, способны поддерживать рост стволовых клеток сердца in vitro, но взаимодействие этих двух типов клеток in vivo пока не удалось обнаружить (Lushaj, et al. 2011; Mazhari, et al. 2007) .

4. Ангиогенный эффект Восстановление кровотока в поврежденной ткани является основой ее регенерации. Участие МСК в процесса ангиогенеза таким образом рассматривается как наиболее значимый эффект этих клеток. Проангиогенный эффект МСК был продемонстрирован на многих животных моделях, в том числе мышиной модели ишемии нижней конечности (Kinnaird, et al. 2004; Shevchenko, et al. 2013). В этом исследовании авторы обнаружили в среде, кондиционированной МСК, такие факторы как фактор роста), MCP-1 bFGF, VEGF, PIGF (плацентарный (хемоаттрактивный белок моноцитов-1). Кроме того, они показали, что bFGF и VEGF секретируются МСК после введения в ткань и обнаруживаются in situ в месте введения. Другой группой исследователей было показано, что среда, кондиционированная МСК, содержит большое количество проангиогенных и антиапоптотических факторов IL6, VEGF, MCP-1. Эти факторы останавливают апоптоз эндотелиальных клеток, индуцируемый гипоксией, и стимулируют образование капилляроподобных структур из этих клеток в моделях in vitro (Hung, et al. 2007). Кроме того МСК создают субстрат для эндотелиальных клеток, синтезируя вдобавок к проангиогенным факторам компоненты внеклеточного матрикса (Sorrell, et al. 2009) И наконец, была показана способность МСК выполнять роль перицитов, стабилизируя вновь образованные сосуды in vitro и in vivo (Sanz, et al. 2008). Таким образом, МСК способны опосредовать регуляцию скоординированного роста кровеносных сосудов в процессах регенерации и ремоделирования тканей (Kalinina, et al. 2011)

5. Хемоаттрактивный эффект Было показано, что культивируемые МСК секретируют значительное количество хемокинов, таких как CCL2 (MCP-1), CCL3 (MIP-1, воспалительный белок макрофагов), CCL4 (MIP-1), CCL5 (RANTES, белок, регулирующий активацию T-клеток), CCL7 (MCP-3), CCL20 (MIP-3), CCL26 (eotaxin-3), CXC3CL1 (fractalkine), CXCL5 (ENA-78, пептид, активирующий нейтрофилы, выделенный из эпителия), CXCL11 (i-TAC, хемоаттрактант Т-клеток, индуцируемый интерфероном), CXCL1 (GRO, онкоген альфа, регулирующий рост), CXCL12 (SDF-1), CXCL8 (IL8), CXCL2 (GRO) и CXCL10 (IP-10, белок, индуцируемый интерфероном гамма) .

Клетками-мишенями для этих хемокинов являются моноциты, эозинофилы, нейтрофилы, базофилы, клетки памяти и наивные Т-лимфоциты, В-клетки, натуральные киллеры, дендритные клетки, гемопоэтические и эндотелиальные предшественники (Rollins 1997). Несмотря на то, что все эти молекулы синтезируются культивируемыми МСК, наблюдаемые расхождения между экспериментами возможно связаны с разными условиями культивирования. Похоже, что спектр экспрессии хемокинов МСК модифицируется взаимодействием с другими типами клеток, в частности, иммунными. (Meirelles, et al. 2009) Таким образом, есть данные, указывающие, что в ходе регенерации МСК способны мигрировать в зону повреждения и регулировать процесс регенерации за счет выделяемых ими факторов роста, цитокинов, хемокинов, интерлейкинов, а также компонентов внеклеточного матрикса (рисунок 5). Также сейчас активно развивается гипотеза о том, что часть активных веществ МСК выделяют в составе микровезикул (в том числе экзосом) (Lopatina, et al. 2014) Хотя их потенциал еще предстоит раскрыть, уже было показано, что экзосомы способны переносить между клетками белки и генетический материал (в том числе РНК) (Wang, et al. 2015) .

Рисунок 5. Схема участия МСК в регенеративных процессах .

Ададптировано из обзора Carrion and Figueroa (Carrion, et al. 2011)

–  –  –

1.5.1. Регуляция МСК с участием факторов, секретируемых клетками иммунной системы Процесс репаративной регенерации большинства типов ткани включает в себя три последовательные стадии: стадию воспаления, фазу пролиферации и миграции клеток и ремоделирование ткани. Ишемическое, травматическое или инфекционное поражение ткани чаще всего сопровождается развитием некроза – массовой гибелью клеток, при которой наблюдается набухание клеток, денатруация и коагуляция внутриклеточных белков, разрушение клеточных органелл и всей клетки. Развитие некроза всегда вызывает развитие воспалительного процесса в зоне повреждения, в результате которого во-первых, устраняется клеточный детрит (остатки погибших клеток) фагоцитами, во-вторых, обезвреживаются возможные инфекционные агенты, попавшие в ткань, в-третьих, запускается процесс репарации (Monaco, et al. 2003) .

Высоко скоординированная работа клеток иммунного ряда, стромальных клеток, клеток-предшественниц функциональных элементов ткани приводят к формированию в очаге повреждения участка ткани, замещающей утраченную. В ходе репарации в данную зону прорастают сосуды и нервные волокна, заключительным этапом является ремоделирование ткани после чего происходит хотя бы частичное восстановление ее функции. (Werner, et al. 2003) В развитии воспаления основную роль играют иммунокомпетентные клетки врожденного и приобретенного иммунитета (нейтрофилы, макрофаги, Т- и Влимфоциты, а также натуральные киллеры и антиген-презентирующие клетки) .

Показано, что в отсутствие иммунных клеток нарушается как развитие воспаления, так и нарушение последующего хода процесса регенерации. В частности, у мышей в отсутствие макрофагов нарушаются процессы заживления кожных ран (увеличиваются сроки заживления, нарушаются процессы неоваскуляризации ткани) (Goren, et al. 2009), затрудняется процесс заживления тканей сердца в модели инфаркта миокарда (van Amerongen, et al. 2007). У иммунодефицитных животных, а также в случае подавления иммунологического ответа при заживлении ран наблюдаются нарушения образования шрамов и патологические фибротические изменения в ткани (Ashcroft, et al. 1999; Martin, et al. 2005) .

В процессе регенерации клетки (иммунные, стромальные, эндотелиалные и другие) взаимодействуют друг с другом как непосредственно за счет образования межклеточных контактов и контактов с внеклеточным матриксом, так и через растворимые секретируемые факторы. Причем характер микроокружения, создаваемый иммунными клетками, во многом определяет дальнейший ход репарации ткани. В частности, секретируемые нейтрофилами и макрофагами на первых этапах развития воспаления белки привлекают в зону повреждения клеткиучастницы следующих фаз заживления: мультипотентные клетки и региональные предшественники, мезенхимные стромальные клетки (МСК) и фибробласты, а также влияют на процесс эпителиально-мезенхимального перехода, за счет которого в процесс репарации вовлекается большее число клеток (Kalluri 2009) .

Основными провоспалительными цитокинами, секретируемыми в процессе воспаления, являются интерлейкины, а также фактор некроза опухолей (TNF) и интерферон гамма (INF). В настоящее время получены данные о том, что стимуляция МСК растворимыми провоспалительными факторами ведет к повышению уровня направленной миграции этих клеток в очаг повреждения. Так, известно, что TNF может являться хемоаттрактантом для МСК из костного мозга (Zhang, et al. 2010). Помимо прямого хемоаттрактивного действия, стимуляция МСК при помощи TNF (и в меньшей степени IL1) приводит к увеличению чувствительности этих клеток к хемокинам и факторам роста (Ponte, et al. 2007). По видимому, такой механизм обусловлен стимуляцией экспрессии генов рецепторов хемокинов (CCR2, CCR3, CCR4, CXCR4), опосредованной фактором транскрипции NFB (ядерный фактор «каппа-би»). В результате увеличения числа рецепторов на поверхности МСК возрастает уровень миграции этих клеток по направлению градиентов таких хемокинов как CCL5 (RANTES) и CXCL12 (SDF-1). Кроме того, миграция МСК после обработки TNF стимулируется за счет образования матриксной металлопротеиназы-9 (ММП9) и активации матриксной металлопротеиназы-2 (ММП2) с образованием низкомолекулярной активной формы фермента (Zubkova, et al. 2016) Другими возможными хемоаттрактантами МСК являются IL6 (Rattigan, et al. 2010), MCP-3 (Schenk, et al. 2007) и другие .

Показано, что под действием факторов TNF и INF в МСК возрастает продукция факторов роста и хемокинов (J., et al. 2007). Похожий эффект достигается при инкубации МСК со средой, полученной от дифференцированных макрофагов. В результате МСК приобретают провоспалительный фенотип, секретируют повышенный уровень IL6, CXCL10 и CCL5 (Anton, et al. 2012). В исследованиях, сравнивающих культивирование МСК в присутствие лимфоцитов и под действием определенных доз провоспалительных факторов (TNF, INF и IL6), отмечают, что и в тех и в других условиях меняется фенотип, пролиферация МСК и экспрессия генов хемокинов, воспалительных цитокинов, клетки приобретают выраженный иммуносупрессивный фенотип (Crop, et al. 2010) .

Известно, что в отсутствие воспаления МСК способны стимулировать выживание и пролиферацию лимфоцитов (Benvenuto, et al. 2007). При действии высоких концентрации факторов, таких как INF, TNF, IL6 МСК могут менять свое дейсвтие на лимфоциты, в частности, ингибировать их пролиферацию (Krampera, et al. 2006; Najar, et al. 2009). Под действием INF в МСК увеличивается экспрессия IDO (индоламин-2,3-оксигеназа), TGF и HGF (Krampera, et al. 2006), и было показано, что МСК, обработанные INF, более эффективны в терапии GVHD (Polchert, et al. 2008) .

1.5.2. Влияние МСК на развитие иммунного ответа: иммуносупрессивные свойства Известно, что МСК несут на своей поверхности Toll-подобные рецепторы 3 и 4 типа (TLR3 и TLR4). Эти рецепторы отвечают за узнавание молекул, образующихся в тканях при повреждении клеток (PAMP и DAMP). Активация этих рецепторов ведет к миграции МСК в очаг повреждения (Ren, et al. 2008; Singer, et al. 2011) и секреции ими провоспалительных цитокинов, таких как IL1, IL6, IL8, TNF и INF, и хемокинов, например, CCL2, CXCL9, CXCL10 и CXCL11 (Shin, et al. 2010; Tomchuck, et al. 2008). За счет этого МСК способны регулировать первые стадии воспалительной реакции: поддерживая необходимый уровень провоспалительных цитокинов, они создают провоспалительное микроокружение и привлекают в очаг воспаления как иммунные клетки, так и последующих участников процесса. Однако под действием высоких концентраций этих факторов МСК начинают вырабатывать противовоспалительные молекулы, подавляющие развитие воспалительной реакции .

В работе Waterman с соавторами была показана принципиальная возможность поляризации МСК в сторону провоспалительного фенотипа при стимуляции TLR4, при этом в МСК повышалась секреция провоспалительных факторов, а при сокультивировании с Т-лимфоцитами МСК вызывали их активацию (авторы назвали такой фенотип MSC1 по аналогии с классически активированными макрофагами М1) .

Однако стимуляция TLR3 у МСК приводила к развитию противоположного – противовоспалительного фенотипа (MSC2). Такие клетки секретировали противовоспалительные интерлейкины (IL-4) и подавляли активацию Т-лимфоцитов (Waterman, et al. 2010) .

Иммуносупрессивное действие МСК было показано на многих моделях как in vitro, так и in vivo. На животных моделях была обнаружена способность экзогенных МСК подавлять реакцию отторжения трансплантата (GVHD), в связи с чем уже проводятся клинические испытания (Fang, et al. 2007). На сегодняшний день уже закончен II этап клинических испытаний применения МСК для терапии болезни Крона (Zuk 2010) .

При этом молекулярные механизмы, ответственные за реакции иммуносупрессии МСК до сих пор остаются во многом неясными .

Способность МСК предотвращать или подавлять GVHD может быть обусловлена как действием растворимых факторов, так и прямым межклеточным контактом с аллореактивными Т-клетками, а также подавлением антигенпрезентирующих клеток. Так, показано, что МСК способны напрямую подавлять пролиферацию периферических Т-лимфоцитов, стимулированных аллоантигенами, митогенами или антителами к Т-клеточному рецептору (Rasmusson 2006). Причем этот эффект является дозозависимым, усиливается при увеличении доли МСК в системе сокультивирования с активированными лимфоцитами (Le Blanc, et al. 2003) Опосредовано на созревание Т-лифоцитов МСК могут действовать через подавление дифференцировки и созревания дендритных клеток и их способности к хемотаксису. Дело в том, что при созревании последних на их поверхности появляются костимуляторные молекулы CD80 и CD86, необходимые для активации Т-лимфоцитов. Незрелые же антигенпрезентирующие клетки имеют ингибиторный фенотип, кроме того, при сокультивировании с МСК продукция провоспалительных цитокинов снижается, а противовоспалительных – растет (Jiang, et al. 2005; Nauta, et al. 2006). МСК также способны подавлять превращение В-клеток в плазматические клетки in vitro, при этом снижается как пролиферация этих клеток, так и секреция ими иммуноглобулинов IgM и IgG1 (Asari, et al. 2009) .

Значительная роль в регуляции воспаления принадлежит регуляторным Тклетками и альтернативно активированным макрофагам, которые контролируют воспаление и предотвращают избыточное повреждение ткани цитотоксическими факторами. МСК способны активировать Т-регуляторные клетки, которые в свою очередь подавляют активированные Т- и В-клетки (English, et al. 2009; Maccario, et al .

2005) .

Супрессорный механизм МСК по-видимому основан на паракринных эффектах, однако усиливается при прямом клеточном контакте между МСК и иммунными клетками (Ren, et al .

2010) Основными факторами, обуславливающими иммуносупрессивный эффект МСК, считают индоламин-2,3-диоксигеназу (IDO), HLA-G (Selmani, et al. 2008), оксид азота, который образуется под действием индуцируемой NO синтазы (iNOS) (Ren, et al. 2008), IL10 (Gao, et al. 2008) и гемоксигеназу-1 (Chabannes, et al. 2007). Кроме того, есть данные о важности прямого межклеточного взаимодействия МСК с иммунными клетками через молекулы адгезии ICAM-1 (молекула межклеточной адгезии) и VCAM-1 (молекула адгезии клеток сосудов) (Quaedackers, et al. 2009; Ren, et al. 2010). Спектр секретируемых МСК факторов не постоянен и зависит от взаимной регуляции МСК, клеток иммунной системы, медиаторов иммунного ответа, т.е. от локального микроокружения, в том числе воспалительного .

Видимо, неоднозначные результаты, получаемые при исследовании супрессорных свойств МСК отчасти можно объяснить разным микроокружением в различных применяемых моделях. Иммуномодулирующий эффект МСК сильно зависит от концентрации и баланса про- и противовоспалительных факторов, а также пропорции самих иммунных клеток, поэтому можно предположить, что иммунносупрессорные свойства МСК изменяются в зависимости от доли этих клеток в очаге воспаления. Количество МСК в этой зоне может изменяться за счет миграции клеток из отдаленных тканей (таких, как костный мозг), а также за счет их пролиферации в очаге воспаления .

1.5.3. Взаимодействие МСК с макрофагами Макрофаги являются одним из основных производителей провоспалительных цитокинов в тканях (Werner, et al. 2003). Кроме того, макрофаги являются антигенпрезентирующими клетками, что обуславливает их роль в приобретенном иммунитете. Принимая во внимание широкую распространенность макрофагов во всех тканях организма, можно считать их неотъемлемыми участниками реакции на повреждение ткани и иммунного ответа в целом .

Многие из факторов, секретируемых макрофагами (TGF, IGF-1, PDGF, bFGF), являются хемотактическими молекулами для МСК (Monaco, et al. 2003) и способны непосредственно привлекать МСК-КМ в зону воспаления. Однако мобилизация МСК костного мозга происходит при обширных повреждениях, когда избыток хемотактических молекул выбрасывается в системный кровоток. При локальных повреждениях воспалительное окружение, которое включает в себя как непосредственных межклеточный контакт местных МСК с иммунокомпетентными клетками, так и паракринные факторы, вероятно в первую очередь активирует МСК прилежащей ткани. В жировой ткани до 10% клеток представляют резидентные макрофаги (Brown, et al. 2012). Поэтому важной задачей является проследить взаимодействие МСК жировой ткани с моноцитами и макрофагами при развитии воспаления .

В настоящее время известно, что вклад макрофагов в процесс воспаления и дальнейшей регенерации зависит от их фенотипической пластичности: выделяют классически активированные провоспалительные макрофаги (M1) и альтернативно активированные противовоспалительные (M2) (Gordon 2003). Что примечательно, МСК секретируют ряд факторов, влияющих на развитие M2 фенотипа макрофагов .

Такая секреция может быть как конститутивной, так и запускаться определенными сигналами. Kim с соавторами впервые показали, что макрофаги, культивируемые в присутствии МСК, после 48 часов сокультивирования формировали фенотип, характерный для М2-макрофагов (CD206high, IL10high, IL12low). Культивирование проводилось без непосредственного клеточного контакта, поэтому данный феномен обусловлен действием растворимых факторов (Kim, et al. 2009). В другой работе проводилось сокультивирование МСК с колит-ассоциированными макрофагами. В результате сокультивирования снижалась секреция макрофагами провоспалительных факторов TNF и IL12, при этом повышался уровень секретируемого противовоспалительного цитокина IL10. Однако после блокирования простагландина Е2 (PGE2) при помощи антител провоспалительный фенотип макрофагов частично восстанавливался (Gonzlez, et al. 2009). По данным Cutler и соавторов МСК способны модулировать функции моноцитов, что в итоге приводит к подавлению пролиферации Т-клеток. Они предположили, что такой эффект связан с секрецией МСК PGE2 (Cutler, et al. 2010). Zhang с соавторами показали, что в присутствии МСК макрофаги экспрессировали рецептор маннозы (CD206) и выделяли IL10, что является отличительной особенностью M2 фенотипа. Одновременно снижалась секреция TNF и способность стимулировать экспансию Th17. Вероятно, такое воздействие МСК на фенотип макрофагов было обусловлено синергическим взаимодействием между секретируемыми факторами GM-CSF и IL6, ингибирование которых снижало экспрессию CD206 в макрофагах (Zhang, et al. 2010). Исследования Barminko с соавт. подтвердили эту гипотезу. По их наблюдениям секреция клетками линии THP-1 (промоноциты человека) провоспалительных факторов IL1, TNF, IP10 и MIP-1 снижалась в присутствии МСК. Такие макрофаги в большом количестве экспрессировали CD206 и отличались высоким уровнем секреции IL10 (Barminko, et al. 2011). Все приведенные данные свидетельствуют в пользу того, что МСК способны регулировать пластичность макрофагов, направляя их дифференцировку в направлении М2 типа. Подобный феномен показан в условиях in vivo: на животной модели сепсиса МСК перепрограммировали макрофаги посредством секреции PGE2, при этом макрофаги начинали выделять IL10 (Nemeth, et al. 2009). По другим данным, при введении МСК снижалось число Т-хелперов 1 типа (Th1) в экспериментальной модели колита (Gonzlez, et al. 2009). В модели повреждения кожи после подкожного введения МСК происходило ускорение заживления раны за счет увеличения числа М2 макрофагов (Zhang, et al. 2010). Также на модели инсульта было показано, что после введения МСК в микроглии появлялись М2 макрофаги (Ohtaki, et al. 2008). Вышеприведенные исследования показали, что in vivo МСК могут быть использованы для направления дифференцировки эндогенных макрофагов по М2 типу и стать эффективным инструментом для лечения хронического воспаления .

При аспетическом воспалении в результате ишемии, физического или химического повреждения резидентные тканевые макрофаги становятся источником цитокинов, в частности, IL1 и TNF, которые активируют выброс гистамина и простагландинов тучными клетками. Под действием IL1, TNF, гистамина повышается проницаемость капилляров, а также происходит активация эндотелия; в результате этих процессов лейкоциты из кровяного русла прикрепляются к эндотелию и мигрируют по градиенту хемокинов в очаг воспаления. Источником хемокинов в первое время после повреждения также являются резидентные макрофаги: они вырабатывают значительные количества хемокинов семейства CXC, которые специфичным образом привлекают в зону повреждения нейтрофилы (Brancato, et al. 2011). При попадании в зону повреждения нейтрофилы секретируют хемоаттрактанты, привлекающие иммунные клетки, а также пероксид водорода, который стимулирует дифференцировку рекрутированных моноцитов в макрофаги (Baggiolini, et al. 1989). В процессе развития воспалительной реакции макрофаги также являются одним из основных источников цитокинов и хемокинов. Помимо провоспалительных цитокинов они секретируют ряд факторов роста (PDGF-BB (тромбоцитарный фактор роста), TGF, EGF (епителиальный фактор роста), SDF-1, VEGF) (Monaco, et al. 2003). Вместе с факторами, ранее образованными тромбоцитами, они образуют крутой градиент, по которому в зону повреждения мигрируют фибробласты, МСК, кератиноциты, эндотелиоциты. Вместе с макрофагами они формируют грануляционную ткань. Фибробласты под влиянием факторов, вырабатываемых макрофагами, превращаются в миофибробласты, которые принимают участие в контракции раны и вместе с МСК синтезируют большие количества коллагена, создающего механическую основу ткани. Показано, что отсутствие макрофагов у животных не приводит к полному подавлению репарации, однако результат такой репарации, конечно, отличается от репарации в нормальных условиях (Andres, et al. 2000) Моделирование воспалительного окружения с помощью THP-1 1.6 .

Линия THP-1 была выделена Tsuchiya и соавторами в 1980 году (Tsuchiya, et al .

1980). Ранние исследования показали, что THP-1 морфологически похожи на первичные моноциты и макрофаги и обладают схожим дифференцировочным потенциалом. Это одиночные округлые клетки суспензионной культуры с моноцитарными маркерами. После контакта с форболовым эфиром (ФМА/PMA, практически все THP-1 адгезируют ко дну phorbol-12-myristate-13-acetate) культуральной чашки и начинают дифференцироваться в макрофаги, что сопровождается выраженными морфологическими изменениями: они превращаются в клетки плоской амебоидной формы с ярко выраженным аппаратом Гольджи, гранулярной ЭПС и большим числом свободных рибосом в цитоплазме (Tsuchiya, et Обработка ФМА ведет к приобретению макрофагами зрелого al. 1982) .

высокоадгезивного фенотипа, для которого характерны низкая пролиферативная и высокая фагоцитарная активность, высокий уровень мембранных маркеров CD11b и CD14 (Schwende, et al. 1996). Таким образом, THP-1, обработанные ФМА, обычно используются для изучения функций макрофагов. У данной модели есть ряд преимуществ над первичными моноцитами и макрофагами: линейные клетки представляют собой более гомогенную популяцию, при работе с которой нет риска контаминации (в том числе другими форменными элементами крови), отсутствует вариабельность между донорами и не ограничен период выживания в культуре (Auwerx 1991). THP-1 можно легко хранить в жидком азоте, при выведении из заморозки они не теряют черты моноцитов и остаются жизнеспособны. Данную клеточную линию широко используют исследователи по всему миру для моделирования процессов in vitro при изучении развития воспалительных процессов, атеросклероза (Cai, et al. 2004) и диабета (Qin 2012), (Zeyda, et al. 2007). Для этого используют модели как контактного, так и бесконтактного сокультивирования с эндотелиальными клетками HUVEC (Kaplanski, et al. 1998; Zhang, et al. 2008), гладкомышечными клетками (Shioi, et al. 2002). Сокультивирование с макрофагами, полученными из линии THP-1, используют для выяснения роли МСК в развитии онкологичнских заболеваний (Yang, et al. 2014), регуляции макрофагами остеогенной дифференцировки (Tu, et al. 2015) и других процессах .

–  –  –

Одним из важных этапов регенерации является миграция клеток в зону повреждения. В нее последовательно приходят клетки иммунной системы (в первую очередь нейтрофилы и моноциты), стромальные клетки и фибробласты, эндотелиальные клетки, региональные тканевые предшественники. Различные типы клеток существенно отличаются по способности мигрировать и механизмам клеточной подвижности. Так, нейтрофилы отличаются высокой чувствительностью даже к небольшим градиентам хемоаттрактантов, которыми служат в первую очередь хемокины. Эти небольшие клетки перемещаются амебоидным способом с высокой скоростью, что приводит к тому, что в поврежденной ткани они оказываются через несколько минут после повреждения. В отличие от них, мезенхимные клетки достаточно крупные, перемещаются достаточно медленно, как и все фибробластоподобные клетки с образованием протрузий на лидирующем крае клетки, их адгезии, перемещением тела клетки, деадгезии и ретракции (Mitchison, et al. 1996). МСК, в отличие от нейтрофилов, не столь чувствительны к хемокинам, для запуска их миграции требуется больший градиент хемоаттрактанта (Vorotnikov 2011) .

Однако миграция МСК при регенерации оказывается одним из ключевых событий в процессе репарации. В настоящее время активно обсуждаются механизмы стимуляции миграции МСК факторами, которые выбрасыаются в кровь при обширных повреждениях. В тестах in vitro было показано, что МСК мыши способны мигрировать по направлению к клеткам, выделенным из поврежденных блеомицином легких, но не клеток из здоровых легких (Lee, et al. 2011). Анализ хемотаксиса МСК выявил, что культивируемые МСК мигрируют в ответ на стимуляцию разными факторами роста и хемокинами. Также было показано, что предварительная стимуляция МСК с помощью TNF усиливает хемотактический эффект некоторых хемокинов на МСК. Таким образом, можно предположить, что миграция МСК может быть активирована воспалительными факторами .

На моделях in vivo введения МСК при различных повреждениях показана принципиальная способность этих клеток мигрировать в зону повреждения и встраиваться в поврежденную ткань (Jones, et al. 2011; Pittenger, et al. 2004). Это свойство МСК называют хоумингом. Его связывают с наличием на поверхности МСК многочисленных рецепторов к факторам роста, цитокинам и хемокинам, в избытке присутствующих в зоне повреждения ткани, а также рецепторов, связывающихся с белками внеклеточного матрикса .

1.7.2. Механизм хоуминга МСК Молекулярные механизмы хоуминга МСК в настоящее время все еще требуют изучения. Однако полученные данные указывают на то, что миграция МСК в некоторых аспектах подобна миграции лейкоцитов. Так, например МСК сходным с лейкоцитами образом осуществляют роллинг по внутренней поверхности сосудов (Rster, et al. 2006). Для миграции лейкоцитов важно присутствие молекул CD18 и CD49d, однако на МСК они либо не экспрессируются, либо присутствуют в незначительном количестве (Wu, et al. 2006). Было показано, что для роллинга и адгезии МСК важную роль играет Р-селектин (Rster, et al. 2006), однако спорным остается вопрос, присутствуют ли на поверхности МСК функционально активные лиганды селектинов (Brooke, et al. 2008) .

Другим механизмом, вовлеченным в хоуминг МСК, служит прикрепление этих клеток к эндотелию сосудов. Эндотелиальные клетки становятся активированными в результате повреждения сосудов, и это состояние характеризуется экспрессией поверхностных маркеров, которые позволяют захватывать из кровотока циркулирующие клетки. VCAM-1 (CD106) и Е-селектин (CD62E), являются лигандами для поверхностных рецепторов МСК, интегрина 41 (CD49d/CD29) и CD44, соответственно. Такие молекулы как остеопонтин, экспрессия которого повышена в остеоцитах при гипоксических условиях, и гиалуронан, экспрессия которого растет в почках в условиях экспериментальной острой почечной недостаточности, также могут привлекать циркулирующие МСК за счет связывания с CD44, что подчеркивает значение этой молекулы для хоуминга МСК (Garg, et al .

2014) .

Градиент для направленной миграции МСК в зону повреждения может быть создан с помощью хемокинов (хемотаксис), факторов роста и компонентов внеклеточного матркиса (гаптотаксис) .

1.7.3. Хемотаксис МСК: хемокины и факторы роста Хемотаксис – это направленное движение клеток в сторону увеличения градиента хемоаттрактанта. Хемотаксис хорошо изучен на примере миграции лейкоцитов в ткани при развитии воспаления. Главную роль в привлечении лейкоцитов играют хемокины – семейство небольших цитокинов, которые объединяет их небольшой размер (8-10 кДа) и наличие 4х консервативных цистеинов, которые образуют две характерные внутримолекулярные дисульфидные связи, определяющие третичную структуру белка. Выделяют четыре группы хемокинов в зависимости от взаимного расположения двух цистеинов на N-конце пептида (рисунок 6) .

Дисульфидные связи внутри молекулы обеспечивают ее характерное сворачивание в так называемый «греческий ключ». Рецепторами хемокинов являются сопряженные с семидоменные трансмембранные рецепторы, g-белками представленные на рис 2. Благодаря сигналингу от хемокиновых рецепторов происходит регуляция таких процессов, как адгезия и миграция клеток, а также их пролиферация и дифференцировка .

Рисунок 6. Схема структуры групп (подсемейств) хемокинов .

Адаптировано из работы Kohidai (Kohidai, et al. 1998) .

СС хемокины являются наиболее многочисленной группой хемокинов, в которую включают 27 белков, которые связываются с 10 различными рецепторами .

Эти хемокины вызывают миграцию моноцитов, натуральных киллеров, дендритных клеток и других типов клеток .

