«КЛЕТОЧНОЙ БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЕ ВЛИЯНИЕ КОМПОНЕНТОВ ВНЕКЛЕТОЧНОГО МАТРИКСА НА КЛОНАЛЬНЫЙ РОСТ И ОСТЕОГЕННУЮ ДИФФЕРЕНЦИРОВКУ МЕЗЕНХИМНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК КРЫСЫ О.Н. Хныкова, О.В. Паюшина, Н.Н. ...»

37

СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ: ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ФУНДАМЕНТАЛЬНОЙ

КЛЕТОЧНОЙ БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЕ

ВЛИЯНИЕ КОМПОНЕНТОВ ВНЕКЛЕТОЧНОГО МАТРИКСА НА КЛОНАЛЬНЫЙ

РОСТ И ОСТЕОГЕННУЮ ДИФФЕРЕНЦИРОВКУ МЕЗЕНХИМНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ

КЛЕТОК КРЫСЫ

О.Н. Хныкова, О.В. Паюшина, Н.Н. Буторина, Э.И. Буеверова, В.И. Старостин Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, Москва, payushina@mail.ru Белки внеклеточного матрикса являются необходимым компонентом микроокружения мезенхимных стромальных клеток (МСК). Исследование адгезивных взаимодействий МСК с матриксом необходимо для понимания механизмов регуляции пролиферации и дифференцировки МСК и важно для дальнейшего развития клеточной терапии. Целью этого исследования был анализ влияния некоторых белков внеклеточного матрикса (коллаген I типа, фибронектин и ламинин) на клональный рост и остеогенные потенции МСК, полученных из костного мозга половозрелых крыс и печени зародышей крыс. Было обнаружено, что для обоих источников доля колониеобразующих единиц фибробластов (КОЕ-Ф), прикрепившихся за первые 7 дней инкубации, существенно выше на фибронектиновом и коллагеновом покрытии по сравнению с обычным пластиковым покрытием. Влияние ламинина на адгезию КОЕ-Ф выражено в меньшей степени. Анализ экспрессии щелочной фосфатазы