является представителем группы макрофагальных CCL3 (MIP-1) воспалительных белков (macrophage inflammatory protein), в которую также входят MIP-1 (CCL4), MIP-1 (CCL9/10) и MIP-1 (CCL15) .

CCL3 синтезируется моноцитами/макрофагами, нейтрофилами, дендритными клетками и лимфоцитами в больших количествах (порядка нескольких нанограмм на 106 клеток), а также может в меньших количествах продуцироваться тромбоцитами, остеобластами, астроцитами и микроглией, эпителиальными клетками и фибробластами. Обычно синтез CCL3 начинается после стимуляции провоспалительными агентами, такими как LPS (липополисахарид), INF, TNF, IL1/, в то время как действие IL4, IL10 или дексаметазона приводит к снижению уровня секреции CCL3 (Menten, et al. 2002) .

При физиологической концентрации (100 нг/мл) весь CCL3 находится в мономерной форме, однако при повышении концентрации может происходить агрегация белка .

CCL3 является хемоаттрактантом для лимфоцитов и моноцитов/макрофагов, и в меньшей степени для нейтрофилов (только INF-индуцированных клеток) и эозинофилов (небольшой популяции, несущей рецептор CCR1) (Maurer, et al. 2004) .

Известно, что нейтрофилы, привлеченные в зону воспаления TNF, вырабатывающимся тучными клетками, выделяют большое количество CCL3, чем вызывают хемотаксис моноцитов (von Stebut, et al. 2003). Показано, что привлечение моноцитов в области резаных ран способствует заживлению (DiPietro, et al. 1998) .

Взаимодействие CCL3 с его рецепторами (CCR1, CCR5) помимо хемотаксиса клеток ведет к стимуляции синтеза провоспалительных медиаторов, таких как лейкотриен С4 (LTC4), арахидоновая кислота и гистамин. Кроме того, взаимодействие CCL3 c CCR5, находящемся на лимфоцитах, стимулирует дифференцировку Th1 типа (Andres, et al. 2000), в то время как на Th2-лифоцитах преимущественно экспрессируются рецепторы CCR2 и CCR4 (Luther, et al. 2001). Рецепторы к CCL3 были найдены и на мезенхимных клетках, а также был выявлен хемотактический эффект CCL3 по отношению к МСК, выделенных из костного мозга (Boomsma, et al .

2012; Takano, et al. 2014) .

CCL2 (MCP-1, monocyte chemotactic protein-1) входит в одну группу с CCL8 (MCP-2), CCL7 (MCP-3) и CCL13 (MCP-4). CCL2 является одним из наиболее мощных хемоаттрактантов моноцитов в организме млекопитающих. Этот хемокин секретируется многими клетками, включая эндотелиальные клетки, фибробласты, эпителий, гладкомышечные клетки, микроглию, астроциты и другие (Barna, et al .

Основным источником являются 1994; Cushing, et al. 1990). CCL2 моноциты/макрофаги (Yoshimura, et al. 1989). CCL2 регулирует миграцию и инфильтрацию зоны воспаления моноцитами, Т-лимфоцитами и натуральными киллерами. Все функции CCL2 были изначально определены в работах с очищенным белком in vitro, которые потом были подтверждены в опытах in vivo (Fuentes, et al .

1995; Gunn, et al. 1997). Далее сигнальные пути CCL2 и его рецептора CCR2 были протестированы на животных моделях с использованием нокаутных мышей (Kurihara, et al. 1997). Стоит отметить, что нокаутные мыши по гену CCL2 и CCR2 оказались жизнеспособными, но у них наблюдались нарушения привлечения моноцитов в зону воспаления и экспрессии ряда цитокинов (Lu, et al. 1998) .

Мезенхимные клетки сами могут выделять значительные количества CCL2, особенно в результате стимуляции провоспалительными факторами, такими как IL1, TNF, или взаимодействии с Т-лимфоцитами (Akiyama, et al. 2012) и таким образом опосредовать направленную миграцию моноцитов. Показано, что МСК имеют рецепторы CCR2 (Ringe, et al. 2007), однако исследователи расходятся во мнении, способен ли CCL2 стимулировать хемотаксис МСК. Некоторые группы авторов указывают на роль CCL2 в привлечении МСК в зону повреждения (Boomsma, et al .

2012; Dwyer, et al. 2007). В частности, установлено, что гладкомышечные клетки сосудов под действием TGF начинают секретировать CCL2, что приводит к привлечению МСК костного мозга в зону повреждения (Zhang, et al. 2009). Однако в других работах указывается отсутствие хемоаттрактивного эффекта CCL2 на МСК (Ponte, et al. 2007; Ringe, et al. 2007). В работе Anton с соавторами была показана принципиальная способность CCL2 индуцировать миграцию МСК in vitro, однако авторы пришли к заключению, что этот хемокин не играет значительной роли в привлечении МСК в зону воспаления (Anton, et al. 2012). С рецептором CCR2 может связываться также другой потенциальный хемоаттрактант МСК - CCL7 (MCP-3) (Combadiere, et al. 1995). Показано, что CCL7 является одним из факторов, привлекающих МСК в зону инфаркта миокарда (Schenk, et al. 2007; Wang, et al. 2002) .

Так в одной из работ в результате увеличения экспрессии CCR2 на МСК костного мозга мыши рос уровень миграции МСК на CCL7, а также снижался уровень апоптоза среди МСК после введения их в миокард мышей (Huang, et al. 2010) .

CCL21 (SLC, secondary lymphoid-tissue chemokine). Рецептором данного хемокина является CCR7, который по данным многих авторов экспрессируется на поверхности МСК (Ringe, et al. 2007; Sasaki, et al. 2008; Sordi, et al. 2005). При этом показано, что CCL21 способен активировать миграцию МСК как in vitro (Sordi, et al .

2005), так и in vivo (Sasaki, et al. 2008) .

CCL5 (RANTES, Regulated upon Activation, Normal T-cell Expressed, and Secreted) впервые был обнаружен при поисках гена, который бы экспрессировался в активированных Т-лимфоцитах, но не В-клетках (Schall, et al. 1988). В Т-лимфоцитах экспрессия гена CCL5 регулируется с помощью KLF (Kruppel-like factor) (Song, et al .

2000). CCL5 также секретируется макрофагами, тромбоцитами, синовиальными фибробластами, почечным эпителием и определенными типами опухолевых клеток .

CCL5 привлекает в зону воспаления различные виды лейкоцитов, в том числе Тклетки, макрофаги, эозинофилы и базофилы. Совместно с цитокинами, выделяемыми Т-клетками (IL2, INFc), CCL5 индуцирует активацию и пролиферацию натуральных киллеров (Maghazachi, et al. 1996). CCL5 действует через связывание со своими рецепторами CCR1, CCR3, CCR5 (Pakianathan, et al. 1997) .

Данные о наличии этих рецепторов на МСК противоречивы. В одних работах указывается, что весь спектр рецепторов к CCL5 в небольшом количестве представлен на поверхности МСК (Ringe, et al. 2007). Другие авторы показывают, что МСК несут рецептор CCR1, но не другие типы (Sordi, et al. 2005). По другим данным, экспрессия CCR1 на МСК не обнаруживается, однако присутствуют рецепторы CCR3 и CCR5 (Ponte, et al. 2007). При этом показано, что CCL5 является хемоаттрактантом МСК in vitro, а предварительная стимуляция МСК провоспалительным фактором TNF приводит к росту числа молекул CCR3 на мембране МСК и как следствие к увеличению уровня миграции клеток в ответ на действие CCL5 (Ponte, et al. 2007) .

Кроме того, сами МСК являются источником CCL5, за счет чего эффективно привлекают моноциты/макрофаги в зону ишемии (Kimura, et al. 2014) .

Мигрировавшие макрофаги секретируют в большом количестве проангиогенные факторы, таким образом стимулируя рост сосудов в ишемической области. Однако, посредством секреции CCL5 МСК могут привлекать макрофаги в опухоль, способствуя ее васкуляризации и росту (Makinoshima, et al. 2009) .

CXC хемокины представлены 16 различными белками, взаимодействующими с 7 типами рецепторов. Внутри группы представители этого подсемейства также разделяются на хемокины (имеют специфическую ELR-положительные последовательность глутаминовая кислота – лейцин – аргинин перед первым цистеином цепи) и ELR-отрицательные. ERL-положительные хемокины связываются с рецепторами CXCR1 и CXCR2 и вызывают миграцию нейтрофилов (к ним относится IL8, он же CXCL8), в то время как ERL-отрицательные хемокины индуцируют хемотаксис лимфоцитов и других клеток .

CXCL8 (IL8) первоначально был открыт как цитокин с молекулярной массой 8,8 кДа, селективно привлекающий и активирующий нейтрофилы. Многочисленные исследования в конце 80-х годов XX века показали, что что CXCL8 производится многими типами клеток после определенной стимуляции: моноцитами (Yoshimura, et al. 1987), эндотелиальными клетками (Strieter, et al. 1988), Т-лимфоцитами (Gregory, et al. 1988), фибробластами (Van Damme, et al. 1989), клетками опухоли (Proost, et al .

1993), эпителиальными клетками, гепатоцитами, макрофагами и синовиальными клетками (Baggiolini, et al. 1989). Важной особенностью экспрессии гена IL8 считается её быстрая активация, в результате которой под действием определенных стимулов уровень мРНК IL8 в клетке может вырасти за короткое время в сотни раз (Hoffmann, et al. 2002). CXCL8 синтезируется в виде 99-аминокислотного предшественника и секретируется после отщепления сигнальной последовательности из 20 или 22 аминокислот (Schmid, et al. 1987). CXCR8 реализует свое действие через связывание с рецепторами CXCR1 и CXCR2 (Baggiolini, et al. 1989). Действие CXCL8 на нейтрофилы in vitro включает в себя транзиентный рост уровня внутриклеточного Ca2+, высвобождение клетками как азурофильных, так и специфических ММП9 содержащих гранул, респираторный взрыв, изменение формы нейтрофилов и их миграцию (Baggiolini, et al. 1989). При этом выделяемая нейтрофилами MMP9 способна отщеплять N-концевой участок пептида CXCL8, образуя более короткие изоформы CXCL8 (Van den Steen 2000), обладающие повышенной биологической активностью в привлечении нейтрофилов и стимуляции их дегрануляции (Mortier, et al. 2008) .

МСК несут рецепторы CXCR2, действуя на которые CXCL8 активирует внутриклеточный сигнальный каскад, включающий фосфорилирование таких сигнальных молекул как Akt/PKB (протеинкиназа B) и ERK (киназы, регулируемые внеклеточными сигналами) (Liang-kuan, et al. 2014). В результате увеличивается уровень миграции МСК, и кроме того запускается синтез и секреция в МСК проангиогенных факторов, в частности VEGF. Предварительная стимуляция IL8 МСК приводит к тому, что последние стимулируют процессы ангиогенеза, что подтверждается в экспериментах in vitro и in vivo (Hou, et al. 2014) .

CXCL12 (SDF-1) является одним из наиболее изученных хемокинов. Впервые он был описан как белок, выделяемый линией клеток костного мозга (Tashiro, et al .

1993). Известны три изоформы этого хемокина, SDF-1, SDF-1 и SDF-1, которые образуются путем альтернативного сплайсинга (Gleichmann, et al. 2000; Pillarisetti, et al. 2001; Stumm, et al. 2002), однако большинство исследований посвящено SDF-1 .

Этот хемокин состоит из 67 аминокислот, и первоначально предполагалось, что он взаимодействует лишь с одним рецептором – CXCR4. Однако в последние годы был найден еще один рецептор, взаимодействующий с CXCL12 – CXCR7, действие которого осуществляется не через g-белки, а путем связывания с MAP-киназами (киназы, активируемые митогенами) через -аррестины (Rajagopal, et al. 2010; Zabel, et al. 2009). Однако, как оказалось, связывание CXCL12 c CXCR7 не приводит к миграции клеток (Zabel, et al. 2009). В иммунной системе связывание CXCL12 с CXCR4/CD184 приводит к активации внутриклеточных сигнальных каскадов, результатом чего становится хемотаксис, выживание и пролиферация клеток, увеличение уровня внутриклеточного кальция и транскрипция генов. CXCR4 обнаруживают на мембране лимфоцитов, гематопоэтических стволовых клеток, эндотелиальных и эпителиальных клеток, а также раковых клеток .

Известно, что взаимодействие CXCL12 со своим рецептором CXCR4 играет важную роль в формировании и поддержании ниши ГСК в красном костном мозге .

Строма костного мозга секретирует хемокин, что удерживает ГСК, несущие CXCR4, в нише. Показано, что CXCL12 способствует росту уровня миграции ГСК в зону ишемического повреждения миокарда (Abbott, et al. 2004; Askari, et al. 2003) .

В животных моделях экспериментального повреждения тканей, таких как инфаркт миокарда, ишемическое повреждение мозга, острое повреждение почек и ожоги кожи, было показано, что взаимодействие CXCL12 и CXCR4 играет важную роль в привлечении МСК в зону повреждения (Ghadge, et al. 2011; Hu, et al. 2013; Liu, et al. 2013; Wang, et al. 2002). При этом при подавлении такого воздействия с помощью антагониста CXCR4 AMD3100 или с помощью антител, блокирующих CXCR4, миграция МСК в зону повреждения значительно снижается (Cao, et al. 2013) .

Введение МСК, трансфецированных геном CXCR4 приводит к повышению плотности васкуляризации в зоне ишемии в случае инфаркта и инсульта, снижению размера зоны некроза и улучшению неврологических функций у животных (Wang, et al. 2008; Yu, et al. 2012) Под воздействием CXCL12 в МСК возрастает экспрессия порядка 30 генов, 11 из которых вовлечены в процесс миграции (Stich, et al. 2009) .

INF-индуцируемые хемокины (CXCL9 (MIG), CXCL10 (IP-10), CXCL11(ITAC)) Хемокины CXCL9, CXCL10 и CXCL11 выделяют в отдельную группу по нескольким причинам. Во-первых, молекулы этих хемокинов высоко гомологичны и значительно отличаются от других хемокинов не ERL семейства (Clark-Lewis, et al .

2003). Во-вторых, хотя эти хемокины практически отсутствуют в неповрежденных тканях, за исключением лимфоидной, однако экспрессия генов, кодирующих данные хемокины, значительно возрастает при стимуляции INF при инфекции, повреждении или развитии иммунного ответа (Cole, et al. 1998). В-третьих, хемокины этой группы способны индуцировать хемотаксис активированных CD4+Th1, CD8+ лимфоцитов и натуральных киллеров, но не наивных Т-клеток. И наконец, CXCL9, CXCL10 и CXCL11 связываются с одним рецептором – CXCR3, активируя его. При этом требуются разные внутриклеточные домены рецептора: карбоксильный конец задействуется при активации с помощью CXCL9 или CXCL10, в то время как CXCL11 требует для активации третью внутриклеточную петлю молекулы рецептора (Colvin, et al. 2004) .

Помимо активации хемотаксиса Т-лимфоцитов и НК-клеток хемокины этой группы выполняют в организме ряд функций. Они стимулируют продукцию INF лейкоцитами, способствуют подавлению ангиогенеза, а также обладают антибактериальной активностью, сходно с дефензинами .

МСК способны секретировать CXCL9, CXCL10 и CXCL11 после стимуляции провоспалительными факторами. В частности, при действии TNF в МСК активируется NF-B путь, что активирует транскрицию генов указанных хемокинов (Shin, et al. 2010). Кроме того, факторы, секретируемые макрофагами, способны увеличивать уровень секреции CXCL10 МСК (Anton, et al. 2012). При этом хемокины, которые начинают секретировать МСК в провоспалительных условиях, способны привлекать в зону повреждения как провоспалительные лейкоциты и НК-клетки, так и способствовать миграции опухолевых клеток (Shin, et al. 2010; Spaeth, et al. 2008) .

Таким образом, хемокины могут являться хемоаттрактантами, стимулирующими хоуминг МСК и привлекающими их в зону повреждения, причем существуют данные, указывающие на то, что чувствительность МСК к хемокинам можно повысить с помощью провоспалительных цитокинов. В то же время МСК сами могут являться источником хемокинов, стимулируя миграцию иммунных и других типов клеток и таким образом регулируя процесс репарации ткани. Однако данные по хемоаттрактивной активности многих хемокинов относительно МСК зачастую противоречивы. Воспаление и сопутствующие ему факторы играют главную роль в привлечении в регенерирующую ткань клеток, в том числе иммунокомпетентных клеток и МСК (Spaeth, et al. 2008). Для миграции МСК помимо хемокинов важное значение имеют факторы роста (PDGF-BB, IGF-1, EGF, HGF) (Ponte, et al. 2007) .

Одним из наиболее изученных факторов, стимулирующих миграцию МСК как из костного мозга, так и жировой ткани является PDGF-BB .

PDGF-BB в большом количестве высвобождается из тромбоцитов при повреждении сосудов и в избытке диффундирует в рану и прилежащие ткани .

Показано, что PDGF-BB стимулирует миграцию и пролиферацию мезенхимных клеток in vitro (De Donatis, et al. 2008), кроме того, большую роль этот фактор играет при заживлении ран in vivo (Hao, et al. 2009). В больших количествах его содержат тромбоциты, кроме того, он секретируется нейтрофилами и макрофагами. При повреждении кровеносного сосуда происходит адгезия и дегрануляция тромбоцитов, в результате чего происходит выброс PDGF. Он стимулирует пролиферацию и миграцию ряда клеточных типов (фибробластов, гладкомышечных клеток), в том числе он оказывается мощным хемоаттрактантом МСК. In vitro хорошо изучена способность PDGF-BB в низких концентрациях активировать миграцию МСК, а в высоких - стимулировать их пролиферацию .

Сигнализация через тирозикиназный рецептор PDGFR необходима для миграции и дифференцировки клеток в процессе развития кровеносных сосудов .

Нокаут генов, кодирующих белки PDGFR И PDGF-BB у мышей, ведет к недостаточному привлечению клеток формирующимися сосудами. В результате обширных микрососудистых кровотечений, эмбрионы таких мышей погибают на ранних стадиях развития. Основной лиганд рецептора – PDGF-BB, который играет важную роль как в привлечении гладкомышечных клеток в период гиперплазии неоинтимы после повреждения сосудов, так и периваскулярных МСК, которые принимают участие в ангиогенезе, заживлении ран и регенерации ткани .

Димеры лиганда связываются с рецептором PDGFR, что приводит к его димеризации и стимулирует аутофосфорилирование специфических тирозиновых остатков во внутриклеточном домене рецептора. PDGFR в основном активируется при связывании с PDGF-BB и в меньшей степени с PDGFDD и VEGFA .

Аутофосфорилирование рецептора запускает создает сайт для фосфорилирования сигнальных молекул, в частности фосфоинозитид-3-киназы (PI3K), которая состоит из двух субъединиц – каталитической (p110, p110, p110 или p110) и регуляторной (p84, p50-55/p85 или p101). Основная регуляторная субъединица фермента – p85, содержит SH-2 домен (домен, гомологичный Src), что позволяет ей связываться с фосфорилированными тирозинами активированного рецептора. Из четырех форм каталитической субъединицы три (p110, p110 и p110) активируются рецепторами факторов роста, а p110 – рецепторами, связанными с g-белками (GPCR). Для активации PI3-киназы необходимо связывание каталитической субъединицы с регуляторной p85, расположенной на активированном рецепторе или на адапторных белках, а также малого G-белка Ras, находящегося в активной, ГТФ-связанной форме .

Собранная PI3-киназа остается прикрепленной к рецептору и фосфорилирует гидроксильную группу в третьем положении фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфата (PIP2), превращая его в PIP 3. PIP3 привлекает на мембрану и активирует белки, содержащие PH-домен, в том числе протеинкиназу B (AktB/PKB), которая является серин-треониновой киназой. Киназы PDK1 и PDK2 (киназа пируватдегидрогеназы), которые также имеют PH-домены (домен, гомологичный плекстрину) и привлекаются на внутреннюю сторону цитоплазматической мембраны, последовательно фосфорилируют, соответственно, Thr-308 и Ser-473, в Akt/PKB, что ведет к ее активации. Фосфорилирование Akt/PKB по этим остаткам отражает активность PI3-киназы, что используется при создании антител для регистрации функционирования PI3-киназного сигнального каскада. Мишени Akt/PKB пока слабо изучены, особенно в отношении миграции клеток, но известно, что фосфорилирование этой протеинкиназой ведёт к ингибированию некоторых белковмишеней (Cantley 2002). Как и весь PI3-киназный каскад, активность Akt/PKB необходима для поддержания жизнеспособности клеток в дополнение к активации их миграции .

Активация Akt/PKB приводит к реорганизации актинового цитоскелета в клетке и как следствие формированию промиграционного фенотипа (Veevers-Lowe, et al. 2011) .

Актиновые филаменты (микрофиламенты) принимают непосредственное участие в формировании протрузий мигрирующей клетки, которое происходит за счет АТФ-зависимой полимеризации/деполимеризации активновых филаментов .

Процесс нуклеации активновых филаментов требует участия нуклеирующих факторов, таких как Arp2/3 (родственные актину белки) комплекс, который регулирует ответвления от актиновой нити под углом 70°, и формины mDia1 и mDia2, которые связывают концы актиновых филаментов и способствуют линейному росту .

Формины регулируются малыми ГТФазами (Jaganathan, et al. 2007) .

Кроме формирования протрузий актиновые филаменты играют важную роль в перемещении тела клетки вперед, что является следующим этапом миграции (Lauffenburger, et al. 1996). Также актиновые филаменты могут формировать стрессфибриллы – контрактильные актин-миозиновые структуры, которые участвуют в процессах адгезии и миграции клеток. Стресс-фибриллы имеют в составе актин и миозин II и аналогично мышечным фибриллам обеспечивают сокращение. По некоторым данным, стресс-фибриллы могут принимать участие в процессах миграции клеток (Bershadsky, et al. 2006) .

Помимо актинового скелета многие сигнальные пути, контролирующие миграцию клетки, непосредственно зависят от динамики микротрубочек .

Значимость микротрубочек в процессе миграции была показана ещё в работах Васильева и Gelfand, где наблюдалось исчезновение клеточной подвижности в культуре фибробластов под влиянием колцемида, деполимеризующего микротрубочки (Vasiliev, et al. 1970) .

Крайне важным процессом в миграции клетки является создание полярности клетки, для чего требуется полимеризация-деполимеризация микротрубочек. Кроме того, микротрубочки способны влиять на сигнальные пути, контролирующие сборку актина. Например, белок GEF (guanidine exchange factor) регулирует активность нуклеатора актиновых филаментов Arp2/3 и сборки актин-миозиновых комплексов (Vorotnikov 2011) .

На состояние микротрубочек важное влияние оказывает ЦОМТ – центр организации микротрубочек (Vorobjev, et al. 1987). У животных ЦОМТ в основном представлен клеточным центром, сожержащим центросомы, в составе которых имеются две центриоли. Одним из компонентов центросомы, участвующим в формировании микротрубочек является -тубулин (Онищенко, 1993). Помимо этого есть данные, что -тубулин принимает непосредственное участие в регуляции процесса миграции клетки. Hubert с соавторами обнаружили -тубулин (компонент центросомы) в области протрузий, независимо от типа фиксации и линии клеток .

Кроме того, способность -тубулина через Arp2/3 регулировать состояние актинового цитоскелета, говорит о возможном участии этого белка в контроле динамики ламеллоподий в процессе миграции (Hubert, et al. 2011) .

Таким образом, хемокины и факторы роста стимулируют миграцию МСК как in vitro, так и in vivo, регулируя способность этих клеток к хоумингу в поврежденную область и направляя процесс заживления. Для движения клеток в ткани требуется разрушение (протеолиз) внеклеточного матрикса, в котором принимают участие матриксные металлопротеиназы (ММП) и система урокиназы. Мезенхимные клетки способны секретировать металлопротеиназы различных типов для деградации внеклеточного матрикса (ВКМ), реструктурируя его в ходе миграции. Для их активности необходимы связанные ионы цинка или кальция. Кроме того, МСК секретируют сериновые протеазы, к которым относится активатор плазминогена урокиназного типа (урокиназа, uPA). Рецептор урокиназы (uPAR) в ходе миграции клетки локализуется на ее лидирующем крае и, связываясь с урокиназой, активирует ее, что приводит к таргетной локальной деградации ВКМ (Heissig, et al. 2015) Однако в то время как растворимые молекулы способны инициировать хемотаксис клеток, внешними сигналами также могут служить субстрат-связанные компоненты внеклеточного матрикса (ВКМ) .

1.7.4. Гаптотаксис: роль внеклеточного матрикса ВКМ является как барьером для мигарции клеток, так и необходимым компонентом для ее осуществления, поэтому процесс миграции всегда требует скоординированности процессов протеолиза ВКМ, адгезии и сигналинга. Миграция клеток по градиенту компонентов ВКМ называется гаптотаксисом. Он играет огромную роль как в процессах эмбриогенеза и физиологической регенерации, так и в репарации тканей после повреждения и является одним из возможных механизмов опухолевой миграции. По градиенту фибронектина клетки движутся в эмбриональном развитии сердца, мигрируя из областей его низкой концентрации в области высокой. Также известно свойство опухолевых клеток вырабатывать значительно меньшее количество внеклеточного матрикса, чем здоровые клетки, что также создает градиент ВКМ и может вносить вклад в миграцию (Ruoslahti 1984) .

Помимо фибриллярных компонентов ВКМ в изобилии содержит факторы роста (Friedl, et al. 2010; Hynes 2009; Oehrl, et al. 2008). Факторы роста, связанные с ВКМ при высвобождении за счет разрушения ВКМ матриксными металлопротеиназами модулируют рост и миграцию клеток и таким образом вносят вклад в тщательно регулируемый гомеостаз в ткани (Hynes 2009) .

Внеклеточный матрикс – это комплекс фибриллярных белков и протеогликанов, которые синтезируются, собираются и моделируются клетками .

ВКМ обеспечивает физическую основу организации ткани. Основными фибриллярными белками ВКМ являются коллагены, эластины, фибронектины и ламинины. Протеогликаны занимают основной объем межклеточного интерстициального пространства в тканях и формируют гидратированный гель .

Наиболее распространенным белком ВКМ является коллаген. Он составляет до 30% массы всего белка многоклеточного организма. Коллаген обеспечивает прочность ткани при растяжении, регулирует адгезию клеток, поддерживает хемотаксис и миграцию клеток (Rozario, et al. 2010). Основная масса коллагена производится и секретируется фибробластами, которые уже находятся в ткани или привлекаются из прилежащих участков. Коллагеновые волокна обычно составлены из разных типов коллагеновых белков, однако обычно в каждой ткани преобладает конкретный тип. У позвоночных выявлено 28 различных типов коллагенов (Gordon, et al. 2010). Большинство коллагеновых молекул это трехцепочечные спирали, которые затем организуются в супрамолекулярные комплексы – фибриллы и сети, в зависимости от типа коллагена. Фибриллярные коллагены формируют основу из фибриллярных пучков в строме, в то время как сети коллагена участвуют в образовании базальной мембраны. Синтез коллагена I типа включает ряд посттрансляционных модификаций (Gordon, et al. 2010; Myllyharju, et al. 2004); в основном это гидроксилирование пролиновых и лизиновых остатков, гликолизирование лизина и отщепление N- и C-концевых пептидов. Вслед за этим образуются ковалентные кросс-сшивки между остатками лизина с другими молекулами коллагена с помощью лизилоксидазы (Myllyharju, et al. 2004). Коллаген связывается с другими фибриллярными белками ВКМ, в том числе с эластином, который возвращает ткань в прежнее состояние после растяжения. Необходимо заметить, что способность эластина к растяжению ограничена плотной связью эластина с коллагеновыми фибриллами. Синтезируется эластин в виде растворимого предшественника – проэластина, между нитями которого позже образуются кросссшивки между остатками лизина. Эластиновые фибриллы покрыты микрофибриллами гликопротеинов, основном фибриллинов, которые также играют важную роль в организации эластина (Wise, et al. 2009) .

Фибронектин принимает непосредственное участие в организации межклеточного матрикса и опосредует связь клеток с матриксом, регулируя их жизнедеятельность. Фибронектин секретируется в виде димера, связанного двумя дисульфидными связями между C-концевыми участками и имеет несколько сайтов связывания с другими димерами фибронектина, коллагеном, гепарином и интегриновыми рецепторами клеточной мембраны (Pankov, et al. 2002). Фибронектин может растягиваться в несколько раз под влиянием натяжения, создаваемого клетками. Такое растяжение в ответ на внешние силы демаскирует ранее скрытые сайты связывания с интегриновыми рецепторами внутри молекулы фибронектина .

Таким образом, можно сказать, что фибронектин функционирует как внеклеточный механорегулятор (Smith, et al. 2007). «Натянутый» фибронектин формирует новые связи с интегриновым рецептором 51 за счет экспозиции сайта связывания (Friedland, et al. 2009). Также фибронектин участвует в регуляции клеточной миграции в ходе развития организма и вовлечен в прогрессию опухолей (Rozario, et al. 2010) .

Давно была замечена способность белков внеклеточного матрикса стимулировать миграцию МСК. Так исследователями было обнаружно, что как растворимые, так и нерастворимые формы коллагена I типа, фибронектина и витронектина способны стимулировать направленную миграцию МСК in vitro (Thibault, et al. 2007). Многие авторы предполагают, что гаптотаксис служит одним из механизмов привлечения МСК в зону повреждения in vivo, на этой гипотезе основано применение биологических скэффолдов на основе компонентов ВКМ для стимуляции регенеративных процессов in vivo (Antebi, et al. 2015) Гаптотаксис контролируется особыми поверхностными рецепторами, которые участвуют в клеточных и межклеточных взаимодействиях и включают интегрины, кадгерины, селектины, эфриновые рецепторы и их лиганды (Воротников 2012) .

Интегрины - это трансмембранные рецепторы для белков ВКМ. У людей 18 и 8-субъединиц формируют 24 нековалентно связанные - гетеродимера. Каждая субъединица имеет большой внеклеточный домен, единственный трансмембранный участок и небольшой цитоплазматический домен. Афинность интегрина к лиганду контролируется связыванием определенного белка (например, талина) с цитоплазматическим -доменом, что приводит к сигналингу наружу и активации связывания внеклеточного домена с лигандом. Цитоплазматический домен не обладает ферментативной активностью и служит как скэффолд для сборки мультипротеиновых сигнальных комплексов. Такие белки как талин, винкулин и паксилин, играют роль адапторов, а также связывают интегрины с цитоскелетом за счет связывания фибриллярного F-актина. В интегрин-содержащие адгезивные комплексы привлекаются тирозиновые киназы, в частности FAK (focal adhesion kinase), также известная как PTK2 и Src. Адапторные белки (такие как p130Cas) взаимодействуют с этими комплексами и привлекают сигнальные молекулы SOS1, DOCK1 и другие. Эти скоординированные события запускают сигналинг через малые ГТФазы Ras и Rho, а также сигнальный путь PI3K-Akt (Smith, et al. 2010) .

Внутриклеточная сигнализация от интегриновых рецепторов является необходимой для выживания клеток, их пролиферации и миграции .

Крупные комплексы, сформированные с участием интегринов, называются адгезионными контактами. Адгезионные контакты можно разделить на несколько типов. Фокальные комплексы – высокодинамичные контакты на ведущем крае клетки, которые собираются и распадаются в процессе формирования протрузий. Они ассоциированы с сетью актиновых микрофиламентов, и в их образовании принимает участие 3-интегрин. Если клетка движется медленно, фокальные комплексы не разбираются, а созревают с образованием фокального контакта. Фокальные контакты (фокальные адгезии) являются более стабильными структурами. Это структуры, которые содержат много винкулина, альфа-актинина, 53-интегрина и других белков, кроме того, они ассоциированы с концами стресс-фибрилл. Фибриллярные контакты образуются из фокальных контактов, локализуются в центральной части клетки и представляют собой удлиненные структуры, ассоциированные с фибронектином. В отличие от фокальных контактов фибриллярные контакты не содержат винкулина и не связаны со стресс-фибриллами (Zaidel-Bar, et al. 2004) .

Адгезивные контакты участвуют в прикреплении тела клетки к субстрату и перемещении тела клетки в процессе миграции. Ранние адгезии (фокальные контакты) собираются в ламеллоподиях в виде микрокластеров и и разбираются в течение нескольких минут, если не превращаются в более стабильные фокальные комплексы, что обычно происходит на границе ламеллы и ламеллоподии. Активно мигрирующие клетки не имеют крупных адгезивынх контактов, в клетках, обладающих повышенной подвижностью, практически полностью отсутствуют стресс-фибриллы и зрелые фокальные контакты (Alexandrova, et al. 2008)

ЗАКЛЮЧЕНИЕ ОБЗОРА ЛИТЕРАТУРЫ

Спектр активностей, за счет которых МСК реализуют свой регенеративный потенциал, включает в себя хоуминг в поврежденную ткань и регуляцию процессов репарации (воспаления, синтеза ВКМ, привлечения тканеспецифичных предшественников, стимуляции ангио- и нейрогенеза) в частности путем паракринного воздействия на окружающие клетки. Существуют данные, свидетельствующие в пользу того, что такая активация МСК запускается провоспалительными факторами, секретируемыми иммунными клетками в зоне воспаления. В свете этих данных актуальным представляется исследование механизмов паракринного воздействия иммунных клеток на МСК. Как известно, моноциты – одни из первых клеток, которые оказываются в зоне развивающегося воспаления. Под влиянием факторов в поврежденной ткани они начинают дифференцироваться в макрофаги, при этом многие авторы сходятся во мнении, что макрофаги в процессе репарации являются одним из основных источников цитокинов и хемокинов. Однако большинство опубликованных работ рассматривают механизмы взаимодействия МСК и зрелых макрофагов, полученных в результате дифференцировки моноцитов в течение нескольких суток. При этом развитие воспаления начинается уже в первых минут повреждения ткани и моноциты оказываются одним из первых типов клеток, мигрирующих в зону повреждения. На основании этих данных актуальной представляется задача исследования взаимодействия МСК и моноцитов с первых часов активации макрофагальной дифференцировки. Известно, что МСК под действием провоспалительных факторов (таких как TNF, INF) способны менять профиль секреции регулируя таким образом привлечение в зону повреждения как иммуных клеток, так и клеток, участвующих в последующих этапах репарации. Поэтому актуален поиск механизмов, регулирующих функциональную активность МСК, в том числе изменения транскрипции и секреции, происходящие в МСК под воздействием макрофагов (рисунок 7). Кроме того, несмотря на уже имеющиеся данные, остается октрытым вопрос относительно механизмов, определяющих хоуминг МСК в поврежденную ткань и роль макрофагов в активации миграции МСК .

Рисунок 7. Гипотеза активации МСК под влиянием факторов, секретируемых макрофагами

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Культивируемые клетки 1.8 .

В работе использовали клеточную линию промоноцитов человека THP-1 (ATCC® TIB-202), первичную культуру мезенхимных стромальных клеток человека, выделенных из жировой ткани (МСК) и первичную культуру фибробластов дермы человека. Суспензионную линию THP-1 культивировали в среде роста RPMI 1640 (HyClone, США), содержащей 10% FBS (HyClone, США), 1М пирувата натрия (HyClone, США), 100 ед/мл пенициллина и 100 ед/мл стрептомицина. Первичную культуру МСК культивировали на пластиковых чашках Петри (Corning) в среде Advance Stem (HyClone, США), содержащей 10% Advance Stem Supplement (HyClone, США), 100 ед/мл пенициллина и 100 ед/мл стрептомицина, меняя среду в чашках каждые 3 дня на свежую. При достижении 80% субконфлюентного монослоя клетки пассировали. Для этого клетки обрабатывали раствором Версена (ПанЭко) и раствором HyQ Tase (HyClone, США) и рассаживали в соотношении 1:4. В экспериментах использовали МСК 2 пассажа. Фибробласты дермы культивировали в среде DMEM с низким содержанием глюкозы (HyClone, США) с добавлением 10% FBS (HyClone, США), 100 ед/мл пенициллина и 100 ед/мл стрептомицина. При достижении 80% субконфлюентного монослоя клетки пассировали. Для этого клетки обрабатывали раствором Версена (ПанЭко) и раствором 0,25% трипсина (HyClone, США), и затем рассаживали в соотношении 1:4. В экспериментах использовали фибробласты 4-8 пассажа. Все клеточные линии культивировали в CO2-инкубаторе при температуре +37С и содержании CO2 5% .

Выделение мезенхимных стромальных клеток из жировой ткани 1.9 .

МСК человека выделяли из подкожной жировой клетчатки здоровых пациентов (возраст от 31 до 45 лет), полученной в ходе плановых хирургических операций с добровольного согласия пациентов. Биопсию жировой ткани помешали в стерильный солевой раствор Хэнкса (HyClone, США), содержащий 5-ти кратную концентрацию антибиотиков (500 ед/мл пенициллина, 500 ед/мл стрептомицина) .

Извлекали биопсию из раствора в условиях стерильного бокса и механически измельчали жировую клетчатку ножницами, а затем смешивали с растворами ферментов коллагеназы I типа (200 ед/мл) (Wornington, США) и диспазы (40 ед/мл) (Sigma, США) при соотношении объема ткани к объему ферментативного раствора 1:2. Суспензию инкубировали при 37оС в течение 60 мин, периодически интенсивно встряхивали. Затем к полученной суспензии добавляли равный объем среды Advance Stem (HyClone, США) с 10% Advance Stem Supplement (HyClone, США) для инактивации ферментов и центрифугировали при 200g 10 мин. Супернатант и фракцию адипоцитов удаляли. К осадку добавляли стерильную дистиллированную воду для лизиса эритроцитов. Через 2 минуты к суспензии добавляли 1/10 объема 10ти кратного раствора фосфатно-солевого буфера. Полученную суспензию центрифугировали при 200g 5 минут, ресуспендировали клетки в среде роста и фильтровали через нейлоновые фильтры с размером пор 100 мкм (BD Falcon, США), клетки подсчитывали в камере Горяева и высаживали в чашки Петри в количестве 50 тыс. кл./мл. Инкубировали при 37°С, 5% СО 2. На следующий день в чашках меняли среду на свежую для удаления неприкрепленных клеток .

Иммунофенотипирование МСК 1.10 .

Для оценки содержания разных субпопуляций клеток в полученной вышеописанным спопобом гетерогенной популяции клеток, выделенных из жировой ткани, МСК открепляли от поверхности культурального пластика с помощью раствора Версена и метили антителами против CD14, CD19, CD34, CD73, CD79, CD90, NG2, PDGFR (все BD Pharmingen, США), CD45 (Dako, США), CD105 (Serotec, США), конъюгированными с флуоресцентной меткой. В качестве отрицательного контроля использовали соответствующие изотипические иммуноглобулины .

Окрашенные клетки анализировали с помощью проточного сортера клеток MoFlo (Dako Cytomation, США) Выделение фибробластов дермы человека 1.11 .

Фибробласты дермы выделяли из биопсий кожи, полученных в ходе хирургических операций от условно здоровых доноров с их добровольного согласия .

Полученные биопсии помещали в стерильный солевой раствор Хэнкса (HyClone, США), содержащий 5-ти кратную концентрацию антибиотиков (500 ед/мл пенициллина, 500 ед/мл стрептомицина). Извлекали биопсию из раствора в условиях стерильного бокса, измельчали ножницами и помещали кусочки дермы в стерильную чашку Петри. Сверху кусочки придавливали стерильным покровным стеклом и добавляли в чашку полную среду роста DMEM (HyClone, США), содержащую 10% FBS (HyClone, США). Через 5-7 суток визуально при помощи микроскопа детектировали фибробласты, выползшие на поверхность культуральной чашки из экспланта. Стекло с остатаками экспланта удаляли из чашки, прикрепившиеся клетки снимали раствором трипсина (HyClone, США) и рассаживали равномерно .

Запуск макрофагальной дифференцировки THP-1 и анализ профиля 1.12 .

экспрессии макрофагов Для дифференцировки линии THP-1 в макрофаги клетки отмывали средой без сыворотки и высаживали в чашки Петри в количестве 500 тыс.кл./мл. В среду добавляли форболовый эфир ФМА (PMA, phorbol 12-myristate-13-acetate, Sigma, США) в концентрации 50 нг/мл, через час визуально детектировали прикрепление клеток к дну чашки. После воздействия PMA прикрепившиеся моноциты тщательно отмывали средой RPMI 1640 три раза по 45 минут, затем к прикрепленным клеткам добавляли свежую порцию среды в отношении 1 мл среды на 500 тысяч клеток .

Для анализа профиля экспрессии через 2, 24 и 48 часов после активации выделяли из клеток РНК и проводили ПЦР в реальном времени (см. ниже) .

Культивирование МСК в среде, кондиционированной THP-1 1.13 .

МСК перед началом экспериментов депривировали в среде Advance Stem без добавления сыворотки в течение суток. THP-1, активированные, как описано выше, культивировали в среде без сыворотки в течение 48 часов. Кондиционированную среду от макрофагов собирали с чашек, фильтровали через фильтр с размером пор

0.22 мкм (Millipore, США) и добавляли к клеткам МСК в соотношении 1:1. МСК культивировали в среде, кондиционированной макрофагами, в течение 24, 48 часов или 7 суток. В качестве контроля к МСК после депривации добавляли 50% свежей среды культивирования моноцитов без сыворотки .

Бесконтактное сокультивирование МСК с макрофагами или 1.14 .

фибробластами Для сокультивирования использовали трансвеллы (Falcon, США) для 6луночных или 12-луночных планшетов с размером пор 0.4 мкм (Falcon, PET tracketched membrane). В нижнюю камеру сажали МСК в концентрации 30 тыс.кл./мл, перед экспериментом клетки депривировали в течение 24 часов. В верхнюю камеру сажали THP-1 в концентрации 500 тыс.кл./мл, которые предварительно активировали, как описано выше, либо фибробласты в концентрации 80 тыс.кл./мл в качестве контроля (Рисунок 8). После прикрепления клеток к мембране верхней камеры её помещали в нижнюю и сокультивировали клетки в течение 24 или 48 часов. В качестве контроля к МСК после депривации добавляли 50% среды культивирования моноцитов (RPMI 1640) без сыворотки и культивировали 24, 48 часов или 7 суток соответственно .

Рисунок 8. Схема бесконтактного сокультивирования макрофагов и МСК, разделенных проницаемой мембраной с диаметром пор 0,4 мкм .

Выделение РНК из клеток 1.15 .

Выделение РНК из культивированных клеток проводили на льду в ламинарном боксе с использованием RNeasy Mini Kit (Qiagen, Германия) согласно методике производителя. Для удаления геномной ДНК из образцов использовали RNase Free DNase (Qiagen, Германия), инкубировали лизаты в течение 30 минут при комнатной температуре. Концентрацию выделенной тотальной РНК определяли на спектрофотометре NanoDrop 1000 (Thermo Scientific, США) с использованием программного обеспечения ND-1000 V 3.7.1 (Thermo Scientific, США). Также с использованием спектрофотометра NanoDrop 1000 осуществляли контроль качества выделенной РНК. Для этого анализировали показатели отношений значений поглощения при длинах волн 260 нм и 280 нм, а также при длинах волн 260 нм и 230 нм. Для последующей процедуры обратной транскрипции отбирали образцы РНК со следующими показателями: 260нм/280нм = 2, 260нм/230нм = 1,8-2,2 .

Количественная ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени 1.16 .

Для реакции обратной транскрипции использовали 1 мкг выделенной тотальной РНК. Синтез кДНК проводили с использованием набора Reverse Transcription Reagents (Fermentas, США), согласно руководству пользователя .

Полученные образцы кДНК хранили при -20 .

Количественную ПЦР в реальном времени проводили на приборе iCycler 5 (Biorad, США). В одну ПЦР реакцию добавляли 5 мкл SYBR Green PCR 5х Master Mix (Евроген), 18 мкл ddH2O, 1 мкл смеси праймеров (концентрация прямого и обратного праймера в смеси по 5 мкМ) и 1 мкл кДНК. Для non template control вместо кДНК в реакцию добавляли 1 мкл ddH2O.

Условия для ПЦР выдерживали следующие:

95°С в течение 10 мин, затем 40 циклов 95°С – 15 сек, n°С – 20 сек (где n – температура, эмпирически подобранная для каждой пары праймеров), 72°С – 20 сек .

Праймеры подбирали с помощью базы олигонуклеотидных последовательностей PrimerBank (http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/) либо с помощью инструмента Использованные Primer-BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) .

олигонуклеотидные последовательности праймеров указаны в таблице 3. Содержание исследуемых мРНК нормировали по уровню сигнала, получаемого для кДНК AKTB и GAPDH (гены «домашнего хозяйства»). После проведения ПЦР с детекцией в режиме реального времени полученные данные по значениям порогового цикла для каждого гена обрабатывали согласно формуле:

N=2-C* 1000, С= С1-Сhk, где С1- значение порогового цикла для исследуемого гена, Сhk- среднее значение порогового цикла для двух генов «домашнего хозяйства»

(housekeeping genes, ACTIN и GAPDH), N- результат в относительных единицах .

–  –  –

Анализ профиля экспрессии генов с применением системы RT2 Profiler 1.17 .

PCR Array Синтез кДНК проводили на 1 мкг выделенной тотальной РНК с использованием набора RT2 First Strand Kit (SABiosciences™, США) согласно инструкции производителя. Полученную кДНК сразу использовали для анализа либо хранили ночь при -20. Для проведения реакции ПЦР использовали наборы реагентов RT 2 Real-Time™ SYBR Green/Fluorescein PCR master mix (SABiosciences™, США) .

Конечный объем реакционной смеси, согласно инструкции производителя, составлял 25 мкл. Для анализа профиля экспрессии генов хемокинов и их рецепторов был использован набор 022PAHS Human Chemokines&Receptors. ПЦР в реальном времени проводили на приборе iCycler 5 (Biorad, США). Для нормализации результатов исследования использовались 5 генов ''домашнего хозяйства'': B2M, HPRT1, RPL13A, GAPDH, ACTB, входящие в состав набора .

Обработка результатов количественного анализа уровня экспрессии 1.18 .

генов Поскольку работа проводилась на клетках первичной культуры, полученных от разных доноров, разница между уровнем экспрессии генов среди доноров оказывалась значительной. Для последующей статистической обработки результаты представлены в виде отношения уровня экспрессии гена в МСК в опыте к уровню экспрессии этого же гена в контрольных МСК .

Коллекционирование кондиционированной среды 1.19 .

Проводили сокультивирование МСК и макрофагов, как описано в п.2.7 .

Культивировали клетки совместно от 24 часов до 7 суток. Параллельно культивировали МСК того же пациента в среде без сыворотки, макрофаги и не активированные THP-1. Собирали кондиционированную среду через 24, 48 часов и 7 суток после начала эксперимента. Сразу после сбора добавляли в среду ингибитор протеаз (Fermentas, США) в соотношении 1:100, фильтровали среду через фильтр с диаметром пор 0,22 микрона (Millipore, США) и замораживали образцы в жидком азоте. Пробы хранили при -80С .

Анализ уровня белков в кондиционированной среде методом ИФА 1.20 .

Анализировали концентрацию белка в кондиционированной среде сокультивирования с помощью иммуноферментного анализа Согласно инструкции производителей. Для анализа уровня IL1, IL6 и CCL2 использовали наборы, производимые компанией BD Pharmingen, для анализа CCL1 и CCL3 наборы компании R&D, США. Образцы кондиционированной среды инкубировали с первыми антителами в течение ночи при +4С. Затем лунки промывали от несвязавшихся антител, инкубировали для блокирования неспецифического связывания в течение часа с 10% раствором эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, США) при комнатной температуре, снова промывали и добавляли по 100 мкл стандартных разведений контрольного белка, либо образцов кондиционированной среды. Разведение проб подбирали экспериментально (таблица 4), все образцы дублировали. Инкубировали планшет в течение часа при комнатной температуре, затем промывали лунки и добавляли вторые (детектирующие) антитела с пероксидазной меткой. После инкубации со вторыми антителами (1 час при комнатной температуре) лунки промывали и добавляли по 100 мкл детектирующего раствора, с которым планшет инкубировали 30 минут в темноте, после чего останавливали реакцию добавлением 50 мкл раствора stop solution и не позднее, чем через 30 минут измеряли оптическую плотность образцов в лунках на фотометре планшетов iMark S/N 12135 при 450 нм и 540 нм. По данным оптической плотности лунок со стандартными разведениями белка строили калибровочную кривую .

Рассчитывали концентрации белка в образцах по данным калибровочно й кривой, учитывая разведение .

Таблица 4. Разведение концентрированной кондиционированной среды (б/р – без разведения)

–  –  –

Scratch assay (модель раны монослоя) 1.21 .

Для оценки скорости миграции отдельных МСК использовали модель миграции клеток в рану монослоя. МСК второго пассажа высаживали в 12-ти луночный планшет и наращивали до монослоя. Перед экспериментом клетки депривировали в течение суток. Перед началом эксперимента клетками добавляли кондиционированную макрофагами среду в соотношении 1:1, или среду, используемую для культивирования моноцитов без сыворотки в качестве контроля .

В каждой лунке прочерчивали «царапину» стерильным синим наконечником .

Осуществляли цейтраферную съемку с использованием фазового контраста в течение 48 часов через каждые 30 минут с использованием 10х объектива (Leica HCX PL FLUOTAR 10x) с помощью микроскопа для прижизненных наблюдений Leica AF6000LX оснащенного СО2 камерой и нагревательным модулем с камерой Leica DFC 350FX. Использовали режим параллельной съёмки в нескольких полях зрения планшета (multiposition), в каждой лунке снимали по два поля зрения. Во время съемки клетки находились в камере с подачей СО 2 при температуре 37оС .

Скорость миграции одиночных клеток в просвет монослоя анализировали с помощью программы считая координатой клетки положение ImageJ, геометрического центра ядра (центроид). Для каждой отмеченной клетки определяли координаты на всех кадрах фильма и по ним рассчитывали расстояние, пройденное клеткой за время, прошедшее между кадрами. Оценивали 50 клеток в каждом фильме .

Скорость движения клеток рассчитывали как отношение длины отрезков, пройденных клетками между кадрами, на время (30 мин). Результаты усредняли и статистически обрабатывали с использованием программы Microsoft Office Excel 2007 (Microsoft Corporation, США). Полученные значения средних скоростей сравнивали с помощью параметрического t-критерия Стьюдента с оценкой нормальности распределения значений. Статистическая достоверность была установлена при p0.05. Результаты представлены как среднее значение скорости клеток в лунке (пикселей/час) +/- стандартная ошибка среднего .

Миграция в системе xCELLigence 1.22 .

Для оценки направленной миграции использовали 16-тилуночные планшеты CIM-plate для прибора xCELLigence (ACEA Biosciences, Inc., США), которые представляют собой 16луночные камеры Бойдена, позволяющие наблюдать клеточную миграцию в режиме реального времени. Камера содержит верхнюю и нижнюю часть, которые разделены мембраной с диаметром пор 8 мкм. В нижнюю камеру помещают раствор хемоаттрактанта. На нижней части мембраны располагается золотой электрод, показания сопротивления которого прибор фиксирует через заданные промежутки времени. В нулевой момент времени после заполнения камеры снимается базовое значение показания сопротивления электрода в лунке, которое изменяется по мере того, как мигрирующие клетки из верхней камеры перемещаются на нижнюю сторону мембраны и распластываются на ней (увеличивают площадь) (рисунок 9). На основании показаний сопротивления рассчитывается клеточный индекс (cell index, CI), который связан прямой зависимостью с числом мигрировавших через мембрану клеток. Скорость миграции клеток рассчитывается как отношение изменения CI за заданный промежуток времени к величине этого промежутка в единицах CI/час .

Исследовали, как изменяется скорость направленной миграции МСК в системе xCELLigence после бесконтактного сокультивирования с макрофагами в течение 24 часов. МСК 2 пассажа предварительно депривировали в течение 24 часов и инкубировали с макрофагами, как было описано выше. Контрольным клеткам после депривации добавляли 50% среды культивирования моноцитов без сыворотки и так же культивировали в течение 24 часов. Клетки снимали с чашек Петри путем обработки раствором HyQTase (HyClone, США), подсчитывали с помощью прибора CellCounter (Invitrogen, США) и разводили до конечной концентрации 400 тыс. кл./мл в среде Advance Stem без добавления сыворотки .

А Б Рисунок 9. Принцип работы системы xCELLigence на примере камер для оценки клеточной адгезии (E-Plate). Сопротивление электрода лунки увеличивается по мере того, как к нему прикрепляются и распластываются клетки .

Автоматизированная система считывает показания сопротивления электрода через заданные промежутки времени, что позволяет наблюдать изменение количества прикрепившихся клеток в режиме реального времени (А). Принцип работы планшетов для миграции CIM-Plate (Б) .

Для оценки влияния матрикса на скорость направленной миграции мембрану верхней камеры планшета для миграции с диаметром пор 8 мкм покрывали с двух сторон стерильным раствором внеклеточного матрикса: фибронектин человека (ИМТЕК, Россия) в концентрации 50 мкг/мл или коллаген человека I типа (ИМТЕК, Россия) в концентрации 10 мкг/мл и оставляли полимеризоваться в течение 30 минут при температуре 37С. В нижнюю камеру планшета помещали среду культивирования без сыворотки (отрицательный контроль). В качестве положительного контроля миграции в нижнюю камеру помещали среду культивирования Advance Stem с 10% Advance Supplement (положительный контроль). В качестве хемоаттрактантов в нижнюю камеру добавляли PDGF-BB (10 нг/мл), IGF-1 (50 нг/мл), uPA (100 nM), CCL3 (100 нг/мл), CCL4 (100 нг/мл), CCL5 (100 нг/мл) и CXCL16 (100 нг/мл, все Sigma, США). Для выявления сигнального каскада рецептора PDGFR в нижнюю камеру добавляли ингибитор аутофосфорилирования рецептора PDGFR (25мкМ), ингибитор AG1296 фосфоинозитол-3 киназы LY294002 (25мкМ) (Calbiochem, США). Для исследования вклада экзогенного PDGF-BB в нижнюю камеру добавляли блокирующие антитела к PDGF-BB (50 нг/мл); или комбинацию PDGF-BB (10 нг/мл) и блокирующих антител к нему (Millipore, США, 50 нг/мл) в качестве отрицательного контроля .

В верхнюю камеру добавляли 100 мкл среды без клеток, через 30 минут снимали фоновые значения клеточного индекса с лунок. Затем в верхнюю камеру добавляли 50 мкл суспензии МСК до конечной концентрации 20 тыс.кл. в лунке, инкубированных предварительно с макрофагами или контрольных. Значения клеточного индекса (cell index) снимали с помощью прибора в течение 48 часов с интервалом 15 минут. Полученные данные анализировали с помощью программного обеспечения RTCA Software (ACEA Biosciences, Inc., США) .

Иммуноцитохимия 1.23 .

МСК рассаживали в планшеты с покровными стеклами. Перед экспериментом клетки депривировали в течение суток и инкубировали 24 часа с макрофагами, как было описано выше. В качестве контроля к депривированным клеткам добавляли 50% среды культивирования моноцитов без сыворотки. Перед фиксацией клетки промывали теплым фосфатно-солевым буфером (PBS) и фиксировали 4% раствором формальдегида на PBS (pH=7,2-7,4). Для иммунофлуоресцентного окрашивания внутриклеточных белков (элементов цитоскелета) обрабатывали стекла с фиксированными клетками 0,2% раствором TritonX100 (Serva, Германия) на PBS, для мечения мембранных белков пермеабилизацию мембраны не проводили. Затем обрабатывали стекла 0,05 М раствором ацетата аммония (Helicon, Россия) на PBS в течение 5 минут для предотвращения неспецифического окрашивания. Для предотвращения неспецифического связывания белков вторых антител инкубировали стекла с клетками в PBS с добавлением 1% BSA и 10% сыворотки крови животного – донора вторых антител в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем инкубировали стекла в растворе первых антител при +4С в течение ночи, трижды промывали стекла раствором PBS и инкубировали в растворе вторых антител в течение часа при комнатной температуре в темноте. Список использованных антител представлен в таблице 5 .

Ядра клеток дополнительно метили флуоресцентным красителем DAPI (20 мг/мл, Sigma, США), разведение 1:1000 в течение 10 минут в темноте, отмывали и заключали в среду Aqua-PolyMount (Polysciences, Inc., США). Анализировали полученные препараты с помощью флуоресцентного микроскопа Leica DM6000B с камерой Leica DFC 360FX .

Таблица 5. Список и характеристика использованных антител .

Антитела Продуцент Рабочее Фирма антител разведение Первые антитела actin кролик Sigma, США 1:100

–  –  –

Электрофорез белков и иммуноблоттинг 1.24 .

МСК 2го пассажа депривировали в течение суток и инкубировали 24 часа с активированными макрофагами, как было описано выше. В качестве контроля к депривированным клеткам добавляли 50% среды культивирования моноцитов без сыворотки. В качестве положительного контроля активации сигнализации PDGFR после депривации клеткам добавляли 10 нг/мл PDGF-BB (Sigma, США). Клетки промывали фосфатно-солевым буфером, после чего клетки на льду лизировали в 50 мкл 2х буфера для образцов (20 мМ дитиотреитол, 6% SDS, 0,25 М Tris pH=6,8, 10% глицерина, 10 мМ и бромфеноловый синий). Белки клеточного лизата разделяли при помощи электрофореза в денатурирующих условиях в присутствии 20% SDS (Sigma, США) при постоянном напряжении 140 В. Анализируемые образцы смешивали с буфером для нанесения (Laemmli buffer), содержащим 4% -меркаптоэтанола (Helicon, Россия), и инкубировали в течение 5 минут при 99°С. После этого образцы наносили на SDS/полиакриламидный гель (7,5%) толщиной 1 мм из расчета 30 мкг белка на лунку. Для определения молекулярных масс белков использовали стандартную коммерческую смесь предокрашенных белков с известным молекулярными весом BenchMark™ (Invitrogen, США). После электрофореза перенос белков из геля на Amersham Hybond-P PVDF мембрану (GE Healthcare, Великобритания), предварительно смоченную буфером для электропереноса, осуществляли методом полусухого электроблоттинга. Перенос осуществляли в приборе Trans-Blot® SD Semi-Dry Transfer Cell (Bio Rad, США) при постоянном напряжении 25 В в течение 30 минут. После переноса мембрану промывали в TBS/Tween (150 мМ NaCl, 50 мМ Tris/HCl, pH 7,6, 0,05% Tween 20 (PRS Panreac, Испания)), а затем инкубировали в TBS/Tween, содержащем 5% обезжиренное молоко в течение 60 минут при комнатной температуре. Вестерн блоттинг проводили с использованием немеченых поликлональных кроличьих антител, специфически связывающихся с Akt (1:1500), phospho-Akt (1:1000) (Cell Signaling Technology, США) в течение ночи при +40С и последующей инкубацией со вторыми антителами 1:4000 (козлиные антитела к IgG кролика), конъюгированными с пероксидазой хрена (R&D, США) в течение 60 минут при комнатной температуре. Для контроля эквивалентности нанесения белка на гель проводили иммуноблоттинг с антителами к изоформам актина (Sigma, США). Визуализацию белков, связавшихся с антителами, осуществляли с помощью хемилюминесцентного субстрата ECL Advanced Western Blotting Kit (American Biosciences, США). Для экспонирования мембран использовали рентгеновскую пленку X-Ray Retina XBM (Fotochemische Werke, Германия) .

Проявленную пленку сканировали при помощи прибора GS-800 Calibrated Densitometer (BioRad, США), денситометрический анализ полученных изображений проводили в программе ImageJ .

Статистическая обработка 1.25 .

Статистическую обработку данных проводили с использованием программы STATISTICA 6.0. Для проверки достоверности отличий в численных данных между опытными и контрольными группами в связи с малым объемом выборок применяли односторонний непараметрический критерий Манна-Уитни. Различия считали статистически значимыми при уровне значимости p0,05. Данные в тексте и на графиках представлены в виде M±m, где М - среднее арифметическое, а m стандартная ошибка среднего .

2. РЕЗУЛЬТАТЫ Иммунофенотипирование МСК 2.1 .

Анализ иммунофенотипа МСК-ЖТ 2 пассажа с помощью проточной цитофлуориметрии показал, что эти клетки несут маркеры CD73 (83±8%), CD90 (95%) и CD105 (95%), но не экспрессируют или экспрессируют в малом количестве CD14 (10%), CD19 (10%), CD34(5%), CD45 (1%), CD79 (10%) (рисунок 10) .

А. Б .

–  –  –

Рисунок 10. МСК, выделенные из жировой ткани несут маркеры мезенхимных стромальных клеток CD73 и CD105 (А), но практически не имеют CD34 ) – маркера гематопоэтических предшественников и CD45 и лейкоцитов. (Б) 99,6% клеток популяции МСК экспрессируют рецептор PDGFR (В), характерный для перицитов .

Такой профиль экспрессии является типичным для мезенхимных стромальных клеток (МСК), согласно International Society for Cellular Therapy Statement (Dominici, et al. 2006). МСК также экспрессируют маркеры, характерные для перицитов, такие как NG2 и PDGFR, что свидетельствует в пользу принадлежности этих клеток к прогениторным периваскулярным клеткам (Traktuev, et al. 2008; Zannettino, et al .

2008) .

Оценка профиля экспрессии генов провоспалительных и 2.2 .

противовоспалительных факторов клетками THP-1 при макрофагальной дифференцировке Для создания модели воспалительного окружения были использованы клетки линии промоноцитов человека THP-1. THP-1, обработанные ФМА, широко используются в качестве модельной системы изучения функций макрофагов (Qin 2012). Дифференцировка моноцитов в макрофаги сопровождалась изменением клеточной морфологии, в результате клетки суспензионной культуры уже в течение получаса после добавления ФМА прикреплялись к пластику, и постепенно приобретали плоскую амебоидную форму с хорошо развитым аппаратом Гольджи, разветвленной эндоплазматической сетью и большим числом свободных рибосом в цитоплазме. После воздействия ФМА клетки тщательно отмывали. Для исследования функциональных изменений, происходящих после обработки ФМА, и определения статуса формирующихся макрофагов методом RT-PCR оценивали уровень экспрессии ряда провоспалительных факторов, таких как IL1, IL6, IL8, а также противовоспалительных цитокинов IL4 и IL10 .

Оказалось, что уже через 2 часа после стимуляции моноцитов в клетках значительно возрастает уровень мРНК провоспалительных интерлейкинов, достигая максимума через 24 часа после активации (экспрессия гена IL1 увеличивается более чем в 700 раз, гена IL6 – более 170 раз и гена IL8 - более 1400 раз через 24 часа после активации) (рисунок 11А). Одновременно наблюдается увеличение экспрессии генов противовоспалительных факторов, но не столь значимо. Так экспрессия гена IL10 увеличивается примерно в 100 раз через 24 часа после активации, а увеличение экспрессии гена IL4 в 4,5 раза наблюдается только через 48 часов после активации) (Рисунок 11Б) .

А. Б .

Рисунок 11. Изменение уровня экспрессии генов провоспалительных (А) и противовоспалительных (Б) интерлейкинов в промоноцитах THP-1 через 2, 24 и 48 часов после обработки ФМА. Данные представлены в виде отношения уровня мРНК в опытном образце к контрольному (необработанные THP-1) .

Анализ уровня провоспалительных цитокинов и хемокинов, 2.3 .

секретируемых макрофагами В среде культивирования, кондиционированной макрофагами, анализировали концентрацию провоспалительных цитокинов и хемокинов методом иммуноферментного анализа (ИФА). Для сравнения использовали среду, кондиционированную неактивированными промоноцитами линии THP-1. Уже через сутки после активации дифференцировки макрофаги начинают выделять значительные количества хемокина CCL3 (MIP-1) в среду (от 304 пкг/мл через 24 часа после активации до 367 пкг/мл через 7 дней после активации), при этом промоноциты не секретируют этот белок. Через 48 часов после активации в среде увеличивается концентрация IL6 (до 21,7 пкг/мл, что в три раза превышает концентрацию в среде неактивированных THP-1). К 7 суткам культивирования концентрация IL6 составляет 301 пкг/мл. Концентрация хемокина CCL2 (MCP-1) растет как в среде культивирования макрофагов, так и в среде неактивированных THP-1, однако через 7 суток культивирования макрофаги секретируют в 4 раза больше данного хемокина по сравнению с THP-1 (186 пкг/мл и 42 пкг/мл соответственно). Что касается хемокина CCL1, его концентрация в среде культивирования макрофагов и промоноцитов существенно не отличается ни через 24, ни через 48 часов культивирования (33,5±3 пкг/мл). Однако через 7 суток культивирования макрофагов концентрация CCL1 в среде составляет 849 пкг/мл, что в 34 раза выше значения концентрации этого белка в среде культивирования контрольных клеток (24,9 пкг/мл) (рисунок 12) .

Таким образом, мы подтвердили, что промоноциты линии ТНР-1 через 24 часа после активации ФМА начинают экспрессировать гены провоспалительных факторов (IL1, IL6, IL8, TNF) и выделять в среду культивирования такие факторы как IL6 и CCL3 и могут быть использованы для моделирования условий воспаления in vitro .

Данную модель можно использовать с целью исследования изменений характеристик мезенхимных клеток при бесконтактном сокультивировании (морфология клеток, профиль экспрессии, миграционные характеристики и др.) .

–  –  –

Рисунок 12. Изменение концентрации провоспалительных цитокинов и хемокинов в среде культивирования клеточной линии THP-1 (синие столбики) и макрофагов (красные столбики) .

Анализ профиля экспрессии генов провоспалительных и 2.4 .

противовоспалительных факторов МСК после сокультивирования Известно, что действие воспалительных факторов определенной концентрации и непосредственное сокультивирование МСК с моноцитами/макрофагами имеет разный эффект на мезенхимные клетки, в частности на профиль экспрессии различных генов в МСК (Crop, et al. 2010). Поэтому для изучения влияния макрофагов на МСК мы использовали модифицированную модель бесконтактного сокультивирования двух этих типов клеток. Анализ уровня мРНК в МСК провоспалительных цитокинов IL1, IL6, IL8 и TNF показал рост экспрессии генов данных факторов через 24 часа после начала эксперимента (в среднем IL1 в 42 раза, IL6 в 26 раз, IL8 в 18 раз, TNF в 10 раз по сравнению в контролем), и через 48 часов (в среднем IL1 в 21 раз, IL6 в 23 раза, IL8 в 31 раз, TNF в 7 раз по сравнению с контролем)(рисунок 13А) Уровень мРНК генов противовоспалительных факторов (IL4, IL10, TGF) в МСК значительно не изменялся ни через 24 часа, ни через 48 часов сокультивирования с макрофагами (рисунок 13Б). Это говорит о приобретении МСК на ранних этапах развития воспалительной реакции провоспалительного фенотипа (MSC1, по аналогии с «поляризацией» макрофагов (Waterman, et al. 2010)) и возможной роли этих клеток в стимуляции воспаления за счет выделения провоспалительных цитокинов. Поскольку изменение уровня мРНК было отмечено только для противовоспалительных факторов, мы решили оценить уровень одного из них в среде сокультивирования. Мы выбрали IL6, поскольку обнаружили большие количества мРНК в МСК для данного цитокина по сравнению с остальными .

Изменение уровеня секреции противовоспалительных факторов не оценивали, т.к. не было обнаружено изменение уровня мРНК этих факторов в МСК .

А. Б .

Рисунок 13. Изменение уровня экспрессии генов провоспалительных (А) и противовоспалительных (Б) интерлейкинов в МСК после 24 и 48 часов сокультивирования с макрофагами. Данные представлены в виде отношения уровня мРНК в опытном образце к контрольному (МСК, культивированные с добавлением среды роста RPMI 1640) .

Анализ количества провоспалительных интерлейкинов в среде 2.5 .

сокультивирования МСК и макрофагов IL6 Для анализа использовали среду сокультивирования МСК и макрофагов, а также среду, кондиционированную отдельно МСК и макрофагами. Поскольку продукция белка может быть отсроченной по отношению к изменению уровня экспрессии гена данного белка, мы анализировали дополнительную временную точку

– 7 суток. Измерение количества белка методом ИФА выявило, что МСК выделяют в среду значительное количество IL6, его концентрация достигает 2 нг/мл на 7 сутки кондиционирования. Моноциты по мере дифференцировки в макрофаги также выделяют IL6, однако, при совместном культивировании количество IL6 в среде сокультивирования растет особенно сильно, достигая к 7 суткам сокультивирования 25 нг/мл (Рисунок 14). Таким образом, рост уровня IL6 происходит не только на уровне мРНК, но и на уровне белка, причем такие концентрации данного фактора могут оказывать физиологический эффект. Очевидно, что объяснить тако й рост уровня секретированного белка простым суммированием секретома МСК и макрофагов невозможно, поэтому в данной системе имеет место взаимное влияние МСК и макрофагов, в результате которого выделение IL6 в среду возрастает в тысячи раз .

IL1 Анализ количества провоспалительного интерлейкина IL1 в среде не выявил значительного увеличения этого фактора даже через 7 суток после начала сокультивирования МСК и макрофагов .

Рисунок 14. Изменение концентрации IL6 в среде, кондиционированной МСК (красный столбик), макрофагов (белый столбик) и среде сокультивирования МСК и макрофагов (зеленый столбик) через 24, 48 часов и 7 суток культивирования .

Анализ профиля экспрессии генов хемокинов и их рецепторов МСК 2.6 .

после сокультивирования с помощью системы RT2 Profiler PCR Array Экспрессия генов хемокинов 2.6.1 .

Хемокины наряду с интерлейкинами являются важнейшими медиаторами воспалительного процесса, привлекая в зону воспаления иммунокомпетентные клетки. При помощи системы RT2 Profiler PCR Array была проанализирована экспрессия спектра генов хемокинов и их рецепторов в МСК, а также обнаружены изменения уровня мРНК в МСК при сокультивировании с макрофагами в течение 24 и 48 часов. Было обнаружено, что МСК экспрессируют больше всего мРНК CCL2 (MCP-1), и значительно меньше (в 10-20 раз) мРНК таких хемокинов, как CCL3 (MIPCXCL1, CXCL3, CXCL5, CXCL6. Однако после сокультивирования с активированными макрофагами уровень мРНК многих хемокинов в МСК увеличивается в десятки раз. В таблице 4 представлены значения отношения уровня экспрессии генов в опыте к контрольному уровню. При этом можно проследить динамику экспрессии генов некоторых хемокинов: уровень мРНК CCL1, CCL5, CXCL9, CXCL10 и CXCL11 продолжает расти и на вторые сутки сокультивирования, в то время как уровень мРНК остальных хемокинов не меняется либо снижается через 48 часов (по сравнению с 24 часами). Возможно, эта группа хемокинов, экспрессируемых МСК, играет роль в переходе от начальной стадии воспалительной реакции к следующим стадиям регенерации. Кроме того были выявлены хемокины, экспрессия генов которых падала в ходе сокультивирования с макрофагами. В их числе оказался CXCL12 (SDF1), который по данным литературы отвечает за стимуляцию миграции клеток и в том числе за хоуминг МСК в поврежденную область при регенерации .

Таблица 6. Изменение уровня экспрессии генов хемокинов в МСК через 24 и 48 часов после сокультивирования с макрофагами .

Данные представлены в виде отношения уровня экспрессии гена в эксперименте к контрольному. actT – активированные Т-клетки, B – В-клетки, Bs – базофилы, Eo – эозинофилы, iDC – незрелые дендритные клетки, Mo – моноциты, NK – натуральные киллеры, PMN – нейтрофилы, T – покоящиеся Т-клетки .

-10 -5 0 5 10

–  –  –

Экспрессия генов рецепторов к хемокинам 2.6.2 .

Рецепторами к хемокинам являются семидоменные рецепторы, сопряженные с g-белками. Помимо самих хемокинов была проанализирована экспрессия генов рецепторов к ним (Таблица 7). Уровень мРНК этих генов в МСК оказался относительно низким. Была выявлена экспрессия генов рецептора CCR1, лигандами которого являются CCL-хемокины (в частности CCL3 (MIP-1) и CCL5 (RANTES)) и CCR5 (лиганды CCL3, CCL4, CCL5). Однако под влиянием сокультивирования с макрофагами уровень мРНК гена рецепторов CCR1 и CCR5 значительно не менялся ни через 24 часа, ни через 48 часов сокультивирования. Также была о бнаружена экспрессия гена CXCR4, лигандом которого является CXCL12, при этом при сокультивировании с макрофагами в течение суток экспрессия гена этого рецептора увеличивалась почти в 6 раз. Кроме того, росла экспрессия генов CXCR3 (в 6,2 раз), XCR1 (в 9,9 раз), CCR7 (в 8,4 раз), CX3CR1 (в 4,5 раз). Экспрессия гена TLR2 возрастала в 6,8 раз, в то время как экспрессия TLR4 снижалась в 2,7 раза Таблица 7. Изменение уровня экспрессии генов рецепторов хемокинов в МСК через 24 и 48 часов после сокультивирования с макрофагами. Данные представлены в виде отношения уровня экспрессии гена в эксперименте к контрольному .

-10 -5 0 5 10

–  –  –

Анализ уровня хемокинов в среде сокультивирования МСК и 2.7 .

макрофагов CCL2 (MCP-1) Для анализа использовали среду сокультивирования МСК и макрофагов, а также среду, кондиционированную отдельно МСК и макрофагами. Ранее RT-PCR методом мы показали, что в МСК синтезируется наибольшее количество мРНК хемокина CCL2. Как показало измерение количества белка методом ИФА, МСК выделяют в среду значительное количество хемокина CCL2 (MCP-1) – его концентрация в среде вырастала до 6 нг/мл на 7 сутки культивирования МСК. При совместном культивировании с макрофагами значения концентрации CCL2 в среде сокультивирования составляло около 25 нг/мл через 7 суток после начала эксперимента (рисунок 15). Моноциты по мере активации и дифференцировки также начинают выделять CCL2 в среду, однако при совместном культивировании концентрация этого фактора в среде вырастает настолько сильно, что этот эффект нельзя объяснить простым суммированием. По-видимому, МСК и макрофаги взаимно стимулируют секрецию этого хемокина, за счет чего в системе происходит значительный рост количества CCL2 .

CCL3 (MIP-1) Другой хемокин CCL3 (MIP-1) по данным ИФА секретируется в большей степени макрофагами (до 367 пкг/мл) и в меньшей степени МСК (до 25 нг/мл). Его уровень также сильно возрастает при совместном культивировании МСК с макрофагами (до 900 пкг/мл) и снижается с течением времени (рисунок 16). Это можно объяснить относительной нестабильностью этого фактора в среде, однако возможно также имеет место постепенное снижение его продукции в системе сокультивирования со временем .

–  –  –

CCL1 Как было показано ранее, наиболее значительный рост экспрессии гена в МСК в ходе сокультивирования с макрофагами наблюдался для хемокина CCL1, уровень мРНК которого поднимался более чем в 140 раз после 48 часов сокультивирования .

Концентрация белка в системе сокультивирования начинала расти через 48 часов по сравнению с МСК и макрофагами, культивированными по отдельности .

Максимальное количество белка CCL1 в среде (1,8 нг/мл) наблюдалось через 7 дней сокультивирования, при этом в среде культивирования макрофагов также значительно возросла концентрация CCL1 (до 0,8 нг/мл) (рисунок 17) .

–  –  –

Анализ экспрессии генов металлопротеиназ и системы урокиназы, 2.8 .

отвечающих за клеточную миграцию, в МСК после сокультивирования Мезенхимные клетки секретируют протеазы для деградации внеклеточного матрикса (ВКМ), реструктурируя его в ходе миграции. В число таких протеаз входят металлопротеазы (ММП), для активности которых необходимы связанные ионы цинка или кальция, и сериновые протеазы, к которым относится активатор плазминогена урокиназного типа (урокиназа, uPA). Рецептор урокиназы (uPAR) в ходе миграции клетки локализуется на ее лидирующем крае и, связываясь с урокиназой, активирует ее, что приводит к таргетной локальной деградации ВКМ. Т .

е. изменение системы урокиназы и MMП являются характеристикой миграционных способностей МСК. Мы проанализировали, как изменяется экспрессия генов данных систем в МСК после сокультивирования с макрофагами. Оказалось, что уже после 24 часов сокультивирования возрастает экспрессия урокиназы (в 4,6 раз), ее рецептора (в 8,7 раз), а также матриксной металлопротеиназы ММП9 (в 6,4 раза). При этом уровень экспрессии генов матриксной металлопротеиназы ММП2 значительно не изменяется (рисунок 18) .

Рисунок 18. Изменение уровня экспрессии генов урокиназы, ее рецептора и матриксных металлопротеиназ через 24 и 48 часов сокультивирования с макрофагами. Данные представлены в виде отношения уровня экспрессии гена в опыте к контрольному .

Изменение морфологии МСК при сокультивировании с макрофагами 2.9 .

Мезенхимные клетки жировой ткани при культивировании в субконфлуентном монослое представляют собой распластанные полигональные клетки фибробластоподобной формы (рисунок 19, А). После 24 часов культивирования МСК в присутствии макрофагов клетки приобретали веретеновидную форму, отмечалось снижение формирования ламеллоподий (рисунок 19, Б). При этом клетки располагались тяжами в определенном направлении. Возможно, такие изменения указывают на приобретение клетками промиграторного фенотипа, формирование которого тесно связано с перестройками системы цитоскелета .

При культивировании в условиях субконфлюентного монослоя сеть микротрубочек в большинстве клеток МСК имеет выраженный единый центр расположенный рядом с ядром (рисунок 21А) .

А. Б .

Рисунок 19. При действии кондиционированной среды от макрофагов МСК приобретали веретеновидную форму. Фазовый контраст. Увеличение объектива х10 .

А – контрольные клетки; Б – МСК после 24 часов инкубации со средой кондиционированной макрофагами в течение 24 часов .

При обсчете таких клеток на препаратах и статистической обработке было обнаружено, что в контроле 74,1±10,7 % клеток имеют единый центр организации микротрубочек (обсчет проводился на 1000 клеток на каждом препарате. Обсчеты проводили в двух независимых повторах. При культивировании МСК в условиях экспериментального воспаления выраженный клеточный центр был обнаружен только в 16,3±8,6% клеток (р0,05). В большей части клеток микротрубочки не формировали сети с единым клеточным центром, а были ориентированы вдоль длинной оси клетки. На рисунке 20 представлена гистограмма, иллюстрирующая снижение в условиях экспериментального воспаления числа клеток, содержащих выраженный клеточный центр .

При исследовании организации сети микрофиламентов в МСК, обнаружено, что как в стандартных условиях, так и в условиях сокультивирования с макрофагами актиновые филаменты формировали крупные пучки (возможно, стресс-фибриллы) (рис. 21Г) .

Анализ промежуточных филаментов с использованием антител к виментину не выявил разницы в организации сети промежуточных филаментов в контроле и при сокультивировании МСК с макрофагами (рисунок 21 Д, Е). Таким образом, коллапс промежуточных филаментов при действии на МСК факторов, секретируемых активированными макрофагами, не происходит, а основные перестройки цитоскелета касаются микротрубочек .

Рисунок 20. Процент МСК, содержащих выраженный клеточный центр, в контроле и в условиях сокультивирования с макрофагами .

А. Б .

В. Г .

Д. Е .

Рисунок 21. Иммуноцитохимическое выявление -тубулина (А, Б), актина (В,

Г) и виментина (Д, Е) в клетках первичной культуры МСК (2 пассаж) (контроль А, В,

Г) при сокультивировании с макрофагами (опыт Б, Г, Е). Ядра помечены DAPI (синий). Масштабный отрезок 25 мкм .

Исследование изменений фокальных контактов МСК в условиях 2.10 .

сокультивирования с макрофагами Д. Е .

Фокальные контакты – крупные адгезионные структуры, демонстрирующие высокую стабильность. Они в значительно меньшей степени подвержены перестройкам, чем, например, фокальные комплексы. Активно мигрирующие клетки не имеют зрелых фокальных контактов (Vicente-Manzanares, et al. 2011). Для исследования морфологии и локализации фокальных контактов в условиях экспериментального воспаления in проводили иммуноцитохимическое vitro выявление белка винкулина, одного из компонентов фокальных контактов (рисунок 22) .

А. Б .

Рисунок 22. Иммуноцитохимическое выявление винкулина (зеленый) в клетках первичной культуры МСК (2 пассаж) в контроле (А) и при сокультивировании с макрофагами (Б). Ядра помечены DAPI. Масштаб 25 мкм .

Клетки в условиях сокультивирования с макрофагами не формировали крупных фокальных комплексов. При этом, как показано на рисунке, в условиях экспериментального воспаления в МСК присутствуют единичные мелкие винкулинпозитивные структуры. Такое распределение фокальных контактов может свидетельствовать о повышении подвижности клеток в условиях сокультивирования с макрофагами .

Подвижность МСК в среде кондиционированной макрофагами 2.11 .

(ненаправленная миграция) Подвижность МСК измеряли на модели «царапины» монослоя. Средняя скорость движения клеток при действии среды, кондиционированной макрофагами в течение 24 часов, составляла 10,49 пкс/час (±1,21 пкс/час). В контроле клетки двигались со средней скоростью 5,34 пкс/час (±1,47 пкс/час). Таким образом, подвижность МСК при добавлении среды, кондиционированной макрофагами (в условиях отсутствия градиента хемоаттрактанта), увеличивалась почти вдвое (рисунок 23). Можно предположить, что макрофаги, секретируя факторы, вызывают формирование промиграторного фенотипа у МСК и увеличивают подвижность этих клеток .

Рисунок 23. Средняя скорость МСК на модели царапины (scratch assay) без градиента хемоаттрактанта увеличивалась в 2 раза при действии кондиционированной среды от макрофагов, р0,05 .

Зависимость скорости направленной миграции МСК в системе 2.12 .

xCELLigence от вида матрикса Для покрытия разделительной мембраны через которую предстояло мигрировать клеткам МСК были использованы два основных белка внеклеточного матрикса – коллаген I типа и фибронектин. Эти белки традиционно применяют в качестве внеклеточного матрикса в экспериментах, в которых оценивают направленную миграцию клеток. Было обнаружено, что в системе xCELLigence средняя скорость миграции МСК за первые 8 часов с начала эксперимента через мембрану, покрытую фибронектином, была значительно выше скорости миграции через мембрану, покрытую коллагеном I типа (рисунок 24) .

Исходя из полученных результатов, все эксперименты по миграции МСК в системе xCELLigence проводили с использованием фибронектина в качестве оптимального матрикса для миграции МСК .

Рисунок 24. МСК в системе xCELLigence в 1,65 раза быстрее мигрировали через мембрану, покрытую фибронектином, по сравнению с миграцией через коллаген I типа. А – кривые роста клеточного индекса МСК за первые 8 часов, красная кривая – через коллаген I типа, зеленая – через фибронектин. Б – скорость изменения клеточного индекса (увеличение числа клеток на нижней части разделительной мембраны), единиц/час .

Направленная миграция МСК на хемокины и факторы роста 2.13 .

Для определения хемоаттрактантов, регулирующих направленную миграцию МСК in vitro была проанализирована скорость хемотаксиса этих клеток в системе xCELLigence на факторы роста PDGF-BB, IGF, uPA, которые оказываются наиболее эффективными по данным литературы. Также в качестве хемоаттрактантов были использованы хемокины CCL3, CCL4, CCL5 и CXCL16, поскольку в ходе работы мы обнаружили изменение экспрессии генов рецепторов данных хемокинов (CCR1и CCR5) в МСК в эксперименте. Наиболее эффективным хемоаттрактантом оказался PDGF-BB, который в концентрации 10 нг/мл увеличивал скорость хемотаксиса МСК в 2,8 раз по сравнению с отрицательным контролем. IGF не оказал значительного эффекта на скорость клеток .

Добавление в нижнюю камеру uPA (100нМ) в качестве хемоаттрактанта дозозависимо подавляло миграцию МСК на нижнюю поверхность мембраны. В концентрации 10 нМ урокиназа незначительно снижала скорость МСК, причем это эффект увеличивался при росте концентрации uPA до 50нМ и 100нМ .

Все остальные протестированные хемокины не оказывали заметного хемотактического действия на МСК, при добавлении их в нижнюю камеру планшета скорость миграции МСК значительно не изменялась (рисунок 25) .

Скорость миграции клеток, единиц/час

–  –  –

Предварительное сокультивирование с макрофагами не влияет на 2.14 .

скорость хемотаксиса МСК по градиенту хемокинов Мы проанализировали, как изменяется скорость хемотаксиса МСК на хемокины, рецепторы к которым экспрессируются в данных клетках в относительно большом количестве – CCR1 и CCR5, лигандами которых являются хемокины CCL3, CCL4, CCL5. Однако значительного влияния на скорость миграции МСК 2 пассажа хемокины CCL3, CCL4, CCL5 не оказали. После сокультивирования с макрофагами мы наблюдали значительное увеличение скорости миграции МСК по сравнению с контрольными клетками, однако ни один из протестированных хемокинов не влиял на скорость миграции клеток (рисунок 26). Таким образом, сокультивирование стимулировало направленную миграцию МСК, которая не определялась градиентом протестированных хемокинов .

Рисунок 26. Скорость направленной миграции МСК в контроле и после сокультивирования с макрофагами на хемокины Предварительное сокультивирование с макрофагами увеличивает 2.15 .

скорость направленной миграции МСК на PDGF-BB в системе xCELLigence .

Одним из наиболее известных хемоаттрактантов для мезенхимных клеток является PDGF-BB. Добавленный в нижнюю камеру планшета в концентрации 10 нг/мл PDGF-BB стимулировал скорость миграции МСК, которая возрастала в 2,8 раза по сравнению с отрицательным контролем. После предварительного сокультивирования с макрофагами, МСК в 2,7 раза быстрее, чем контрольные клетки двигались по градиенту PDGF-BB (рисунок 27). Таким образом оказалось, что сокультивирование с макрофагами способствует увеличению скорости миграции МСК на хемоаттрактант PDGF-BB. При сравнении скорости миграции МСК после сокультивирования с макрофагами и контрольных (рисунок 27, синие столбики) в камере без добавления хемоаттрактанта оказалось, что после сокультивирования клетки быстрее двигались даже без градиента PDGF-BB .

Скорость миграции клеток, единиц/час

Рисунок 27. Скорость миграции МСК в системе xCELLigence, единиц/час .

PDGF-BB значительно стимулировал хемотаксис МСК, причем скорость миграции МСК на PDGF-BB значительно возрастала после сокультивирования с макрофагами .

В отрицательном контроле (без хемоаттрактанта) МСК, предварительно сокультивированные с макрофагами, мигрировали быстрее, чем контрольные клетки (синие столбики) .

При сокультивировании с макрофагами в МСК возрастает уровень 2.16 .

экспрессии гена PDGFR и его белка Мы проанализировали, как изменяется количество мРНК рецептора PDGFR в МСК после сокультивирования с макрофагами. По данным RT-PCR уровень экспрессии гена PDGFR в МСК, при сокультивировании с макрофагами в течение 24 часов, возрастает в среднем в 24,7 раз, по сравнению с клетками в контроле (рисунок 32). По данным иммуноцитохимического исследования, через 24 часа сокультивирования увеличивается количество рецептора PDGFR на клетках МСК (рисунок 28) .

Таким образом, макрофаги вызывают увеличение числа рецепторов к PDGF-BB на мембране МСК, в результате чего в воспалительных условиях растет чувствительность МСК к их основному хемоаттрактанту (PDGF-BB) .

А. Б .

Рисунок 28. Увеличение PDGFR на поверхности МСК. После сокультивирования с макрофагами (Б) на поверхности МСК иммуноцитохимически выявлено увеличение экспрессии рецептора PDGFR, чем на контрольных клетках (А). Масштабный отрезок соответствует 25µm .

Блокирующие антитела к PDGF-BB не влияют на скорость миграции 2.17 .

МСК через фибронектин Мы обнаружили, что МСК после сокультивирования с макрофагами даже в условиях отсутствия смоделированного градиента хемоаттрактанта мигрируют в системе xCELLigence быстрее, чем контрольные клетки. Поскольку по данным литературы и макрофаги и МСК могут секретировать PDGF-BB, мы проверили, стимулирует ли эндогенный направленную миграцию МСК, PDGF-BB сокультивированных с макрофагами. Для этого в системе xCELLigence в нижнюю камеру добавляли PDGF-BB (10 нг/мл, положительный контроль), блокирующие антитела к PDGF-BB (50 нг/мл, для подавления эндогенного фактора) и комбинацию PDGF-BB (10 нг/мл) и блокирующих антител (50 нг/мл). В верхнюю камеру на мембрану, покрытую фибронектином, вносили МСК 2 пассажа, предварительно сокультивированные с макрофагами в течение суток, либо контрольные клетки. При добавлении блокирующих антител вместе с PDGF-BB, частично снижалась скорость стимулированной этим фактором клеточной миграции, однако оказалось, что блокирующие антитела не снижали скорость миграции МСК через фибронектин, что показало отсутствие аутокринного действия эндогенного PDGF-BB в данной системе (рисунок 29). Таким образом, аутокринная секреция PDGF-BB МСК в нашей модели не вносила существенного вклада в стимуляцию миграции .

Скорость миграции клеток, единиц/час Рисунок 29. Средняя скорость миграции МСК, единиц/час, под влиянием PDGF-BB, блокирующих антител к PDGF-BB и комбинации PDGF-BB и блокирующих антител к нему .

Из полученных данных следует, что сокультивирование с макрофагами увеличивало скорость направленной миграции МСК через фибронектин. Однако добавление антител как в присутствии PDGF-BB, так и в его отсутствие не снимало полностью эффект вызванный сокультивированием с макрофагами. Эти данные позволили нам предположить, что помимо стимуляции PDGF-BB существует механизм миграции МСК, который активируется под действием факторов, выделяемых макрофагами .

–  –  –

Рисунок 30. Схема сигнальных путей, активирующихся при димеризации рецептора PDGFR и мишени действия ингибиторов .

В верхнюю камеру на мембрану, покрытую фибронектином, добавляли МСК 2 пассажа, предварительно сокультивированные с макрофагами в течение суток, либо контрольные клетки. В первые 8 часов после начала эксперимента скорость миграции МСК предварительно сокультивированных с макрофагами была в 2,46 раза выше, чем контрольных клеток. При этом действие ингибиторов подавляло миграцию клеток, снижая ее скорость в 3,63 и 12,33 раза (при действии LY294002) и в 2,43 и 6,03 раза (при действии AG1296) в контроле и в опыте, соответственно (рисунок 31). При действии ингибиторов скорость миграции контрольных и опытных клеток значительно не отличалась. Эти данные свидетельствуют о том, что сигнализация рецептора PDGFR активирует миграцию МСК через фибронектин. Как было показано выше, в условиях сокультивирования под влиянием секретируемых макрофагами факторов число рецепторов PDGFR на мембране МСК существенно увеличивалось, вследствие чего, по-видимому, росла скорость движения клеток при связывании с фибронектином .

Рисунок 31. Средняя скорость миграции МСК, как контрольных, так и предварительно сокультивированных с макрофагами, значительно снижалась при воздействии ингибиторов сигнальных путей PDGFR .

При сокультивировании с макрофагами в МСК возрастает уровень 2.19 .

экспрессии генов интегринов 3, 4, 5, 1 и уровень белка - интегрина 1 (CD29) Известно, что активация рецепторов ростовых факторов может быть вызвана связыванием внеклеточного матрикса интегриновыми рецепторами. Мы проанализировали, как изменяется количество мРНК основных цепей интегринов, принимающих участие во взаимодействии с белками внеклеточного матрикса (коллагеном I типа, фибронектином и ламинином) в МСК после сокультивирования с макрофагами. По данным RT-PCR уровень экспрессии гена интегрина 1 (CD29) в МСК, со-культивируемых с макрофагами в течение 24 часов, возрастает в среднем в 7,82 раз, по сравнению с клетками в контроле. В среднем в 49,95 раз увеличивается уровень экспрессии гена цепи интегрина 3, и в 11,2 раз – цепи интегрина 5 (рисунок 29). Проведенное иммуноцитохимическое исследование подтвердило, что через 24 часа сокультивирования увеличивается количество белка интегрина 1 на поверхности МСК (рисунок 33). Интегрин 31 является рецептором для связывания клеток с фибронектином и ламинином, а интегрин 51 – с фибронектином. При связывании с внеклеточным матриксом (в нашей модельной системе – фибронектином) повышенная концентрация интегринов на мембране может активировать PDGFR сигналинг, что приводит к увеличению скорости движения клеток по фибронектину. Это предположение было проверено далее .

А. Б .

Рисунок 32. Изменение уровня экспрессии генов рецептора PDGFR (А) и цепей интегринов (3, 4, 5, 1) (Б) при совместном культивировании МСК с макрофагами в течение 24 часов. Результаты представлены в виде отношения уровня экспрессии гена в МСК после инкубации с макрофагами к уровню экспрессии гена в клетках контроля .

А. Б .

Рисунок 33. Иммуноцитохимическое выявление рецепторов интегрина 1 на мембране контрольных МСК 2 пассажа (А) и при совместном культивировании МСК с макрофагами в течение 24 часов (Б). Масштабный отрезок соответствует 25µm .

При связывании МСК с фибронектином увеличивается уровень 2.20 .

фосфорилированного Akt под действием макрофагов Известно, что при связывании МСК с внеклеточным фибронектином именно интегрин 51 стимулирует активацию внутриклеточной сигнализации PDGFR, которая включает фосфорилирование сигнального белка Akt (Veevers-Lowe, et al .

2011) .

Уровень фосфорилированного Akt оценивали с помощью иммуноблоттинга .

При совместном культивировании МСК с макрофагами на непокрытом пластике уровень фосфорилированного Akt снижался по сравнению с контрольным. Однако в случае, когда клетки высаживали на пластик, покрытый фибронектином, уровень фосфорилированного Akt возрастал как в контрольных клетках, так в клетках, культивируемых совместно с макрофагами (рисунок 34). Эти данные свидетельствуют, что для активации сигнального каскада PDGFR требуется связывание фибронектина через интегриновые рецепторы. Такое взаимодействие в итоге активирует фосфорилирование Akt, что ведет к реорганизации актинового цитоскелета и миграции клеток .

Рисунок 34. Выявление при помощи иммуноблоттинга фосфорилированного Akt в клетках МСК. При сокультивировании МСК с макрофагами на непокрытом пластике уровень фосфорилирования Akt низкий. При культивировании клеток на фибронектине уровень фосфорилированного Akt возрастал как в контрольных клетках, так и в МСК, культивируемых в присутствии макрофагов. Уровень общего Akt не менялся .

При сокультивировании МСК с макрофагами изменяется уровень 2.21 .

экспрессии генов белков внеклеточного матрикса Синтез и ремоделирование внеклеточного матрикса (ВКМ) является одной из основных функций МСК. Изменение состава ВКМ, синтезируемого МСК в процессе регенерации в воспалительном окружении определяет как эффективность миграции самих мезенхимных клеток, так и ряда других (эндотелиоциты, местные тканеспецифические предшественники). По нашим данным, полученным с помощью RT-PCR анализа, при сокультивировании МСК с макрофагами экспрессия гена коллагена I типа начинала снижаться уже через 24 часа, а в течение 48 часов уровень экспрессии снижался в среднем в 3,59 раз. Уровень экспрессии гена фибронектина падал в 4,23 раза уже через 24 часа сокультивирования, после 48 часов сокультивирования уровень экспрессии этого гена был в 5,22 раз ниже, чем в контрольных клетках. При анализе экспрессии гена ламинина было обнаружено увеличение его экспрессии как через 24 часа (в среднем в 7,11 раза по сравнению с контролем), так и через 48 часов (в 2,34 раза по сравнению с контролем) культивирования МСК с макрофагами (рисунок 35) .

Рисунок 35. Изменение уровня экспрессии в МСК генов белков внеклеточного матрикса при их совместном культивировании с макрофагами в течение 24 часов .

Результаты представлены в виде отношения уровня экспрессии гена в МСК после инкубации с макрофагами к уровню экспрессии гена в контрольных клетках .

3. ОБСУЖДЕНИЕ При регенерации тканей МСК координируют восстановление ткани: они способны синтезировать внеклеточный матрикс, формируя строму для внедрения других типов клеток (эндотелиоциты, резидентные тканеспецифичные предшественники) секретировать ангиогенные и (Wight, et al. 1986);

нейротрофические факторы, стимулируя реваскуляризацию и подрастание нейритов (Horwitz, et al. 2008; Rubina, et al. 2009); оказывать иммуномодулирующее действие, регулировать иммунный ответ (Chen, et al. 2011; Rasmusson 2006); кроме того, МСК способны дифференцироваться в функциональные элементы ткани (остеобласты, хондроциты, адипоциты) (Pittenger, et al. 1999; Zuk, et al. 2001). Поэтому на сегодняшний день можно говорить об МСК как об одном из основных участников регенерации тканей после повреждения .

Практически всегда при повреждениях ткани развивается воспалительная реакция, которая является неотъемлемой частью регенеративного процесса .

Воспаление представляет собой сложно скоординированную во времени систему взаимодействий между иммунными клетками (нейтрофилами, моноцитами, макрофагами, лимфоцитами и тромбоцитами), специализированными клетками ткани (фибробласты, МСК, региональные предшественники и др.) и компонентами внеклеточного матрикса. Межклеточные взаимодействия могут быть опосредованы как прямым контактом, так и секретируемыми факторами (факторами роста, хемокинами, микроРНК). По данным литературы, макрофаги являются одним из ключевых участников, определяющих эффективность воспалительного процесса (Weidenbusch, et al. 2012) .

Классически активированные (провоспалительные макрофаги M1-like) секретируют провоспалительные факторы IL1, IL6, TNF, которые привлекают в очаг воспаления лимфоциты и вызывают их активацию. Что не менее важно, макрофаги синтезируют факторы роста (PDGF, TGF, EGF, VEGF, IGF-1), создавая градиент для хемотаксиса мезенхимных клеток и эндотелиоцитов. Кроме того, показано, что секретируемые макрофагами факторы INF, IL6, IL1 и TNF (Ghannam, et al. 2010) могут стимулировать активацию МСК, направляя воспалительный процесс. Под влиянием вырабатываемого эозинофилами, макрофаги могут IL4, дифференцироваться по альтернативному пути, приобретая противовоспалительный фенотип M2. Он характеризуется секрецией противовоспалительных цитокинов, таких как IL10 (Mosser, et al. 2008). Было обнаружено, что и МСК способны приобретать как провоспалительный, так и противовоспалительный фенотип. По аналогии с поляризацией макрофагов, эти фенотипы получили название MSC1 и MSC2 (Waterman, et al. 2010). Поэтому нашей задачей стало создание модели, отражающей взаимодействие МСК и макрофагов на ранних этапах развития воспаления, чтобы проанализировать активацию МСК в данных условиях .

Макрофаги образуются в результате дифференцировки моноцитов, однако in vitro работа с такими клетками затруднена вариабельностью свойств клеток полученных от разных доноров и сложностью получения воспроизводимой модели .

Для in vitro исследованиях широко используют линейные клетки THP-1 (промоноциты человека), которые можно стимулировать к макрофагальной дифференцировке LPS, INF или ФМА (Suzuki, et al. 2012). THP-1, обработанные ФМА, обычно используют как для изучения функций макрофагов (Kang, et al. 2012;

Lee, et al. 2012; Suzuki, et al. 2012), так и для создания систем сокультивирования в частности с МСК (Barminko, et al. 2011). Для создания модели мы использовали THPчерез несколько часов после стимуляции ФМА, имея дело, таким образо м, с клетками на ранних этапах макрофагальной дифференцировки. Как показал ПЦРанализ профиля экспрессии активированных THP-1, уровень экспрессии генов основных провоспалительных факторов начинает расти уже через 2 часа после активации и достигает максимума через 24 часа после активации. Известно, что включение генов IL-1 регистрируется в пределах 1 – 2 часов после действия активаторов по экспрессии цитоплазматической мРНК, белковый продукт появляется в цитоплазме через 3 – 4 часа, а через 4 – 6 часов цитокин выявляется в среде. В нашей модели мы наблюдали рост экспрессии гена IL1, однако нам не удалось выявить белковый продукт в среде культивирования макрофагов. Возможно, IL1, являясь белком острой фазы воспаления, выделяется моноцитами в малых концентрациях, которые находятся за пределами чувствительности метода, либо нестабилен в среде культивирования. Однако известно, что этот провоспалительный интерлейкин является одним из основных при регуляции МСК (Bigildeev, et al. 2015) .

По данным литературы экспрессия гена IL6 происходит в пределах 1 часа после активации, а секреция фактора – через несколько часов. В условиях нашей модели уровень IL6 в среде, кондиционированной макрофагами возрастал в 2 раза по сравнению с контрольными клетками через 48 часов после активации. Уровень мРНК данного фактора значительно возрастал уже через 24 часа после активации. Этот цитокин, как уже упоминалось выше, играет важную роль в стимуляции развития провоспалительного фенотипа МСК (Rattigan, et al. 2010), кроме того, есть данные о его хемоаттрактивной активности в отношении МСК (Anton, et al. 2012) .

Таким образом, макрофаги в используемой нами модели начинают в значительном количестве выделять в среду культивирования провоспалительные интерлейкины (в частности IL6), имитирующие воспалительное окружение, в которое попадают МСК в процессе регенерации ткани. Зачастую провоспалительные интерлейкины и их комбинации используются в известных концентрациях для создания воспалительного окружения (Crop, et Однако более al. 2010) .

физиологичным представляется сокультивирование МСК с иммунными клетками, поскольку данная система наиболее точно воспроизводит воспалительное окружение в тканях именно за счет динамики, регулируемой концентрации интерлейкинов, нестабильности в растворе и своевременного переключения с провоспалительного на противовоспалительный набор. Помимо классических цитокинов, участвующих в регуляции воспаления, мы обнаружили хемокины, которые, по данным разных исследователей, также могут привлекать в зону повреждения иммунные клетки. Так, уровень секретируемого хемокина MIP-1 (CCL3) после активации моноцитов возрастал в более чем в 40 раз по сравнению с контролем через 24 часа после активации. CCL3 является хемоаттрактантом для иммунных клеток, а также стимулирует секрецию провоспалительных интерлейкинов (IL1, IL6, TNF) макрофагами и фибробластами (Maurer, et al. 2004). Другие исследованные хемокины (CCL1, CCL2) начинали активно секретироваться макрофагами на более поздних сроках после активации. CCL2 является мощным хемоаттрактантом для моноцитов, кроме того, существуют данные о том, что он также может привлекать в зону повреждения МСК (Dwyer, et al. 2007) .

Таким образом, в модифицированной нами модели активации клетки линии THP-1, после добавления 50 нг/мл ФМА в течение часа, и последующей отмывки начинают дифференцироваться по классическому пути в провоспалительные макрофаги и могут быть использованы для моделирования in vitro взаимодействия макрофагов и мезенхимных клеток при регенерации .

Для исследования механизмов активации в условиях воспаления мы создали модель сокультивирования МСК с макрофагами. Прохожие модели включают в себя как контактное сокультивирование (Le Blanc, et al. 2003), так и сокультивирование с использованием разделяющей мембраны (Barminko, et al. 2011) для исключения прямого контакта клеток. В такой системе взаимное влияние происходит только за счет секретируемых клетками факторов, причем в отличие от действия кондиционированных сред, выделение факторов происходит постоянно. Такая модель позволяет воспроизвести действие короткоживущих в среде факторов, которые разрушаются вскоре после добавления кондиционированной среды к анализируемым клетками. Кроме того в такой системе имеет место обратная связь между мезенхимными и иммунными клетками, что лучше воспроизводит воспалительный процесс, происходящий in vivo. Очевидным плюсом системы бесконтактного сокультивирования является отсутствие необходимости разделять два типа клеток для анализа результатов воздействия одних на другие .

В разработанной нами модели МСК бесконтактно сокультивировали с макрофагами. В такой системе при анализе профиля экспрессии МСК после сокультивирования с макрофагами мы выявили повышение уровня мРНК провоспалительных интерлейкинов IL1, IL6, IL8 и TNF уже через 24 часа после начала эксперимента. При этом уровень противовоспалительных интерлейкинов IL4 и IL10 настолько значительно не изменялся, оставаясь на относительно низком уровне. Анализ уровня белка в кондиционированной среде показал, что уровень IL6 уже через сутки сокультивирования вырастет до отметки 12 нг/мл, что в десятки раз выше, чем количество IL6 секретируемого одними МСК. Такие результаты говорят об изменении функционального профиля секреции МСК в провоспалительном направлении. Аналогично макрофагальной дифференцировке, такой тип МСК получил название MSC1 (Waterman, et al. 2010). IL6 действует на МСК через свой рецептор, в результате чего фосфорилируется транскрипционный фактор STAT3, активация которого ведет к росту экспрессии белков острой фазы воспаления. В частности, МСК жировой ткани в ответ на 24-часовую стимуляцию IL6 начинают секретировать повышенные количества основного провоспалительного хемокина CCL2 (MCP-1), экспрессия гена которого находится под регуляцией STAT3 (Zhang, et al. 2009). Однако IL6 не является однозначно провоспалительным фактором. Так, было показано, что дифференцировка моноцитов и CD34+ клеток в дендритные клетки, по крайней мере, частично ингибируется выделяемым IL6, стимулированными МСК (Djouad, et al. 2007). Кроме того, известно, что in vitro IL6 является хемоаттрактантом для МСК костного мозга (Anton, et al. 2012; Rattigan, et al .

2010), а также способен стимулировать пролиферацию мезенхимных клеток и их дифференцировку в остеогенном направлении (Pricola, et al. 2009). Следовательно, IL6 может опосредовать ингибирование воспалительной реакции в ткани и постепенный переход к фазе репарации, которая начинается с приходом МСК в зону повреждения .

Мы обнаружили, что изменения экспрессии и секреции в МСК после сокультивирования с макрофагами затрагивают гены хемокинов и их рецепторов. По результатам анализа профиля экспрессии МСК обнаружено увеличение мРНК для гена CCL2 (MCP-1). МСК синтезируют этот хемокин и в контроле, однако под влиянием макрофагов вырастает как уровень его мРНК в МСК (через 24 и 48 часов сокультивирования), так и уровень белка в кондиционированной среде. Как было указано выше, экспрессия гена MCP-1 запускается фактором STAT3, который активируется в частности при включении сигнального каскада IL6. Скорее всего, рост уровня MCP-1 в нашей системе, по крайней мере, частично обусловлен стимуляцией IL6. Однако, по-видимому, существуют и другие механизмы, регулирующие повышение экспрессии гена MCP-1 и секреции этого белка, поскольку в результате стимуляции МСК только IL6 уровень хемокина остается вдвое меньшим по сравнению с его уровнем в среде сокультивирования. MCP-1 считается одним из основных хемоаттрактантов для моноцитов и макрофагов. Недавние исследования показали, что МСК костного мозга также несут рецептор CCR2, лигандом которого является MCP-1, хотя авторы данной работы не обнаружили хемотактического действия хемокина на мезенхимные клетки (Ringe, et al. 2007). Согласно нашим данным, МСК не экспрессируют ген рецептора CCR2 ни в контрольных условиях, ни после 24- или 48-часового сокультивирования с макрофагами. Можно предположить, что в организме активация секреции MCP-1 приводит к привлечению в зону воспаления иммунокомпетентных клеток, несущих данный рецептор, регулируя процесс воспаления .

Концентрация MIP-1 при сокультивировании уже через 24 часа повышалась более чем в 40 раз по сравнению с контролем. Значительный вклад в рост количества белка MIP-1 в среде вносили, очевидно, макрофаги, которые в большом количестве синтезировали его с первых суток, однако такой значительный рост концентрации в среде сокультивирования нельзя объяснить простым суммированием. Видимо, имеет место положительная обратная связь, в результате которой MIP-1, выделяемый макрофагами, стимулирует экспрессию гена MIP-1 в МСК. И действительно, по нашим данным, экспрессия гена MIP-1 в МСК растет после 24 часов сокультивирования с макрофагами, после чего через 48 часов снижается. Вероятно, MIP-1 является белком острой фазы воспаления и существуют механизмы, ограничивающие его синтез по мере развития воспалительной реакции. Рецепторами MIP-1 являются CCR1 и CCR5. Мы обнаружили, что МСК в контроле экспрессируют гены этих рецепторов, причем уровень мРНК не зависит от сокультивирования с моноцитами. Однако в тесте на хемотаксис МСК на MIP-1 in vitro мы не обнаружили разницы в скорости направленной миграции клеток относительно контроля. Таким образом, не удалось подтвердить, что MIP-1 является эффективным хемоаттрактантом для МСК как в норме, так и в условиях воспаления .

Однако резкое повышение секреции этого хемокина МСК в воспалительном окружении указывает на роль мезенхимных клеток в регуляции иммунного ответа за счет привлечения иммунокомпетентных клеток, в том числе макрофагов и нейтрофилов (Ramos, et al. 2005) .

В отличие от MCP-1 и MIP-1, в норме МСК синтезируют относительно небольшое количество мРНК CCL1. Ранее, CCL1 (I-309) считался продуктом моноцитов и Т-лимфоцитов, позднее было показано, что он может синтезироваться эндотелиальными клетками после активации липопротеинами (Harpel, et al. 2002). По нашим данным, количество мРНК CCL1 в МСК вырастает в 77 раз после 24 часов сокультивирования и в 148 раз после 48 часов по сравнению с контролем. Его концентрация в среде сокультивирования МСК и макрофагов через 24 часа сокультивирования складывается из количества белка, синтезированного двумя типами клеток. Однако уже через 48 часов после начала эксперимента концентрация CCL1 значительно возрастает (до 258 пкг/мл). Очевидно, секреция большого количества данного хемокина является именно эффектом сокультивирования. По нашим данным через 7 суток макрофаги синтезируют CCL1 в среду, однако при совместном культивировании с МСК концентрация белка в среде возрастает более чем в 2 раза, достигая 1,8 нг/мл. Рецепторы к CCL1 (CCR8) были обнаружены на эндотелиальных и гладкомышечных клетках, и оказалось, что CCL1 является хемоаттрактантом этих клеток. По-видимому, его хемотактический эффект реализуется через увеличение синтеза матриксной металлопротеиназы 2 типа (MMPв клетках-мишенях (Haque, et al. 2004). Однако по нашим данным в МСК не было обнаружено экспрессии рецептора CCR8 ни в контроле, ни после сокультивирования с макрофагами. Также мы не отметили изменения уровня экспрессии MMP-2 в мезенхимных клетках. Таким образом, по-видимому, CCL1 не играет значительной роли в миграции мезенхимных клеток, однако, учитывая его достаточно позднее появление в среде культивирования, можно предположить его участие в регуляции ангиогенеза за счет привлечения эндотелиальных и гладкомышечных клеток, формирующих стенку сосуда. Недавно было показано, что хемокин CCL1 является необходимым для поддержания состояния макрофагов, дифференцированных по альтернативному M2b типу (Asai, et al. 2012). Еще одной интересной находкой стало открытие феномена существования так называемых «макрофагов, обученных МСК»

(MSC-educated macrophages, MSC-Mo). Показано, что in vitro и in vivo МСК способны генерировать особым образом дифференцированные макрофаги, проявляющие противовоспалительные свойства (Eggenhofer, et al. 2012). Известно, что в формировании такого типа макрофагов принимает участие как непосредственное межклеточное взаимодействие, так и влияние растворимых секретируемых факторов, однако точные механизмы этого процесса еще не установлены. МСК могут стимулировать и поддерживать дифференцировку макрофагов по MSC-Mo типу именно при помощи CCL1, однако данная гипотеза требует дальнейшей проверки .

По нашим данным сокультивирование с макрофагами меняло не только секреторные характеристики МСК, но и морфологию клеток.

Так, после сокультивирования МСК с макрофагами мы обнаружили изменение формы МСК:

клетки в контроле распластанные, а в условиях сокультивирования с макрофагами приобретали веретенообразную форму и формировали вытянутые параллельные структуры. Такие изменения говорят в пользу приобретения клетками промиграторного фенотипа, который обычно сопровождается перестройками цитоскелета. Действительно, анализируя тубулиновый цитоскелет, мы обнаружили значительные изменения организации сети микротрубочек. При сокультивировании в большей части клеток микротрубочки не формировали сети с единым клеточным центром, а были ориентированы вдоль длинной оси клетки. Кроме того, в результате сокультивирования с макрофагами в 4,5 раза снижалось количество клеток, имеющих организованный клеточный центр. Мы не выявили изменений в локализации центриолей в условиях сокультивирования с макрофагами по сравнению с контролем .

Актиновые филаменты, как известно, играют важную роль на разных этапах миграции клеток: обеспечивают формирование протрузий и вместе с миозином II способствуют перемещению тела клетки. При этом происходит перестройка и формирование тонкой сети и разборка более стабильных структур, таких как, стрессфибриллы (Alexandrova, et al. 2008; Jaganathan, et al. 2007). Однако есть единичные работы, показывающие возможность существования активной миграции клеток и при наличии стресс-фибрилл. Например, Meriane et al, 2006 в работе по исследованию роли RhoА и Rho киназ в S1P-индуцированной миграции МСК показал увеличение количества стресс-фибрилл (Meriane, et al. 2006). При сокультивировании с макрофагами актиновые филаменты в МСК формировали выраженную сеть стрессфибрилл, однако количественная обработка препаратов не выявила статистически значимой разницы в доле клеток со стресс-фибриллами. Наши исследования показали, что при активации миграции МСК в условиях сокультивирования с макрофагами не наблюдается драматического изменения организации актинового цитоскелета .

Известно, что морфология сети промежуточных филаментов зависит от состояния микротрубочек и микрофиламентов. На разных типах клеток показано, что деполимеризация микротрубочек связана с коллапсом промежуточных филаментов, при котором они формируют кольцевидную структуру вокруг ядра (Aubin, et al. 1980) .

Поскольку в нашем эксперименте в условиях сокультивирования с макрофагами наблюдались значительные перестройки системы микротрубочек и исчезновение активного клеточного центра, мы предположили, что сеть промежуточных филаментов также может реорганизоваться. Однако выявление промежуточных филаментов с помощью антител к виментину не выявило разницы в организации сети промежуточных филаментов в контроле и при сокультивировании МСК с макрофагами. Таким образом, коллапса промежуточных филаментов в МСК в условия смоделированного воспаления не наблюдается .

Еще одним структурным и функциональным элементом, участвующим в миграции клеток являются клеточные контакты. Показано, что динамичные перестройки клеточных контактов необходимы активно мигрирующим клеткам: в процессе миграции сборка адгезионных контактов осуществляется на ведущем крае клетки, а разборка – в хвостовой части (Alexandrova, et al. 2008). При формировании протрузий контакты в передней части клетки разбираются (Bershadsky, et al. 2006) .

Фокальные контакты – крупные адгезионные структуры, демонстрирующие высокую стабильность, они в значительно меньшей степени подвержены перестройкам, чем, например, фокальные комплексы, представляющие собой незрелые фокальные контакты. Активно мигрирующие клетки не имеют зрелых фокальных контактов (Vicente-Manzanares, et al. 2011) .

В нашем эксперименте мы использовали винкулин в качестве маркера адгезионных контактов, который выявляется как в стабильных зрелых структурах, так и в формирующихся. Поэтому о состоянии контактов мы могли судить на основании их относительных размеров (формирующиеся контакты – точкоподобные структуры около 1 мкм, а зрелые контакты достигают в размере 2 – 5 мкм) и их распределения по поверхности клетки .

МСК в условиях сокультивирования с макрофагами не формировали крупных фокальных комплексов. При этом в условиях экспериментального воспаления в МСК присутствуют единичные мелкие винкулин-позитивные структуры. Такое распределение фокальных контактов может свидетельствовать о повышении подвижности клеток в условиях сокультивирования макрофагами .

Молекулярные компоненты крупных, более стабильных контактов и мелких, более динамичных - одинаковы за некоторыми исключениями. Ранние адгезии очень подвижны и разбираются в течение нескольких минут, если не захватываются винкулином и талином – белками, которые инициируют связывание интегринов с матриксом. Если это происходит, то далее в комплекс привлекается паксиллин и актинин, вызывающие дальнейшую кластеризацию интегринов и связывание актина (Vorotnikov 2011). Таким образом, снижение числа винкулин-позитивных структур в клетках после сокультивирования с макрофагами говорит о приобретении МСК миграционного фенотипа .

Ранее другими авторами было показано, что действие отдельных провоспалительных факторов (TNF, INF) (Ponte, et al. 2007) или среды, кондиционированной макрофагами (Anton, et al. 2012), стимулирует миграцию МСК костного мозга in vitro. Мы предположили, что провоспалительные факторы, секретируемые макрофагами, способны активировать миграцию МСК. И действительно, на модели царапины «scratch assay» обнаружено, что скорость движения МСК возрастает при сокультивировании с макрофагами. Строго говоря, scratch assay показывает изменение скорости перемещения клеток по направлению в рану в отсутствие градиента хемоаттрактанта (миграция, которая не определяется хемотаксисом). Изменение скорости может зависеть от многих факторов, например, от перераспределения элементов цитоскелета или изменения лабильности белков в составе мембраны (Vorotnikov 2011). Хемотаксис же является результатом взаимодействия хемоаттрактанта с рецептором и последующего запуска сигнальных каскадов внутри клетки, которые вызывают изменение клеточной полярности, и способствуют движению клетки в определенном направлении (Welf, et al. 2011) .

При разработке модели для направленной миграции оказалось технически невозможным использовать в качестве аттрактанта в нижней камере макрофаги .

Поэтому сокультивирование с макрофагами проводили непосредственно перед помещением МСК в камеру для миграции. Учитывая, что in vivo в ране присутствует PDGF-BB в высокой концентрации, мы использовали его в качестве контрольного хемоаттрактанта .

Анализируя изменение скорости направленной миграции в системе xCELLigence, мы обнаружили, что МСК, предварительно инкубированные с макрофагами, значительно быстрее контрольных клеток мигрируют по градиенту PDGF-BB - одного из основных хемоаттрактантов для мезенхимных клеток. Т.е .

паракринные факторы, выделяемые макрофагами, не только увеличивают подвижность клеток, но и вызывают увеличение направленной миграции по градиенту PDGF-BB .

Фактор PDGF существует в виде гомо- или гетеродимера, состоящего из А- и В-полипептидных цепей.

Его биологическая активность осуществляется за счет связывания с двумя структурно схожими цепями тирозинкиназного рецептора:

PDGFR- и PDGFR-. Причем доказано, что для запуска хемотаксиса мезенхимных клеток необходима именно -цепь рецептора (Siegbahn, et al. 1990). После связывания с лигандом рецептор PDGFR гомо- или гетеродимеризуется и фосфорилируется по остаткам тирозина. Одними из ключевых участников сигнальных путей, обеспечивающих запуск хемотаксиса, является PI3-киназа, которая фосфорилирует белок Akt по остатку Ser473, после чего требуется фосфорилирование Akt по остатку Tyr308 для последующей реорганизации актинового цитоскелета и миграции клеток (Veevers-Lowe, et al. 2011) .

Мы использовали распространенные белки ВКМ (коллаген I типа и фибронектин) для покрытия мембраны, через которую мигрируют МСК .

Примечательно, что в системе xCELLigence даже в отсутствие хемоаттрактанта PDGF в нижней камере планшета скорость МСК, предварительно инкубированных с макрофагами, была выше, чем скорость контрольных клеток. При этом такую разницу в скорости миграции мы отмечали только в случае, когда мембрана, через которую мигрировали клетки, была покрыта фибронектином, но не коллагеном I типа .

Известно, что МСК и макрофаги могут секретировать PDGF-BB (Molgat, et al .

2009). Чтобы исключить аутокринные эффекты PDGF мы добавили клеткам блокирующие антитела к PDGF-BB. Как следует из приведенных данных, скорость клеток в присутствии блокирующих антител существенно не менялась. Таким образом, мы сделали вывод, что аутокринный PDGF-BB существенно не влиял на миграцию МСК .

Одной из основных функций МСК в репарации и регенерации является синтез и ремоделирование внеклеточного матрикса. Его состав, структура и жесткость во многом определяют характер миграции и дифференцировки других типов клеток .

Кроме того, внеклеточный матрикс удерживает факторы роста, которые высвобождаются в результате его протеолитического расщепления и оказывают хемотактический эффект на мигрирующие в зону повреждения клетки. Термин «гаптотаксис» - движение клеток по направлению градиента белка внеклеточного матрикса, был сформулирован еще в 60х годах 20 века. Было показано, что в некоторых системах гаптотаксис клеток может играть ключевую роль в миграции клеток. Так, в онтогенезе градиент фибронектина определяет миграцию мезодермальных клеток. Фибронектин также может стимулировать миграцию МСК взрослого организма (Thibault, et al. 2007). Мы обнаружили, что в МСК при сокультивировании с макрофагами снижается экспрессия гена фибронектина .

Поскольку обычно фибронектин в избытке присутствует в ране, создание локального дефицита этого компонента внеклеточного матрикса может являться важным механизмом для дальнейшего направленного движения клеток по градиенту его концентрации в зону повреждения. Такой механизм может иметь большое значение для поддержания направления миграции клеток, принимая во внимание тот факт, что основной хемоаттрактант МСК PDGF-BB в избытке диффундирует в область, прилежащую к ране, и не создает достаточного градиента. Считается, что клетки мезенхимного происхождения, в частности фибробласты, способны сами себе создавать локальный градиент PDGF-BB между лидирующим и отстающим краем за счет эндоцитоза (Schneider, et al. 2006), а высокие концентрации PDGF непосредственно в зоне повреждения приводят к переключению клеточного ответа с миграции на активную пролиферацию (De Donatis, et al. 2008). В таких условиях градиент фибронектина может определять эффективность миграции МСК в зону повреждения. Также мы обнаружили рост экспрессии гена ламинина в МСК после инкубации с макрофагами. Как было описано выше, само связывание с матриксом способно активировать и направлять миграцию клеток .

В настоящее время накоплен большой объем данных, указывающий на активацию рецепторов факторов роста при связывании клетки с белками внеклеточного матрикса через интегриновые рецепторы (Miyamoto, et al. 1996; Moro, et al. 1998; Wang, et al. 2001). При этом активируются внутриклеточные сигнальные каскады, регулирующие выживание, пролиферацию и миграцию клеток. Такой путь активации рецептора не требует непосредственного связывания его с лигандом – фактором роста (рисунок 36) (Smith, et al. 2010) .

Рисунок 36. Схема активации миграции МСК при свзывании с фибронектинов .

Адаптировано из Veevers-Lowe et al. (Veevers-Lowe, et al. 2011) .

Интегриновые комплексы состоят из двух субъединиц ( и ), разные комбинации которых отвечают за узнавание и связывание с определенными белками внеклеточного матрикса или межклеточные взаимодействия. Так, интегрин 51 связывается с фибронектином, а интегрин 31 – с фибронектином и ламинином. В частности, исследован путь активации рецептора PDGFR в МСК при связывании с фибронектином, причем установлено, что это взаимодействие опосредуется белком интегрином 51 и активирует PI3-киназу и Akt (Veevers-Lowe, et al. 2011) .

Чтобы определить возможную роль такого взаимодействия в нашей системе миграции, мы использовали ингибиторный анализ, который показал, что ингибирование аутофосфорилирования рецептора PDGFR (с помощью AG1296) или фосфорилирования PI3-киназы (с помощью LY294002) в МСК и в опыте и в контроле снижало скорость миграции клеток через фибронектин ниже базового уровня (скорость миграции контрольных клеток через фибронектин в отсутствие ингибиторов и хемоаттрактантов). Однако при ингибировании аутофосфорилирования PDGFR скорость миграции МСК оказалась выше, чем при ингибировании PI3-киназы. Фосфорилирование PI3-киназы происходит также при стимуляции рецепторов других факторов роста, таких как IGF-1, HGF, EGF, поэтому ингибирование PI3-киназы, вероятно, снимает также их эффект. Причем, при действии ингибиторов скорость стимулированных и контрольных клеток достоверно не отличалась. Эти данные позволили сделать вывод, что активация сигнализации рецептора PDGF при миграции МСК через фибронектин является ключевой при стимуляции движения клеток в такой системе .

Ранее в нашей лаборатории было показано, что рецептор PDGF выявляется практически на всех культивируемых МСК 2 пассажа (Kochegura, et al. 2011). Мы предположили, что инкубация клеток с макрофагами может увеличивать экспрессию рецептора PDGFR. RT-PCR анализ выявил значительный рост (в 25 раз) уровня мРНК рецептора, что также было подтверждено на уровне белка при помощи иммуноцитохимического исследования. Как упоминалось выше, интегрины, связываясь с матриксом, могут вызывать активацию сигнализации рецепторов факторов роста. Мы обнаружили, что при инкубации с макрофагами растет экспрессия генов цепей интегринов, ответственных за связывание клеточной мембраны с фибронектином и ламинином (3, 4, 5, 1). При помощи иммуноцитохимии было показано, что на мембране МСК увеличивается количество 1 интегрина (CD29). Таким образом, увеличение на мембране количества рецепторов PDGFR и его партнеров интегринов возможно является основной причиной стимуляции скорости миграции МСК, сокультивированных с макрофагами .

В результате связывания МСК с фибронектином и активации сигнализации рецептора PDGF запускается внутриклеточная сигнализация, одним из этапов которой является фосфорилирование Akt. Мы также показали, что уровень фосфорилированного Akt значительно выше в МСК, высаженных на пластик, покрытый фибронектином, по сравнению с контролем (непокрытый пластик). Мы обнаружили, что в МСК, сокультивированных с макрофагами, на пластике уровень фосфорилирования Akt снижается по сравнению с контрольными клетками, однако в случае, когда МСК после сокультивирования с макрофагами высаживали на пластик, покрытый фибронектином, количество активного (фосфорилированного) Akt повышалось также, как и в контрольных клетках. Из полученных данных следует, что связывание МСК с фибронектином в данной системе играет ключевую роль в поддержании миграторной активности МСК. Однако следует отметить, что миграция МСК в любом случае стимулируется воспалением (рисунок 37) .

Рисунок 37. На основании полученных данных была сформулирована гипотеза активации миграции МСК под влиянием растворимых факторов, вырабатываемых макрофагами .

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При регенерации тканей после повреждения развивающееся воспаление и в частности макрофаги вызывают приход мезенхимных клеток и их активацию .

Изменяется морфология МСК, они приобретают промиграторный фенотип, возрастает подвижность и скорость направленной миграции. Одновременно в первые двое суток происходит изменение профиля секреции и приобретении мезенхимными клетками провоспалительного фенотипа. Выявлено увеличение экспрессии МСК хемокинов, причем обнаружена разнонаправленная динамика экспрессии и секреции .

Известно, что МСК введенные при воспалении обладают иммуномодулирующим действием. Есть данные, что они могут стимулировать воспаление, подавляя рост опухоли, или напротив гасить воспаление, сдерживая реакцию «трансплантат против хозяина» .

На разработанной модели бесконтактного сокультивирования МСК и макрофагов впервые показно, как под действием факторов выделяемых макрофагами происходит переключение иммунофенотипа МСК. Обнаружено изменение секреции широкого спектра хемокинов, принимающих участие в регуляции воспаления и ответственных за привлечение резидентных стволовых клеток .

Помимо секреторной активности обнаружено изменение экспрессии хемокиновых рецепторов на поверхности самих МСК, что может отражать увеличение их чувствительности к хемокинам .

Механизмы, определяющие миграцию МСК в ходе регенерации ткани, включают в себя помимо действия градиентов факторов роста и хемокинов также взаимодействие с внеклеточным матриксом. Наше исследование показало, что воспалительные факторы, секретируемые макрофагами, способны модифицировать свойства МСК, активируя механизмы, ответственные за клеточную миграцию .

Полученные данные указывают, что макрофаги стимулируют миграцию МСК за счет PDGF зависимых механизмов как напрямую через увеличение экспрессии рецептора PDGF, так и опосредованно за счет увеличения взаимодействия интегринов с фибронектином .

Нарушение регенерации при системных изменениях сопровождается фиброзом или формированием трофической язвы. Поиск эндогенных механизмов с помощью которых можно регулировать ранозаживление представляется серьезной фундаментальной задачей и центральную роль в этом процессе, по-видимому, играют именно МСК .

Таким образом, в работе впервые исследованы ранние этапы активации миграции и секреторной активности МСК человека под действием макрофагов на модели развития воспаления Выявлено увеличение экспрессии in vitro .

мезенхимными клетками провоспалительных цитокинов и хемокинов и показана роль PDGF зависимых механизмов в стимуляции миграции МСК под действием факторов выделяемых макрофагами .

ВЫВОДЫ

1. Сокультивирование с макрофагами вызывает изменение фенотипа МСК на провоспалительный: увеличивается экспрессия генов и секреция провоспалительных факторов и хемокинов, а уровень экспрессии генов противовоспалительных цитокинов не изменяется .

2. При сокультивировании с макрофагами изменяется морфология МСК, увеличивается подвижность и скорость направленной миграции как по градиенту PDGF, так и в отсутствие хемоаттрактанта через фибронектин .

3. Скорость направленной миграции МСК увеличивается за счет роста уровня рецептора PDGFR и активации его сигнализации при связывании фибронектина интегринами клеточной мембраны .

4. Изменяется уровень экспрессии генов белков внеклеточного матрикса – количество мРНК коллагена I типа и фибронектина снижается, количество ламинина растет .

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АТФ – аденозинтрифосфат ВКМ – внеклеточный матрикс ГСК – гематопоэтическая стволовая клетка ГТФ - гуанозинтрифосфат ЖТ - жировая ткань ИФА - иммуноферментный анализ КМ - костный мозг ММП - матриксные металлопротеиназы МСК - мезенхимные стромальные клетки ЭБС - эмбриональная бычья сыворотка ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота ФМА – форболовый эфир Arp2/3 - actin-related proteins, родственные актину белки bFGF – basic fibroblast growth factor, основный фактор роста фибробластов, CCL, CCR – CC-chemokine ligand, лиганд СС-хемокина; CC-chemokine receptor;

рецептор CC-хемокина CD - сluster of differentiation, кластер дифференцировки CXCL, CXCR – CXC-chemokine ligand, лиганд СXС-хемокина; CXC-chemokine receptor; рецептор CXC-хемокина DAMP - damage associated molecular pattern molecules, молекулы, ассоциированные с повреждением DAPI - 4',6-diamidino-2-phenylindole, 4',6-диамидино-2-фенилиндол DMEM - Dulbecco's modified Eagle medium, среда Игла, модифицированная Дульбекко EGF - epidermal growth factor, эпидермальный фактор роста ELISA - enzyme-linked immunosorbent assay, иммуноферментный анализ ENA-78 - epithelial-derived neutrophil-activating peptide 78, пептид, активирующий нейтрофилы, выделенный из эпителия FAK – focal adhesion kinase, киназа фокальных контактов Erk - extracellular signal-regulated kinases, киназы, регулируемые внеклеточными сигналами GAPDH - glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа factor, гранулоцитарный GM-CSF - granulocyte-macrophage colony-stimulating макрофагальный колониестимулирующий фактор

– гранулоцитарный G-CSF granulocyte colony-stimulating factor, колониестимулирующий фактор GPCR – g-protein coupled receptors, рецепторы, связанные с g-белками GRO - growth regulated oncogene-alpha, онкоген альфа, регулирующий рост GVHD – graft-versus-host disease, реакция «трансплантат против хозяина»

HLA-DR – human leukocyte antigen – antigen D related, человеческий лейкоцитарный антиген HGF - hepatocyte growth factor, фактор роста гепатоцитов HUVEC - Human Umbilical Vein Endothelial Cells, эндотелиоциты пуповинной крови человека ICAM-1 - inter-cellular adhesion molecule-1, молекула межклеточной адгезии IDO – indolamin-2,3-oxygenase, индоламин-2,3-оксигеназа Ig – immunoglobulin, иммуноглобулин IGF-1 - insulin-like growth factor 1, инсулиноподобный фактор роста 1 INF – interferon, интерферон iNOS – inducible nitric oxide synthase, индуцируемая ситаза оксида азота IP-10 – interferon gamma induced protein 10, белок, индуцируемый интерфероном гамма 10 iTAC - interferon-inducible T-cell alpha chemoattractant, хемоаттрактант Т-клеток, индуцируемый интерфероном IL – interleukin, интерлейкин JAK - janus kinase, янус киназа фосфорилирующая фрагмент JNK - jun N-terminal kinase, N-концевой транскрипционного фактора c-Jun LIF, LIFR - leukemia inhibitory factor, leukemia inhibitory factor receptor; подавляющий лейкемию фактор, рецептор фактора, подавляющего лейкемию LPS – lipopolysaccharides, липополисахариды MAPK - mitogen-activated protein kinase, киназа, активируемая митогенами

– макрофагальный M-CSF macrophage colony-stimulating factor, колониестимулирующий фактор MCP – monocyte chemoattractant protein, хемоаттрактивный белок моноцитов MIG - monokine induced by gamma interferon, монокин, индуцируемый интерфероном гамма MIP - macrophage inflammatory protein, воспалительный белок макрофагов MMP – matrix metalloproteinase, матриксная металлопротеиназа MSC – mesenchymal stromal cells, мезенхимные стромальные клетки MSCA-1 – mesenchymal stem cell antigen 1, антиген мезенхимных стволовых клеток 1 MSC-Mo – MSC-educated macrophages, макрофаги, «обученные» МСК NFB - nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells, ядерный фактор «каппа-би»

NG2 - neuron-glial antigen 2, антиген нейронов и глиальных клеток 2 NGF - nerve growth factor, фактор роста нервов NIH – National Institute of Health PAI-1 - plasminogen activators inhibitor-1, ингибитор активаторов плазминогена PAMP - pathogen-associated molecular patterns, молекулы, ассоциированные с патогенами PDGF, PDGFR - platelet-derived growth factor, platelet-derived growth factor Receptor, фактор роста, выделенный из тромбоцитов, рецептор фактора роста, выделенного из тромбоцитов PGE2 – prostaglandin E2, простагландин Е2 PI3K - phosphoinositide 3-kinase, фосфоинозитол-3-киназа PIGF – placenta growth factor, плацентарный фактор роста PLC- - phospholipase C-, фосфолипаза СRANTES - Regulated upon Activation, Normal T-cell Expressed, and Secreted; белок, регулирующий активацию T-клеток Ras - RAt Sarcoma, Rat-саркома RPMI 1640 - Roswell Park Memorial Institute medium, культуральная среда Мемориального института Росвелл парк SCF – stem cell factor, фактор стволовых клеток SDF-1 – srtomal derived factor 1, стромальный фактор 1 SH-2 - Src Homology 2, домен 2, гомологичный Src STAT - signal transducers and activators of transcription, активаторы транскрипции и проводники сигнала TNF – tumor necrosis factor, фактор некроза опухоли альфа TGF-, TGF- - Transforming growth factor-, -, трансформирующий фактор роста Th1 – T-helpers, type 1, Т-хэлперы первого типа THP-1 - the human promyelomonocytic cell line 1, линия промиелоцитарных клеток человека 1 THY1 – thymocite antigen 1, антиген тимоцитов 1 TLR – toll-like receptor, toll-подобный рецептор trkA, B, C - tropomyosin-receptor-kinase A, B, C, киназа рецептора тропомиозина A, B, C uPA - urokinase plasminogen activator, урокиназный активатор плазминогена uPAR - urokinase plasminogen activator receptor, рецептор урокиназного активатора плазминогена VCAM-1 - Vascular cell adhesion protein-1, молекула адгезии клеток сосудов VEGF - Vascular endothelial growth factor, фактор роста эндотелия сосудов WNT - Wingless-related integration site, сайт интеграции, связанный с бескрылостью

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Онищенко Г.Е. Центриолярный и центросомный цикл при дифференцировке и патологии / Онищенко Г.Е. — Москва : Москва, 1993. — С. 257 .

2. Abbott J.D., Huang Y., Liu D., Hickey R., Krause D.S., Giordano F.J. Stromal cell– derived factor-1 plays a critical role in stem ell recruitment to the heart after myocardial infarction but is not sufficient to induce homing in the absence of injury // Circulation. 2004. Т. 110. №21. – С. 3300-3305 .

3. Akiyama K., Chen C., Wang D., Xu X., Qu C., Yamaza T., Cai T., Chen W., Sun L., Shi S. Mesenchymal-stem-cell-induced immunoregulation involves FAS-ligand-/FASmediated T Cell apoptosis // Cell Stem Cell. 2012. Т. 10. №5. – С. 544-555 .

4. Alexandrova A.Y., Arnold K., Schaub S., Vasiliev J.M., Meister J.J., Bershadsky A.D.,

Verkhovsky A.B. Comparative dynamics of retrograde actin flow and focal adhesions:

formation of nascent adhesions triggers transition from fast to slow flow // PLoS One .

2008. №1932-6203 (Electronic) .

5. Alvarez-Dolado M., Pardal R., Garcia-Verdugo J.M., Fike J.R., Lee H.O., Pfeffer K., Lois C., Morrison S.J., Alvarez-Buylla A. Fusion of bone-marrow-derived cells with Purkinje neurons, cardiomyocytes and hepatocytes // Nature. 2003. Т. 425. №6961. – С .

968-973 .

6. Andres P.G., Beck P.L., Mizoguchi E., Mizoguchi A., Bhan A.K., Dawson T., Kuziel W.A., Maeda N., MacDermott R.P., Podolsky D.K., Reinecker H.-C. Mice with a selective deletion of the CC chemokine receptors 5 or 2 are protected from d extran sodium sulfate-mediated colitis: lack of CC chemokine receptor 5 expression results in a NK1.1+ lymphocyte-associated Th2-type immune response in the intestine // The Journal of Immunology. 2000. Т. 164. №12. – С. 6303-6312 .

7. Antebi B., Zhang Z., Wang Y., Lu Z., Chen X.D., Ling J. Stromal-cell-derived extracellular matrix promotes the proliferation and retains the osteogenic differentiation capacity of mesenchymal stem cells on three-dimensional scaffolds // Tissue Eng Part C Methods. 2015. Т. 21. №2. – С. 171-181 .

8. Anton K., Banerjee D., Glod J. Macrophage-associated mesenchymal stem cells assume an activated, migratory, pro-inflammatory phenotype with increased IL-6 and CXCL10 secretion // PLoS One. 2012. Т. 7. №4. – С. e35036 .

9. Asai A., Nakamura K., Kobayashi M., Herndon D.N., Suzuki F. CCL1 released from M2b macrophages is essentially required for the maintenance of their properties // Journal of Leukocyte Biology. 2012. Т. 92. №4. – С. 859-867 .

10. Asari S., Itakura S., Ferreri K., Liu C.-P., Kuroda Y., Kandeel F., Mullen Y .

Mesenchymal stem cells suppress B-cell terminal differentiation // Experimental Hematology. 2009. Т. 37. №5. – С. 604-615 .

11. Ashcroft G.S., Yang X., Glick A.B., Weinstein M., Letterio J.J., Mizel D.E., Anzano M., Greenwell-Wild T., Wahl S.M., Deng C., Roberts A.B. Mice lacking Smad3 show accelerated wound healing and an impaired local inflammatory response // Nat Cell Biol .

1999. Т. 1. №5. – С. 260-266 .

12. Askari A.T., Unzek S., Popovic Z.B., Goldman C.K., Forudi F., Kiedrowski M., Rovner A., Ellis S.G., Thomas J.D., DiCorleto P.E., Topol E.J., Penn M.S. Effect of stromal-cell-derived factor 1 on stem-cell homing and tissue regeneration in ischaemic cardiomyopathy // The Lancet. 2003. Т. 362. №9385. – С. 697-703 .

13. Aubin J.E., Osborn M., Franke W.W., Weber K. Intermediate filaments of the vimentin-type and the cytokeratin-type are distributed differently during mitosis // Experimental Cell Research. 1980. Т. 129. №1. – С. 149-165 .

14. Auwerx J. The human leukemia cell line, THP-1: a multifacetted model for the study of monocyte-macrophage differentiation // Experientia. 1991. Т. 47. №1. – С. 22-31 .

15. Bacou F., el Andalousi R.B., Daussin P.A., Micallef J.P., Levin J.M., Chammas M., Casteilla L., Reyne Y., Nougues J. Transplantation of adipose tissue-derived stromal cells increases mass and functional capacity of damaged skeletal muscle // Cell Transplant. .

2004. Т. 13(2). №0963-6897. – С. 103-111 .

16. Baggiolini M., Walz A., Kunkel S.L. Neutrophil-activating peptide-1/interleukin 8, a novel cytokine that activates neutrophils // J Clin Invest. 1989. Т. 84. №4. – С. 1045Barminko J., Kim J.H., Otsuka S., Gray A., Schloss R., Grumet M., Yarmush M.L .

Encapsulated mesenchymal stromal cells for in vivo transplantation // Biotechnology and Bioengineering. 2011. Т. 108. №11. – С. 2747-2758 .

18. Barna B.P., Pettay J., Barnett G.H., Zhou P., Iwasaki K., Estes M.L. Regulation of monocyte chemoattractant protein-1 expression in adult human nonneoplastic astrocytes is sensitive to tumor-necrosis-factor (TNF) or antibody to the 55-kda TNF receptor // Journal of Neuroimmunology. 1994. Т. 50. №1. – С. 101-107 .

19. Battula V.L., Treml S., Bareiss P.M., Gieseke F., Roelofs H., de Zwart P., Mller I., Schewe B., Skutella T., Fibbe W.E., Kanz L., Bhring H.-J. Isolation of functionally distinct mesenchymal stem cell subsets using antibodies against CD56, CD271, and mesenchymal stem cell antigen-1 // Haematologica. 2009. Т. 94. №2. – С. 173-184 .

20. Benvenuto F., Ferrari S., Gerdoni E., Gualandi F., Frassoni F., Pistoia V., Mancardi G., Uccelli A. Human mesenchymal stem cells promote survival of T cells in a quiescent state // Stem Cells. 2007. Т. 25. №7. – С. 1753-1760 .

21. Bershadsky A.D., Ballestrem C., Carramusa L., Zilberman Y., Gilquin B., Khochbin S., Alexandrova A.Y., Verkhovsky A.B., Shemesh T., Kozlov M.M. Assembly and mechanosensory function of focal adhesions: experiments and models // Eur J Cell Biol .

2006. Т. 85. №3-4. – С. 165-173 .

22. Bigildeev A.E., Zezina E.A., Shipounova I.N., Drize N.J. Interleukin-1 beta enhances human multipotent mesenchymal stromal cell proliferative potential and their ability to maintain hematopoietic precursor cells // Cytokine. 2015. Т. 71. №2. – С. 246-254 .

23. Boomsma R.A., Geenen D.L. Mesenchymal stem cells secrete multiple cytokines that promote angiogenesis and have contrasting effects on chemotaxis and apoptosis // PLoS One. 2012. Т. 7. №4. – С. e35685 .

24. Brancato S.K., Albina J.E. Wound macrophages as key regulators of repair: origin, phenotype, and function // The American Journal of Pathology. 2011. Т. 178. №1. – С .

19-25 .

25. Brooke G., Cook M., Blair C., Han R., Heazlewood C., Jones B., Kambouris M., Kollar K., McTaggart S., Pelekanos R. Therapeutic applications of mesenchymal stromal cells // Semin Cell Dev Biol. 2007. Т. 18. №6. – С. 846-858 .

26. Brooke G., Tong H., Levesque J.P., Atkinson K. Molecular trafficking mechanisms of multipotent mesenchymal stem cells derived from human bone marrow and placenta // Stem Cells Dev. 2008. Т. 17. №5. – С. 929-940 .

27. Brown B.N., Ratner B.D., Goodman S.B., Amar S., Badylak S.F. Macrophage polarization: An opportunity for improved outcomes in biomaterials and regenerative medicine // Biomaterials. 2012. Т. 33. №15. – С. 3792-3802 .

28. Cai Q., Lanting L., Natarajan R. Interaction of monocytes with vascular smooth muscle cells regulates monocyte survival and differentiation through distinct pathways // Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004. Т. 24. №12. – С. 2263-2270 .

29. Cantley L.C. The phosphoinositide 3-kinase pathway // Science. 2002. Т. 296 .

№5573. – С. 1655-1657 .

30. Cao J., Wang L., Du Z.-j., Liu P., Zhang Y.-b., Sui J.-f., Liu Y.-p., Lei D.-l .

Recruitment of exogenous mesenchymal stem cells in mandibular distraction osteogenesis by the stromal cell-derived factor-1/chemokine receptor-4 pathway in rats // British Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 2013. Т. 51. №8. – С. 937-941 .

31. Caplan A.I. Mesenchymal stem cells // J Orthop Res. 1991. Т. 9(5). №0736-0266 (Print). – С. 641-650 .

32. Carlson K.B., Singh P., Feaster M.M., Ramnarain A., Pavlides C., Chen Z.L., Yu W.M., Feltri M.L., Strickland S. Mesenchymal stem cells facilitate axon sorting, myelination, and functional recovery in paralyzed mice deficient in Schwann cell-derived laminin // Glia. 2011. Т. 59. №2. – С. 267-277 .

33. Carrion F.A., Figueroa F.E. Mesenchymal stem cells for the treatment of systemic lupus erythematosus: is the cure for connective tissue diseases within connective tissue?

// Stem Cell Res Ther. 2011. Т. 2. №3. – С. 23 .

34. Chabannes D., Hill M., Merieau E., Rossignol J., Brion R., Soulillou J.P., Anegon I., Cuturi M.C. A role for heme oxygenase-1 in the immunosuppressive effect of adult rat and human mesenchymal stem cells // Blood. 2007. Т. 110. №10. – С. 3691-3694 .

35. Chan R.W.S., Schwab K.E., Gargett C.E. Clonogenicity of Human Endometrial Epithelial and Stromal Cells // Biology of Reproduction. 2004. Т. 70. №6. – С. 1738Chen P.-M., Yen M.-L., Liu K.-J., Sytwu H.-K., Yen B.L. Immunomodulatory properties of human adult and fetal multipotent mesenchymal stem cells // Journal of Biomedical Science. 2011. Т. 18. №1. – С. 49 .

37. Clark-Lewis I., Mattioli I., Gong J.-H., Loetscher P. Structure-Function Relationship between the Human Chemokine Receptor CXCR3 and Its Ligands // Journal of Biological Chemistry. 2003. Т. 278. №1. – С. 289-295 .

38. Cole K.E., Strick C.A., Paradis T.J., Ogborne K.T., Loetscher M., Gladue R.P., Lin W., Boyd J.G., Moser B., Wood D.E., Sahagan B.G., Neote K. Interferon–inducible T cell alpha chemoattractant (I-TAC): a novel non-ELR CXC chemokine with potent activity on activated T cells through selective high affinity binding to CXCR3 // The Journal of Experimental Medicine. 1998. Т. 187. №12. – С. 2009-2021 .

39. Colvin R.A., Campanella G.S.V., Sun J., Luster A.D. Intracellular domains of CXCR3 that mediate CXCL9, CXCL10, and CXCL11 function // Journal of Biological Chemistry .

2004. Т. 279. №29. – С. 30219-30227 .

40. Combadiere C., Ahuja S.K., Van Damme J., Tiffany H.L., Gao J.-L., Murphy P.M .

Monocyte chemoattractant protein-3 is a functional ligand for CC chemokine receptors 1 and 2B // Journal of Biological Chemistry. 1995. Т. 270. №50. – С. 29671-29675 .

41. Crop M.J., Baan C.C., Korevaar S.S., Ijzermans J.N., Pescatori M., Stubbs A.P., van Ijcken W.F., Dahlke M.H., Eggenhofer E., Weimar W., Hoogduijn M.J. Inflammatory conditions affect gene expression and function of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells // Clin Exp Immunol. 2010. Т. 162. – С. 474-486 .

42. Cushing S.D., Berliner J.A., Valente A.J., Territo M.C., Navab M., Parhami F., Gerrity R., Schwartz C.J., Fogelman A.M. Minimally modified low density lipoprotein induces monocyte chemotactic protein 1 in human endothelial cells and smooth muscle cells // Proc Natl Acad Sci U S A. 1990. Т. 87. №13. – С. 5134-5138 .

43. Cutler A.J., Limbani V., Girdlestone J., Navarrete C.V. Umbilical cord-derived mesenchymal stromal cells modulate monocyte function to suppress T cell proliferation // The Journal of Immunology. 2010. Т. 185. №11. – С. 6617-6623 .

44. De Bari C., Dell'Accio F., Tylzanowski P., Luyten F.P. Multipotent mesenchymal stem cells from adult human synovial membrane // Arthritis & Rheumatism. 2001. Т. 44 .

№8. – С. 1928-1942 .

45. De Donatis A., Comito G., Buricchi F., Vinci M.C., Parenti A., Caselli A., Camici G., Manao G., Ramponi G., Cirri P. Proliferation versus migration in platelet-derived growth factor signaling: the key role of endocytosis // Journal of Biological Chemistry. 2008. Т .

283. №29. – С. 19948-19956 .

46. DiPietro L.A., Burdick M., Low Q.E., Kunkel S.L., Strieter R.M. MIP-1alpha as a critical macrophage chemoattractant in murine wound repair // J Clin Invest. 1998. Т .

101. №8. – С. 1693-1698 .

47. Djouad F., Charbonnier L.-M., Bouffi C., Louis-Plence P., Bony C., Apparailly F., Cantos C., Jorgensen C., Nol D. Mesenchymal stem cells inhibit the differentiation of dendritic cells through an interleukin-6-dependent mechanism // Stem Cells. 2007. Т. 25 .

№8. – С. 2025-2032 .

48. Dominici M., Le Blanc K., Mueller I., Slaper-Cortenbach I., Marini F., Krause D., Deans R., Keating A., Prockop D., Horwitz E. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement // Cytotherapy. 2006. Т. 8. №4. – С. 315-317 .

49. Dwyer R.M., Potter-Beirne S.M., Harrington K.A., Lowery A.J., Hennessy E., Murphy J.M., Barry F.P., O'Brien T., Kerin M.J. Monocyte chemotactic protein-1 secreted by primary breast tumors stimulates migration of mesenchymal stem cells // Clinical Cancer Research. 2007. Т. 13. №17. – С. 5020-5027 .

50. Eggenhofer E., Hoogduijn M. Mesenchymal stem cell-educated macrophages // Transplantation Research. 2012. Т. 1. №1. – С. 12 .

51. English K., Ryan J.M., Tobin L., Murphy M.J., Barry F.P., Mahon B.P. Cell contact, prostaglandin E2 and transforming growth factor beta 1 play non-redundant roles in human mesenchymal stem cell induction of CD4+CD25Highforkhead box P3+ regulatory T cells // Clinical & Experimental Immunology. 2009. Т. 156. №1. – С. 149Erices A., Conget P., Minguell J.J. Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood // Br J Haematol. 2000. Т. 109. №1. – С. 235-242 .

53. Fang B., Song Y., Zhao R.C., Han Q., Lin Q. Using human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells as salvage therapy for hepatic graft-versus-host disease resembling acute hepatitis // Transplantation Proceedings. 2007. Т. 39. №5. – С. 1710Freidenstein A.J., Petrakova K.V., Kurolesova A.I., Frolova G.P. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues. // Transplantation. 1968. Т. 6. №2. – С. 230-247 .

55. Friedenstein A.J., Piatetzky-Shapiro I.I., Petrakova K.V. Osteogenesis in transplants of bone marrow cells // Journal of Embryology and Experimental Morphology. 1966. Т .

16. №3. – С. 381-390 .

56. Friedl P., Zallen J.A. Dynamics of cell-cell and cell-matrix interactions in morphogenesis, regeneration and cancer // Curr Opin Cell Biol. 2010. Т. 22. №5. – С .

557-559 .

57. Friedland J.C., Lee M.H., Boettiger D. Mechanically activated integrin switch controls alpha5beta1 function // Science. 2009. Т. 323. №5914. – С. 642-644 .

58. Fuentes M.E., Durham S.K., Swerdel M.R., Lewin A.C., Barton D.S., Megill J.R., Bravo R., Lira S.A. Controlled recruitment of monocytes and macrophages to specific organs through transgenic expression of monocyte chemoattractant protein-1 // The Journal of Immunology. 1995. Т. 155. №12. – С. 5769-5776 .

59. Gao F., Wu D.-Q., Hu Y.-H., Jin G.-X., Li G.-D., Sun T.-W., Li F.-J. In vitro cultivation of islet-like cell clusters from human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells // Translational Research. 2008. Т. 151. №6. – С. 293-302 .

60. Garg A., Houlihan D.D., Aldridge V., Suresh S., Li K.K., King A.L., Sutaria R., Fear J., Bhogal R.H., Lalor P.F., Newsome P.N. Non-enzymatic dissociation of human mesenchymal stromal cells improves chemokine-dependent migration and maintains immunosuppressive function // Cytotherapy. 2014. Т. 16. №4. – С. 545-559 .

61. Ghadge S.K., Mhlstedt S., zcelik C., Bader M. SDF-1 as a therapeutic stem cell homing factor in myocardial infarction // Pharmacology & Therapeutics. 2011. Т. 129 .

№1. – С. 97-108 .

62. Ghannam S., Bouffi C., Djouad F., Jorgensen C., Noel D. Immunosuppression by mesenchymal stem cells: mechanisms and clinical applications // Stem Cell Research & Therapy. 2010. Т. 1. №1. – С. 2 .

63. Gimble J.M., Katz A.J., Bunnell B.A. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine // Circulation Research. 2007. Т. 100. №9. – С. 1249-1260 .

64. Gleichmann M., Gillen C., Czardybon M., Bosse F., Greiner-Petter R., Auer J., Muller H.W. Cloning and characterization of SDF-1gamma, a novel SDF-1 chemokine transcript with developmentally regulated expression in the nervous system // European Journal of Neuroscience. 2000. Т. 12. №6. – С. 1857-1866 .

65. Gonzlez M.A., Gonzalez–Rey E., Rico L., Bscher D., Delgado M. Adipose-derived mesenchymal stem cells alleviate experimental colitis by inhibiting inflammatory and autoimmune responses // Gastroenterology. 2009. Т. 136. №3. – С. 978-989 .

66. Gordon M.K., Hahn R.A. Collagens // Cell Tissue Res. 2010. Т. 339. №1. – С. 247Gordon S. Alternative activation of macrophages // Nat Rev Immunol. 2003. Т. 3 .

№1. – С. 23-35 .

68. Goren I., Allmann N., Yogev N., Schrmann C., Linke A., Holdener M., Waisman A., Pfeilschifter J., Frank S. A transgenic mouse model of inducible macrophage depletion: effects of diphtheria toxin-driven lysozyme m-specific cell lineage ablation on wound inflammatory, angiogenic, and contractive processes // The American Journal of Pathology. 2009. Т. 175. №1. – С. 132-147 .

69. Gregory H., Young J., Schrder J.-M., Mrowietz U., Christophers E. Structure determination of a human lymphocyte derived neutrophil activating peptide (LYNAP) // Biochemical and Biophysical Research Communications. 1988. Т. 151. №2. – С. 883Gronthos S., Mankani M., Brahim J., Robey P.G., Shi S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2000. Т. 97. №25. – С. 13625-13630 .

71. Gunn M.D., Nelken N.A., Liao X., Williams L.T. Monocyte chemoattractant proteinis sufficient for the chemotaxis of monocytes and lymphocytes in transgenic mice but requires an additional stimulus for inflammatory activation // The Journal of Immunology. 1997. Т. 158. №1. – С. 376-383 .

72. Hao L., Wang J.C., Zou Z.M., Yan G., Dong S., Deng J., Ran X., Feng Y., Luo C., Wang Y., Cheng T. Transplantation of BMSCs expressing hPDGF-A/hBD2 promotes wound healing in rats with combined radiation-wound injury // Gene Therapy. 2009. Т .

16 №1. – С. 34-42 .

73. Haque N.S., Fallon J.T., Pan J.J., Taubman M.B., Harpel P.C. Chemokine receptor– 8 (CCR8) mediates human vascular smooth muscle cell chemotaxis and metalloproteinase-2 secretion // Blood. 2004. Т. 103. №4. – С. 1296-1304 .

74. Harpel P.C., Haque N.S. Chemokine receptor-8: potential role in atherogenesis // Isr Med Assoc J. 2002. №1565-1088 (Print) .

75. Hatzistergos K.E., Quevedo H., Oskouei B.N., Hu Q., Feigenbaum G.S., Margitich I.S., Mazhari R., Boyle A.J., Zambrano J.P., Rodriguez J.E., Dulce R., Pattany P.M., Valdes D., Revilla C., Heldman A.W., McNiece I., Hare J.M. Bone marrow mesenchymal stem cells stimulate cardiac stem cell proliferation and differentiation // Circ Res. 2010 .

Т. 107. №7. – С. 913-922 .

76. Heissig B., Dhahri D., Eiamboonsert S., Salama Y., Shimazu H., Munakata S., Hattori K. Role of mesenchymal stem cell-derived fibrinolytic factor in tissue regeneration and cancer progression // Cell Mol Life Sci. 2015. Т. 72. №24. – С. 4759-4770 .

77. Hoffmann E., Dittrich-Breiholz O., Holtmann H., Kracht M. Multiple control of interleukin-8 gene expression // Journal of Leukocyte Biology. 2002. Т. 72. №5. – С .

847-855 .

78. Hofstetter C.P., Schwarz E.J., Hess D., Widenfalk J., El Manira A., Prockop D.J., Olson L. Marrow stromal cells form guiding strands in the injured spinal cord and promote recovery // Proc Natl Acad Sci U S A. 2002. Т. 99. №4. – С. 2199-2204 .

79. Horwitz E.F., Dominici M. How do mesenchymal stromal cells exert their therapeutic benefit? // Cytotherapy. 2008. Т. 10. №8. – С. 771-774 .

80. Horwitz E.M., Gordon P.L., Koo W.K.K., Marx J.C., Neel M.D., McNall R.Y., Muul L., Hofmann T. Isolated allogeneic bone marrow-derived mesenchymal cells engraft and stimulate growth in children with osteogenesis imperfecta: Implications for cell therapy of bone // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2002. Т. 99. №13. – С .

8932-8937 .

81. Horwitz E.M., Maziarz R.T., Kebriaei P. MSCs in hematopoietic cell transplantation // Biology of Blood and Marrow Transplantation. 2011. Т. 17. №1. – С. S21-S29 .

82. Horwitz E.M., Prockop D.J., Fitzpatrick L.A., Koo W.W.K., Gordon P.L., Neel M., Sussman M., Orchard P., Marx J.C., Pyeritz R.E., Brenner M.K. Transplantability and therapeutic effects of bone marrow-derived mesenchymal cells in children with osteogenesis imperfecta // Nat Med. 1999. Т. 5. №3. – С. 309-313 .

83. Hou Y., Ryu C.H., Jun J.A., Kim S.M., Jeong C.H., Jeun S.S. IL-8 enhances the angiogenic potential of human bone marrow mesenchymal stem cells by increasing vascular endothelial growth factor // Cell Biol Int. 2014 .

84. Hu C., Yong X., Li C., L M., Liu D., Chen L., Hu J., Teng M., Zhang D., Fan Y., Liang G. CXCL12/CXCR4 axis promotes mesenchymal stem cell mobilization to burn wounds and contributes to wound repair // Journal of Surgical Research. 2013. Т. 183 .

№1. – С. 427-434 .

85. Huang J., Zhang Z., Guo J., Ni A., Deb A., Zhang L., Mirotsou M., Pratt R.E., Dzau V.J. Genetic modification of mesenchymal stem cells overexpressing CCR1 increases cell viability, migration, engraftment, and capillary density in the injured myocardium // Circulation Research. 2010. Т. 106. №11. – С. 1753-1762 .

86. Hubert T., Perdu S., Vandekerckhove J., Gettemans J. gamma-Tubulin localizes at actin-based membrane protrusions and inhibits formation of stress-fibers // Biochem Biophys Res Commun. 2011. Т. 408. №2. – С. 248-252 .

87. Hung S.C., Pochampally R.R., Chen S.C., Hsu S.C., Prockop D.J. Angiogenic effects of human multipotent stromal cell conditioned medium activate the PI3K-Akt pathway in hypoxic endothelial cells to inhibit apoptosis, increase survival, and stimulate angiogenesis // Stem Cells. 2007. Т. 25. №9. – С. 2363-2370 .

88. Hynes R.O. The extracellular matrix: not just pretty fibrils // Science. 2009. Т. 326 .

№5957. – С. 1216-1219 .

89. In 't Anker P.S., Scherjon S.A., Kleijburg-van der Keur C., de Groot-Swings G.M., Claas F.H., Fibbe W.E., Kanhai H.H. Isolation of mesenchymal stem cells of fetal or maternal origin from human placenta // Stem Cells. 2004. Т. 22. №7. – С. 1338-1345 .

90. In 't Anker P.S., Scherjon S.A., Kleijburg-van der Keur C., Noort W.A., Claas F.H., Willemze R., Fibbe W.E., Kanhai H.H. Amniotic fluid as a novel source of mesenchymal stem cells for therapeutic transplantation // Blood. 2003. Т. 102. №4. – С. 1548-1549 .

91. Izadpanah R., Trygg C., Patel B., Kriedt C., Dufour J., Gimble J.M., Bunnell B.A .

Biologic properties of mesenchymal stem cells derived from bone marrow and adipose tissue // Journal of Cellular Biochemistry. 2006. Т. 99. №5. – С. 1285-1297 .

92. Croitoru-Lamoury J., Lamoury F.M., Zaunders J.J., Veas L.A., Brew B.J. Human mesenchymal stem cells constitutively express chemokines and chemokine receptors that can be upregulated by cytokines, IFN-beta, and Copaxone // J Interferon Cytokine Res .

2007. №1079-9907 (Print) .

93. Jaganathan B.G., Ruester B., Dressel L., Stein S., Grez M., Seifried E., Henschler R .

Rho inhibition induces migration of mesenchymal stromal cells // Stem Cells. 2007. Т .

25. №8. – С. 1966-1974 .

94. Jiang X.-X., Zhang Y., Liu B., Zhang S.-X., Wu Y., Yu X.-D., Mao N. Human mesenchymal stem cells inhibit differentiation and function of monocyte-derived dendritic cells // Blood. 2005. Т. 105. №10. – С. 4120-4126 .

95. Jones D.L., Rando T.A. Emerging models and paradigms for stem cell ageing // Nat Cell Biol. 2011. Т. 13. №5. – С. 506-512 .

96. Kalinina N., Kharlampieva D., Loguinova M., Butenko I., Pobeguts O., Efimenko A., Ageeva L., Sharonov G., Ischenko D., Alekseev D., Grigorieva O., Sysoeva V., Rubina K., Lazarev V., Govorun V. Characterization of secretomes provides evidence for adipose-derived mesenchymal stromal cells subtypes // Stem Cell Research & Therapy .

2015. Т. 6. – С. 221 .

97. Kalinina N.I., Sysoeva V.Y., Rubina K.A., Parfenova Y.V., Tkachuk V.A .

Mesenchymal stem cells in tissue growth and repair // Acta Naturae. 2011. Т. 3. №4. – С .

30-37 .

98. Kalluri R. EMT: When epithelial cells decide to become mesenchymal-like cells // The Journal of Clinical Investigation. 2009. Т. 119. №6. – С. 1417-1419 .

99. Kang J.-W., Park Y.S., Lee D.H., Kim J.-h., Kim M.S., Bak Y., Hong J., Yoon D.-Y .

Intracellular interaction of interleukin (IL)-32 with protein kinase C (PKC) and STAT3 protein augments IL-6 production in THP-1 promonocytic cells // Journal of Biological Chemistry. 2012. Т. 287. №42. – С. 35556-35564 .

100. Kaplanski G., Marin V., Fabrigoule M., Boulay V., Benoliel A.M., Bongrand P., Kaplanski S., Farnarier C. Thrombin-activated human endothelial cells support monocyte adhesion in vitro following expression of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1;

CD54) and vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1; CD106) // Blood. 1998. Т. 92 .

№4. – С. 1259-1267 .

101. Kim J., Hematti P. Mesenchymal stem cell–educated macrophages: A novel type of alternatively activated macrophages // Experimental Hematology. 2009. Т. 37. №12. – С .

1445-1453 .

102. Kim W.-S., Park B.-S., Park S.-H., Kim H.-K., Sung J.-H. Antiwrinkle effect of adipose-derived stem cell: Activation of dermal fibroblast by secretory factors // Journal of Dermatological Science. 2009. Т. 53. №2. – С. 96-102 .

103. Kimura K., Nagano M., Salazar G., Yamashita T., Tsuboi I., Mishima H., Matsushita S., Sato F., Yamagata K., Ohneda O. The role of CCL5 in the ability of adipose tissuederived mesenchymal stem cells to support repair of ischemic regions // Stem Cells Dev .

2014. Т. 23. №5. – С. 488-501 .

104. Kinnaird T., Stabile E., Burnett M.S., Epstein S.E. Bone-marrow-derived cells for enhancing collateral development: mechanisms, animal data, and initial clinical experiences // Circ Res. 2004. Т. 95. №4. – С. 354-363 .

105. Ko I.K., Kim B.S. Mesenchymal stem cells for treatment of myocardial infarction // Int J Stem Cells. 2008. Т. 1. №1. – С. 49-54 .

106. Ko O.N., Gerson S.L., Cooper B.W., Dyhouse S.M., Haynesworth S.E., Caplan A.I., Lazarus H.M. Rapid hematopoietic recovery after coinfusion of autologous-blood stem cells and culture-expanded marrow mesenchymal stem cells in advanced breast cancer patients receiving high-dose chemotherapy // Journal of Clinical Oncology. 2000 .

Т. 18. №2. – С. 307-307 .

107. Kochegura T.N., Sharonov G.V., Sysoeva V.Y., Olenev A.S., Parfyonova Y.V., Tkachuk V.A. The effect of low-density lipoproteins on mesenchymal stromal cells of adipose tissue // Doklady Biological Sciences. 2011. Т. 441. №1. – С. 363-366 .

108. Kohidai L., Csaba G. Chemotaxis and chemotactic selection induced with cytokines (IL-8, RANTES and TNF-alpha) in the unicellular Tetrahymena pyriformis // Cytokine .

1998. Т. 10. №7. – С. 481-486 .

109. Krampera M., Cosmi L., Angeli R., Pasini A., Liotta F., Andreini A., Santarlasci V., Mazzinghi B., Pizzolo G., Vinante F., Romagnani P., Maggi E., Romagnani S., Annunziato F. Role for interferon- in the immunomodulatory activity of human bone marrow mesenchymal stem cells // Stem Cells. 2006. Т. 24. №2. – С. 386-398 .

110. Kucerova L., Altanerova V., Matuskova M., Tyciakova S., Altaner C. Adipose tissue–derived human mesenchymal stem cells mediated prodrug cancer gene therapy // Cancer Research. 2007. Т. 67. №13. – С. 6304-6313 .

111. Kurihara T., Warr G., Loy J., Bravo R. Defects in macrophage recruitment and host defense in mice lacking the CCR2 chemokine receptor // Journal of Experimental Medicine. 1997. Т. 186. №10. – С. 1757-1762 .

112. Lauffenburger D.A., Horwitz A.F. Cell migration: a physically integrated molecular process // Cell. 1996. Т. 84. №3. – С. 359-369 .

113. Lazarus H.M., Haynesworth S.E., Gerson S.L., Rosenthal N.S., Caplan A.I. Ex vivo expansion and subsequent infusion of human bone marrow-derived stromal progenitor cells (mesenchymal progenitor cells): implications for therapeutic use // Bone Marrow Transplant. 1995. Т. 16(4). №0268-3369 (Print). – С. 557-564 .

114. Le Blanc K., Rasmusson I., Sundberg B., Gtherstrm C., Hassan M., Uzunel M., Ringdn O. Treatment of severe acute graft-versus-host disease with third party haploidentical mesenchymal stem cells // The Lancet. 2004. Т. 363. №9419. – С. 1439Le Blanc K., Tammik L., Sundberg B., Haynesworth S.E., Ringdn O. Mesenchymal stem cells inhibit and stimulate mixed lymphocyte cultures and mitogenic responses independently of the major histocompatibility complex // Scandinavian Journal of Immunology. 2003. Т. 57. №1. – С. 11-20 .

116. Lecourt S., Marolleau J.-P., Fromigu O., Vauchez K., Andriamanalijaona R., Ternaux B., Lacassagne M.-N., Robert I., Boumdiene K., Chreau F., Marie P., Larghro J., Fiszman M., Vilquin J.-T. Characterization of distinct mesenchymal-like cell populations from human skeletal muscle in situ and in vitro // Experimental Cell Research. 2010. Т. 316. №15. – С. 2513-2526 .

117. Lee J.W., Fang X., Krasnodembskaya A., Howard J.P., Matthay M.A. Concise review: Mesenchymal stem cells for acute lung injury: role of paracrine soluble factors // Stem Cells. 2011. Т. 29. №6. – С. 913-919 .

118. Lee M.M.K., Chui R.K.S., Tam I.Y.S., Lau A.H.Y., Wong Y.H. CCR1-mediated STAT3 tyrosine phosphorylation and CXCL8 expression in THP-1 macrophage-like cells involve pertussis toxin-insensitive G14/16 signaling and IL-6 release // The Journal of Immunology. 2012. Т. 189. №11. – С. 5266-5276 .

119. Li L., Zhang S., Zhang Y., Yu B., Xu Y., Guan Z. Paracrine action mediate the antifibrotic effect of transplanted mesenchymal stem cells in a rat model of global heart failure // Mol Biol Rep. 2009. Т. 36. №4. – С. 725-731 .

120. Liang-kuan B., Nan Z., Cheng L., Fu-Ding L., Tian-Xin L., Xu-Jun X., Chun J., JinLi H., Hai H., Cai-Xia Z., Wen D., Hao L., Jian H., Ke-Wei X. Kidney cancer cells secrete IL-8 to activate Akt and promote migration of mesenchymal stem cells // Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations. 2014. Т. 32. №5. – С. 607-612 .

121. Lin C.S., Ning H., Lin G., Lue T.F. Is CD34 truly a negative marker for mesenchymal stromal cells? // Cytotherapy. 2012. Т. 14(10). №1477-2566 (Electronic) .

– С. 1159-1163 .

122. Lin G., Garcia M., Ning H., Banie L., Guo Y.L., Lue T.F., Lin C.S. Defining stem and progenitor cells within adipose tissue // Stem Cells Dev. 2008. Т. 17. №6. – С. 1053Liu N., Tian J., Cheng J., Zhang J. Migration of CXCR4 gene-modified bone marrow-derived mesenchymal stem cells to the acute injured kidney // Journal of Cellular Biochemistry. 2013. Т. 114. №12. – С. 2677-2689 .

124. Lopatina T., Bruno S., Tetta C., Kalinina N., Porta M., Camussi G. Platelet-derived growth factor regulates the secretion of extracellular vesicles by adipose mesenchymal stem cells and enhances their angiogenic potential // Cell Commun Signal. 2014. Т. 12. – С. 26 .

125. Lopatina T., Kalinina N., Karagyaur M., Stambolsky D., Rubina K., Revischin A., Pavlova G., Parfyonova Y., Tkachuk V. Adipose-derived stem cells stimulate regeneration of peripheral nerves: BDNF secreted by these cells promotes nerve healing and axon growth de novo // PLoS One. 2011. Т. 6. №3. – С. e17899 .

126. Lu B., Rutledge B.J., Gu L., Fiorillo J., Lukacs N.W., Kunkel S.L., North R., Gerard C., Rollins B.J. Abnormalities in monocyte recruitment and cytokine expression in monocyte chemoattractant protein 1-deficient mice // Journal of Experimental Medicine .

1998. Т. 187. №4. – С. 601-608 .

127. Lushaj E.B., Anstadt E., Haworth R., Roenneburg D., Kim J., Hematti P., Kohmoto T. Mesenchymal stromal cells are present in the heart and promote growth of adult stem cells in vitro // Cytotherapy. 2011. Т. 13. №4. – С. 400-406 .

128. Luther S.A., Cyster J.G. Chemokines as regulators of T cell differentiation // Nat Immunol. 2001. Т. 2. №2. – С. 102-107 .

129. Maccario R., Podesta M., Moretta A., Cometa A., Comoli P., Montagna D., Daudt L., Ibatici A., Piaggio G., Pozzi S., Frassoni F., Locatelli F. Interaction of human mesenchymal stem cells with cells involved in alloantigen-specific immune response favors the differentiation of CD4+ T-cell subsets expressing a regulatory/suppressive phenotype // Haematologica. 2005. Т. 90. №4. – С. 516-525 .

130. Madonna R., Geng Y.-J., De Caterina R. Adipose tissue-derived stem cells:

characterization and potential for cardiovascular repair // Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2009. Т. 29. №11. – С. 1723-1729 .

131. Maghazachi A.A., Al-Aoukaty A., Schall T.J. CC chemokines induce the generation of killer cells from CD56+ cells // European Journal of Immunology. 1996. Т. 26. №2. – С. 315-319 .

132. Majumdar M.K., Thiede M.A., Haynesworth S.E., Bruder S.P., Gerson S.L. Human marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) express hematopoietic cytokines and support long-term hematopoiesis when differentiated toward stromal and osteogenic lineages // J Hematother Stem Cell Res. 2000. Т. 9. №6. – С. 841-848 .

133. Makinoshima H., Dezawa M. Pancreatic cancer cells activate CCL5 expression in mesenchymal stromal cells through the insulin-like growth factor-I pathway // FEBS Lett .

2009. Т. 583. №22. – С. 3697-3703 .

134. Martin P., Leibovich S.J. Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly // Trends in Cell Biology. 2005. Т. 15. №11. – С. 599-607 .

135. Maumus M., Peyrafitte J.A., D'Angelo R., Fournier-Wirth C., Bouloumie A., Casteilla L., Sengenes C., Bourin P. Native human adipose stromal cells: localization, morphology and phenotype // Int J Obes (Lond). 2011. Т. 35. №9. – С. 1141-1153 .

136. Maurer M., von Stebut E. Macrophage inflammatory protein-1 // The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 2004. Т. 36. №10. – С. 1882-1886 .

137. Maximow A.A. Der Lymphozyt als gemeinsame Stammzelle der verschiedenen Blutelemente in der embryonalen Entwicklung und im postfetalen Leben der Sugetiere // Folia Haematologica. 1909. Т. 8. – С. 125-134 .

138. Mazhari R., Hare J.M. Mechanisms of action of mesenchymal stem cells in cardiac repair: potential influences on the cardiac stem cell niche // Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 2007. Т. 4 Suppl 1. – С. S21-26 .

139. Meirelles Lda S., Nardi N.B. Methodology, biology and clinical applications of mesenchymal stem cells // Front Biosci (Landmark Ed). 2009. Т. 14. – С. 4281-4298 .

140. Mendez-Ferrer S., Michurina T.V., Ferraro F., Mazloom A.R., MacArthur B.D., Lira S.A., Scadden D.T., Ma'ayan A., Enikolopov G.N., Frenette P.S. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche // Nature. 2010. Т. 466 .

№7308. – С. 829-834 .

141. Menten P., Wuyts A., Van Damme J. Macrophage inflammatory protein-1 // Cytokine & Growth Factor Reviews. 2002. Т. 13. №6. – С. 455-481 .

142. Meriane M., Duhamel S., Lejeune L., Galipeau J., Annabi B. Cooperation of matrix metalloproteinases with the RhoA/Rho kinase and mitogen-activated protein kinase kinase-1/extracellular signal-regulated kinase signaling pathways is required for the sphingosine-1-phosphate-induced mobilization of marrow-derived stromal cells // Stem Cells. 2006. Т. 24. №11. – С. 2557-2565 .

143. Mitchison T.J., Cramer L.P. Actin-based cell motility and cell locomotion // Cell .

1996. Т. 84. №3. – С. 371-379 .

144. Miyahara Y., Nagaya N., Kataoka M., Yanagawa B., Tanaka K., Hao H., Ishino K., Ishida H., Shimizu T., Kangawa K., Sano S., Okano T., Kitamura S., Mori H .

Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction // Nat Med. 2006. Т. 12. №4. – С. 459-465 .

145. Miyamoto S., Teramoto H., Gutkind J.S., Yamada K.M. Integrins can collaborate with growth factors for phosphorylation of receptor tyrosine kinases and MAP kinase activation: roles of integrin aggregation and occupancy of receptors // The Journal of Cell Biology. 1996. Т. 135. №6. – С. 1633-1642 .

146. Molgat A.S., Gagnon A., Sorisky A. Preadipocyte apoptosis is prevented by macrophage-conditioned medium in a PDGF-dependent manner // Am J Physiol Cell Physiol. 2009. Т. 296. №4. – С. C757-765 .

147. Monaco J.l., Lawrence W.T. Acute wound healing an overview // Clin Plast Surg .

2003. Т. 30. №1. – С. 1-12 .

148. Moro L., Venturino M., Bozzo C., Silengo L., Altruda F., Beguinot L., Tarone G., Defilippi P. Integrins induce activation of EGF receptor: role in MAP kinase induction and adhesion-dependent cell survival // EMBO J. 1998. Т. 17. №22. – С. 6622-6632 .

149. Mortier A., Van Damme J., Proost P. Regulation of chemokine activity by posttranslational modification // Pharmacology & Therapeutics. 2008. Т. 120. №2. – С .

197-217 .

150. Mosser D.M., Edwards J.P. Exploring the full spectrum of macrophage activation // Nat Rev Immunol. 2008. Т. 8. №12. – С. 958-969 .

151. Myllyharju J., Kivirikko K.I. Collagens, modifying enzymes and their mutations in humans, flies and worms // Trends Genet. 2004. Т. 20. №1. – С. 33-43 .

152. Najar M., Rouas R., Raicevic G., Boufker H.I., Lewalle P., Meuleman N., Bron D., Toungouz M., Martiat P., Lagneaux L. Mesenchymal stromal cells promote or suppress the proliferation of T lymphocytes from cord blood and peripheral blood: the importance of low cell ratio and role of interleukin-6 // Cytotherapy. 2009. Т. 11(5). №1477-2566 (Electronic). – С. 570-583 .

153. Nakagami H., Morishita R., Maeda K., Kikuchi Y., Ogihara T., Kaneda Y. Adipose tissue-derived stromal cells as a novel option for regenerative cell therapy // Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 2006. Т. 13. №2. – С. 77-81 .

154. Natesan S., Zhang G., Baer D.G., Walters T.J., Christy R.J., Suggs L.J. A bilayer construct controls adipose-derived stem cell differentiation into endothelial cells and pericytes without growth factor stimulation // Tissue Eng Part A. 2011. Т. 17. №7-8. – С .

941-953 .

155. Nauta A.J., Kruisselbrink A.B., Lurvink E., Willemze R., Fibbe W.E. Mesenchymal stem cells inhibit generation and function of both CD34+-derived and monocyte-derived dendritic cells // The Journal of Immunology. 2006. Т. 177. №4. – С. 2080-2087 .

156. Nauta A.J.F.W.E. Immunomodulatory properties of mesenchymal stromal cells // Blood. 2007. Т. 110. №10. – С. 3499-3506 .

157. Nemeth K., Leelahavanichkul A., Yuen P.S.T., Mayer B., Parmelee A., Doi K., Robey P.G., Leelahavanichkul K., Koller B.H., Brown J.M., Hu X., Jelinek I., Star R.A., Mezey E. Bone marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E2-dependent reprogramming of host macrophages to increase their interleukin-10 production // Nat Med. 2009. Т. 15. №1. – С. 42-49 .

158. Nol D., Caton D., Roche S., Bony C., Lehmann S., Casteilla L., Jorgensen C., Cousin B. Cell specific differences between human adipose-derived and mesenchymal– stromal cells despite similar differentiation potentials // Experimental Cell Research .

2008. Т. 314. №7. – С. 1575-1584 .

159. Nombela-Arrieta C., Ritz J., Silberstein L.E. The elusive nature and function of mesenchymal stem cells // Nat Rev Mol Cell Biol. 2011. Т. 12. №2. – С. 126-131 .

160. Oehrl W., Panayotou G. Modulation of growth factor action by the extracellular matrix // Connect Tissue Res. 2008. Т. 49. №3. – С. 145-148 .

161. Ohab J.J., Fleming S., Blesch A., Carmichael S.T. A neurovascular niche for neurogenesis after stroke // J Neurosci. 2006. Т. 26. №50. – С. 13007-13016 .

162. Ohtaki H., Ylostalo J.H., Foraker J.E., Robinson A.P., Reger R.L., Shioda S., Prockop D.J. Stem/progenitor cells from bone marrow decrease neuronal death in global ischemia by modulation of inflammatory/immune responses // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2008. Т. 105. №38. – С. 14638-14643 .

163. Oswald J., Boxberger S., Jrgensen B., Feldmann S., Ehninger G., Bornhuser M., Werner C. Mesenchymal stem cells can be differentiated into endothelial cells in vitro // Stem Cells. 2004. Т. 22. №3. – С. 377-384 .

164. Pakianathan D.R., Kuta E.G., Artis D.R., Skelton N.J., Hbert C.A. Distinct but Overlapping Epitopes for the Interaction of a CC-Chemokine with CCR1, CCR3, and CCR5 // Biochemistry. 1997. Т. 36. №32. – С. 9642-9648 .

165. Pankov R., Yamada K.M. Fibronectin at a glance // J Cell Sci. 2002. Т. 115. №Pt 20. – С. 3861-3863 .

166. Park H.W., Shin J.-S., Kim C.-W. Proteome of mesenchymal stem cells // Proteomics. 2007. Т. 7. №16. – С. 2881-2894 .

167. Pereira R.F., Halford K.W., O'Hara M.D., Leeper D.B., Sokolov B.P., Pollard M.D., Bagasra O., Prockop D.J. Cultured adherent cells from marrow can serve as long-lasting precursor cells for bone, cartilage, and lung in irradiated mice // Proceedings of the National Academy of Sciences. 1995. Т. 92. №11. – С. 4857-4861 .

168. Pereira R.F., O’Hara M.D., Laptev A.V., Halford K.W., Pollard M.D., Class R., Simon D., Livezey K., Prockop D.J. Marrow stromal cells as a source of progenitor cells for nonhematopoietic tissues in transgenic mice with a phenotype of osteogenesisimperfecta // Proceedings of the National Academy of Sciences. 1998. Т .

95. №3. – С. 1142-1147 .

169. Pillarisetti K., Gupta S.K. Cloning and relative expression analysis of rat stromal cell derived factor-1 (SDF-1)1: SDF-1 alpha mRNA is selectively induced in rat model of myocardial infarction // Inflammation. 2001. Т. 25. №5. – С. 293-300 .

170. Pittenger M.F., Mackay A.M., Beck S.C., Jaiswal R.K., Douglas R., Mosca J.D., Moorman M.A., Simonetti D.W., Craig S., Marshak D.R. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells // Science. 1999. Т. 284. №5411. – С. 143-147 .

171. Pittenger M.F., Martin B.J. Mesenchymal stem cells and their potential as cardiac therapeutics // Circulation Research. 2004. Т. 95. №1. – С. 9-20 .

172. Polchert D., Sobinsky J., Douglas G.W., Kidd M., Moadsiri A., Reina E., Genrich K., Mehrotra S., Setty S., Smith B., Bartholomew A. IFN- activation of mesenchymal stem cells for treatment and prevention of graft versus host disease // European Journal of Immunology. 2008. Т. 38. №6. – С. 1745-1755 .

173. Ponte A.L., Marais E., Gallay N., Langonn A., Delorme B., Hrault O., Charbord P., Domenech J. The in vitro migration capacity of human bone marrow mesenchymal stem cells: comparison of chemokine and growth factor chemotactic activities // Stem Cells. 2007. Т. 25. №7. – С. 1737-1745 .

174. Pricola K.L., Kuhn N.Z., Haleem-Smith H., Song Y., Tuan R.S. Interleukin-6 maintains bone marrow-derived mesenchymal stem cell stemness by an ERK1/2dependent mechanism // Journal of Cellular Biochemistry. 2009. Т. 108. №3. – С. 577Proost P., De Wolf-Peeters C., Conings R., Opdenakker G., Billiau A., Van Damme J. Identification of a novel granulocyte chemotactic protein (GCP-2) from human tumor cells. In vitro and in vivo comparison with natural forms of GRO, IP-10, and IL-8 // The Journal of Immunology. 1993. Т. 150. №3. – С. 1000-1010 .

176. Qin Z. The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature // Atherosclerosis. 2012. Т. 221. №1 .

– С. 2-11 .

177. Quaedackers M.E., Baan C.C., Weimar W., Hoogduijn M.J. Cell contact interaction between adipose-derived stromal cells and allo-activated T lymphocytes // European Journal of Immunology. 2009. Т. 39. №12. – С. 3436-3446 .

178. Rajagopal S., Kim J., Ahn S., Craig S., Lam C.M., Gerard N.P., Gerard C., Lefkowitz R.J. Beta-arrestin- but not G protein-mediated signaling by the "decoy" receptor CXCR7 // Proc Natl Acad Sci U S A. 2010. Т. 107. №2. – С. 628-632 .

179. Ramos C.D.L., Canetti C., Souto J.T., Silva J.S., Hogaboam C.M., Ferreira S.H., Cunha F.Q. MIP-1[CCL3] acting on the CCR1 receptor mediates neutrophil migration in immune inflammation via sequential release of TNF- and LTB4 // Journal of Leukocyte Biology. 2005. Т. 78. №1. – С. 167-177 .

180. Rangappa S., Fen C., Lee E.H., Bongso A., Sim E.K. Transformation of adult mesenchymal stem cells isolated from the fatty tissue into cardiomyocytes // Ann Thorac Surg.. 2003. Т. 75(3). №0003-4975 (Print). – С. 775-779 .

181. Rasmusson I. Immune modulation by mesenchymal stem cells // Exp Cell Res. 2006 .

Т. 312. №12. – С. 2169-2179 .

182. Rattigan Y., Hsu J.-M., Mishra P.J., Glod J., Banerjee D. Interleukin 6 mediated recruitment of mesenchymal stem cells to the hypoxic tumor milieu // Experimental Cell Research. 2010. Т. 316. №20. – С. 3417-3424 .

183. Rehman J., Traktuev D., Li J., Merfeld-Clauss S., Temm-Grove C.J., Bovenkerk J.E., Pell C.L., Johnstone B.H., Considine R.V., March K.L. Secretion of angiogenic and antiapoptotic factors by human adipose stromal cells // Circulation. 2004. Т. 109. №10. – С. 1292-1298 .

184. Ren G., Zhang L., Zhao X., Xu G., Zhang Y., Roberts A.I., Zhao R.C., Shi Y .

Mesenchymal stem cell-mediated immunosuppression occurs via concerted action of chemokines and nitric oxide // Cell Stem Cell. 2008. Т. 2. №2. – С. 141-150 .

185. Ren G., Zhao X., Zhang L., Zhang J., L'Huillier A., Ling W., Roberts A.I., Le A.D., Shi S., Shao C., Shi Y. Inflammatory cytokine-induced intercellular adhesion moleculeand vascular cell adhesion molecule-1 in mesenchymal stem cells are critical for immunosuppression // The Journal of Immunology. 2010. Т. 184. №5. – С. 2321-2328 .

186. Ringe J., Strassburg S., Neumann K., Endres M., Notter M., Burmester G.-R., Kaps C., Sittinger M. Towards in situ tissue repair: Human mesenchymal stem cells express chemokine receptors CXCR1, CXCR2 and CCR2, and migrate upon stimulation with CXCL8 but not CCL2 // Journal of Cellular Biochemistry. 2007. Т. 101. №1. – С. 135Riordan N.H., Ichim T.E., Min W.P., Wang H., Solano F., Lara F., Alfaro M., Rodriguez J.P., Harman R.J., Patel A.N., Murphy M.P., Lee R.R., Minev B. Nonexpanded adipose stromal vascular fraction cell therapy for multiple sclerosis // J Transl Med. 2009. Т. 7. – С. 29 .

188. Rollins B.J. Chemokines // Blood. 1997. Т. 90. №3. – С. 909-928 .

189. Rozario T., DeSimone D.W. The extracellular matrix in development and morphogenesis: a dynamic view // Dev Biol. 2010. Т. 341. №1. – С. 126-140 .

190. Rubina K., Kalinina N., Efimenko A., Lopatina T., Melikhova V., Tsokolaeva Z., Sysoeva V., Tkachuk V.A., Parfyonova Y. Adipose stromal cells stimulate angiogenesis via promoting progenitor cell differentiation, secretion of angiogenic factors, and enhancing vessel maturation // Tissue Eng Part A. 2009. Т. 15. №5. – С. 2039-2050 .

191. Ruoslahti E. Fibronectin in cell adhesion and invasion // Cancer Metastasis Rev .

1984. Т. 3. №1. – С. 43-51 .

192. Rster B., Gttig S., Ludwig R.J., Bistrian R., Mller S., Seifried E., Gille J., Henschler R. Mesenchymal stem cells display coordinated rolling and adhesion behavior on endothelial cells // Blood. 2006. Т. 108. №12. – С. 3938-3944 .

193. Safford K.M., Safford S.D., Gimble J.M., Shetty A.K., Rice H.E. Characterization of neuronal/glial differentiation of murine adipose-derived adult stromal cells // Experimental Neurology. 2004. Т. 187. №2. – С. 319-328 .

194. Sanz L., Santos-Valle P., Alonso-Camino V., Salas C., Serrano A., Vicario J.L., Cuesta A.M., Compte M., Sanchez-Martin D., Alvarez-Vallina L. Long-term in vivo imaging of human angiogenesis: critical role of bone marrow-derived mesenchymal stem cells for the generation of durable blood vessels // Microvasc Res. 2008. Т. 75. №3. – С .

308-314 .

195. Sarugaser R., Lickorish D., Baksh D., Hosseini M.M., Davies J.E. Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: a source of mesenchymal progenitors // Stem Cells .

2005. Т. 23. №2. – С. 220-229 .

196. Sasaki M., Abe R., Fujita Y., Ando S., Inokuma D., Shimizu H. Mesenchymal stem cells are recruited into wounded skin and contribute to wound repair by transdifferentiation into multiple skin cell type // The Journal of Immunology. 2008. Т .

180. №4. – С. 2581-2587 .

197. Sasaki M., Radtke C., Tan A.M., Zhao P., Hamada H., Houkin K., Honmou O., Kocsis J.D. BDNF-hypersecreting human mesenchymal stem cells promote functional recovery, axonal sprouting, and protection of corticospinal neurons after spinal cord injury // The Journal of Neuroscience. 2009. Т. 29. №47. – С. 14932-14941 .

198. Schall T.J., Jongstra J., Dyer B.J., Jorgensen J., Clayberger C., Davis M.M., Krensky A.M. A human T cell-specific molecule is a member of a new gene family // The Journal of Immunology. 1988. Т. 141. №3. – С. 1018-1025 .

199. Schenk S., Mal N., Finan A., Zhang M., Kiedrowski M., Popovic Z., McCarthy P.M., Penn M.S. Monocyte chemotactic protein-3 is a myocardial mesenchymal stem cell homing factor // Stem Cells. 2007. Т. 25. №1. – С. 245-251 .

200. Schmid J., Weissmann C. Induction of mRNA for a serine protease and a betathromboglobulin-like protein in mitogen-stimulated human leukocytes // The Journal of Immunology. 1987. Т. 139. №1. – С. 250-256 .

201. Schneider I.C., Haugh J.M. Mechanisms of gradient sensing and chemotaxis:

conserved pathways, diverse regulation // Cell Cycle. 2006. Т. 5. №11. – С. 1130-1134 .

202. Schwende H., Fitzke E., Ambs P., Dieter P. Differences in the state of differentiation of THP-1 cells induced by phorbol ester and 1,25-dihydroxyvitamin D3 // J Leukoc Biol .

1996. Т. 59. №4. – С. 555-561 .

203. Selmani Z., Naji A., Zidi I., Favier B., Gaiffe E., Obert L., Borg C., Saas P., Tiberghien P., Rouas-Freiss N., Carosella E.D., Deschaseaux F. Human leukocyte antigen-G5 secretion by human mesenchymal stem cells is required to suppress T lymphocyte and natural killer function and to induce CD4+CD25highFOXP3+ regulatory T cells // Stem Cells. 2008. Т. 26. №1. – С. 212-222 .

204. Shevchenko E.K., Makarevich P.I., Tsokolaeva Z.I., Boldyreva M.A., Sysoeva V.Y., Tkachuk V.A., Parfyonova Y.V. Transplantation of modified human adipose derived stromal cells expressing VEGF165 results in more efficient angiogenic response in ischemic skeletal muscle // J Transl Med. 2013. Т. 11. – С. 138 .

205. Shi S., Gronthos S. Perivascular niche of postnatal mesenchymal stem cells in human bone marrow and dental pulp // Journal of Bone and Mineral Research. 2003. Т. 18. №4 .

– С. 696-704 .

206. Shih D.T.-b., Lee D.-C., Chen S.-C., Tsai R.-Y., Huang C.-T., Tsai C.-C., Shen E.Y., Chiu W.-T. Isolation and characterization of neurogenic mesenchymal stem cells in human scalp tissue // Stem Cells. 2005. Т. 23. №7. – С. 1012-1020 .

207. Shin S.Y., Nam J.-S., Lim Y., Lee Y.H. TNF-exposed bone marrow-derived mesenchymal stem cells promote locomotion of MDA-MB-231 breast cancer cells through transcriptional activation of CXCR3 ligand chemokines // Journal of Biological Chemistry. 2010. Т. 285. №40. – С. 30731-30740 .

208. Shioi A., Katagi M., Okuno Y., Mori K., Jono S., Koyama H., Nishizawa Y .

Induction of bone-type alkaline phosphatase in human vascular smooth muscle cells:

roles of tumor necrosis factor-alpha and oncostatin M derived from macrophages // Circ Res. 2002. Т. 91. №1. – С. 9-16 .

209. Siegbahn A., Hammacher A., Westermark B., Heldin C.H. Differential effects of the various isoforms of platelet-derived growth factor on chemotaxis of fibroblasts, monocytes, and granulocytes // The Journal of Clinical Investigation. 1990. Т. 85. №3. – С. 916-920 .

210. Singer N.G., Caplan A.I. Mesenchymal Stem Cells: Mechanisms of Inflammation // Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 2011. Т. 6. №1. – С. 457-478 .

211. Smith H.W., Marshall C.J. Regulation of cell signalling by uPAR // Nat Rev Mol Cell Biol. 2010. Т. 11. №1. – С. 23-36 .

212. Smith M.L., Gourdon D., Little W.C., Kubow K.E., Eguiluz R.A., Luna-Morris S., Vogel V. Force-induced unfolding of fibronectin in the extracellular matrix of living cells // PLoS Biol. 2007. Т. 5. №10. – С. e268 .

213. Song A., Nikolcheva T., Krensky A.M. Transcriptional regulation of RANTES expression in T lymphocytes // Immunological Reviews. 2000. Т. 177. №1. – С. 236-245 .

214. Sordi V., Malosio M.L., Marchesi F., Mercalli A., Melzi R., Giordano T., Belmonte N., Ferrari G., Leone B.E., Bertuzzi F., Zerbini G., Allavena P., Bonifacio E., Piemonti L. Bone marrow mesenchymal stem cells express a restricted set of functionally active chemokine receptors capable of promoting migration to pancreatic islets // Blood. 2005 .

Т. 106. №2. – С. 419-427 .

215. Sorrell J.M., Baber M.A., Caplan A.I. Influence of adult mesenchymal stem cells on in vitro vascular formation // Tissue Eng Part A. 2009. Т. 15. №7. – С. 1751-1761 .

216. Sowa Y., Imura T., Numajiri T., Takeda K., Mabuchi Y., Matsuzaki Y., Nishino K .

Adipose stromal cells contain phenotypically distinct adipogenic progenitors derived from neural crest // PLoS One. 2013. Т. 8(12). №1932-6203 (Electronic). – С. e84206 .

217. Spaeth E., Klopp A., Dembinski J., Andreeff M., Marini F. Inflammation and tumor microenvironments: defining the migratory itinerary of mesenchymal stem cells // Gene Ther. 2008. Т. 15. №10. – С. 730-738 .

218. Stich S., Haag M., Hupl T., Sezer O., Notter M., Kaps C., Sittinger M., Ringe J .

Gene expression profiling of human mesenchymal stem cells chemotactically induced with CXCL12 // Cell and Tissue Research. 2009. Т. 336. №2. – С. 225-236 .



Pages:   || 2 |



Похожие работы:

«Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования “Казанский государственный медицинский университет” Министерства здравоохранения Российской Федерации Кафедра Госпитальной т...»

«BY0200135 Биологическая дозиметрия и. _, Тенденции, выявленные в последние годы, дают основание считать ликвидаторов группой высокого риска по онкогематологическим заболеваниям, что требует разработки соответствующих организационных...»

«Князев Николай Александрович ВЛИЯНИЕ ПОЛИХРОМАТИЧЕСКОГО ВИДИМОГО И ИНФРАКРАСНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА РОСТ ОПУХОЛЕЙ 03.03.04 – Клеточная биология, цитология, гистология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание у...»

«See discussions, stats, and author profiles for this publication at: https://www.researchgate.net/publication/270957442 Bumblebees (Hymenoptera: Apidae, Bombus Latr.) on a gradient of the anthropogenic transformation of landscapes in the delta of Northern Dvina Article · January 2010 CITATIONS READS 1 author: Grigory Po...»

«Новосибирский государственный технический университет    www.nstu.ru  Раздел "Абитуриентам" – Программы вступительных испытаний    БИОЛОГИЯ РАЗДЕЛ 1 БИОЛОГИЯ КАК НАУКА. МЕТОДЫ НАУЧНОГО ПОЗНАНИЯ 1.1 Биология как наука, ее достижения, методы познания живо...»

«ПИНАЕВА Нина Владимировна БИОЛОГИЧЕСКИЕ И ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ИСКУССТВЕННОГО СЕМЕННОГО РАЗМНОЖЕНИЯ СОСНЫ КЕДРОВОЙ СИБИРСКОЙ (PINUS SIBIRICA DU. TOUR.) (НА ПРИМЕРЕ ПОДЗОНЫ ЮЖНОЙ ТАЙГИ ) 03.00.05 – Ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Томск...»

«Группа трансгендерных людей является довольно немногочисленной. Этот факт во многом объясняет отсутствие какой-либо информации об их трудоустройстве и адаптации на рабочих местах. Однако трансгендерные люди испытывают, пожалуй, самые серьезные сложности с трудоустройством по сравнению с другими пред...»

«Департамент образования, науки и молодежной политики Воронежской области государственное бюджетное профессиональное образовательное учреждение Воронежской области "Борисоглебский дорожный техникум" (ГБПОУ ВО "БДТ") П олож ен и е об учебной и 1. Положение об учебной и производственной практике студентов ГБПОУ В...»

«Зависимость устойчивости бобов сои к растрескиванию от анатомического строения их створок Зеленцов С. В.1, Мошненко Е. В.2, Будников Е . Н.3 Зеленцов Сергей Викторович / Zelentsov Segrey Viktorovich – доктор сельскохозяйственных наук, и. о. заведу...»

«Труды Мордовского государственного природного заповедника им. П. Г. Смидовича Отчет По теме: Выпуск речного бобра в водоемы МГЗ и меры его усиленной реакклиматизации. 1937 год Н.И. Корчагин Благодаря серьезному вниманию нашей партии и правительства советская наука, с самого начала организаци...»

«EcoLexicon: Estudio contrastivo de la terminologa medioambiental ruso-espaola a base del anlisis de la multidimensionalidad a nivel lxico Olga Koreneva Antonova olgakor@correo.ugr.es Las lenguas rusa y espaola en la teora y la prctica de la traduccin Departamento de Traduccin...»

«ОТЗЫВ официального оппонента на диссертационную работу Аль-Рабии Мохаммед Али Мохаммеда "Свободнорадикальный гомеостаз и структурнофункциональное состояние мембран эритроцитов крыс при гипотермии", представленную в специализированный объединенный диссертационный совет ДМ 212.009.01 по защите докторских и к...»

«Глава 20 ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ СОЦИОЛОГИЯ о. н. яницкий § 1. Введение Экологическая (или инвайронментальная, от английского environment — среда) социология как самостоятельная социологическая дисциплина возникла сравнительно недавно, хотя некоторые элементы социально-экологической теории были...»

«Карманный справочник по генетически модифицированным (ГМ) продуктам и применимым к ним правилам Введение Введение В последующие годы сельское хозяйство столкнется с серьезными проблемами — начиная от быстрого роста мирового населения, которое необходимо накормить, и заканчивая изменением климата и п...»

«Преимущества сотрудничества Уроки, извлеченные из управления трансграничными водотоками Пиренейского полуострова Педро Серра (Pedro Serra) апрель 2018 года Введение Речной сток, как сезонный, так и внутригодовой, является нера...»

«Государственное бюджетное дошкольное образовательное учреждение детский сад № 4 комбинированного вида Пушкинского района Санкт-Петербурга Сценарий экологического досуга на тему: "Весна пришла природа ожила" по произвед...»

«ПОСТАНОВЛЕНИЕ от 5 апреля 2011 г. N 229 ОБ УЧАСТИИ В ОБЩЕРОССИЙСКОЙ АКЦИИ ДНИ ЗАЩИТЫ ОТ ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ ОПАСНОСТИ 2011 05.04.11 15:19 АДМИНИСТРАЦИЯ МЦЕНСКОГО РАЙОНА ПОСТАНОВЛЕНИЕ от 5 апреля 2011 г. N 229 ОБ УЧАСТИИ В ОБЩЕРОССИЙСКОЙ АКЦИИ ДНИ ЗАЩИТЫ ОТ ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ ОПАСНОСТ...»

«Публикуется Альянсом по сохранению сайгака SAIGA NEWS зима 2008-2009 выпуск 8 Издается на 6-ти языках для информационного обмена по вопросам экологии и охраны сайгака СОДЕРЖАНИЕ Современное состояние и распространение сайгака в Монголии Б. Чимеддорж1, Л.Амгалан2, Б. Бувейбатар2 Осн...»

«П А Р А З И Т О Л О Г И Я, XVI, 1, 19 82 КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ УДК 576.895.122 : 597.5 НОВЫЕ ДАННЫЕ О ASYMPHYLODORA PROGENETICAPARASYMPHYLODORA PROGENETICA (TREMATODA, MONORCHIDAE) А. П. Кулакова Зоологический институт А Н СССР, Ленинград Найдена в рыбе Asymphylodora progenetica, известная ранее только как...»

«ЧТЕНИЯ ПАМЯТИ ВЛАДИМИРА ЯКОВЛЕВИЧА ЛЕВАНИДОВА Vladimir Ya. Levanidov’s Biennial Memorial Meetings Вып. 6 ОЦЕНКА ВКЛАДА ПЛАНКТОНОВ В ФОРМИРОВАНИЕ СЕДИМЕНТАЦИОННОГО ПОТОКА В ОЗЕРЕ КОТОКЕЛЬ (ВОСТОЧНОЕ ПРИБАЙКАЛЬЕ) Р.Е. Романов1, Н.И. Ерм...»

«Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук И.Н. Кутявин СОСНОВЫЕ ЛЕСА СЕВЕРНОГО ПРИУРАЛЬЯ: СТРОЕНИЕ, РОСТ, ПРОДУКТИВНОСТЬ Сыктывкар ИБ Коми НЦ УрО РАН УДК 630*187:582.475:630*22 (470.1) ББК 43.4 (235.55) К95 Сосновые леса Северного Приура...»

«Инструктивно-методическое письмо "Особенности организации воспитательной, идеологической и социальной работы в учреждениях общего среднего образования в 2018/2019 учебном году" СОДЕРЖАНИЕ I. Общие положения II. Актуальные направления воспитательной и идеологической работы в 2018/2019 учебном году:1. Гражданское и патриотическое воспитание 2...»

«1 А.И. Субетто Критика "экономического разума"4.Империалистическая глобализация как форма экологической гибели "экономического разума" капитализма и Спасение человечества на основе ноосферного социализма и ноосферного разума Эпиграф "В конце ХХ века сложилась и ныне р...»

«Лето 2014: Публикуется Альянсом по сохранению сайгака выпуск 18 SAIGA NEWS Издается на 6-ти языках для информационного обмена по вопросам экологии и охраны сайгака Фото Е. Полонского Барьеры как угроза миграции сайгака в Казахстане Штеффен Цутер, АСБК, ste...»




 
2019 www.mash.dobrota.biz - «Бесплатная электронная библиотека - онлайн публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.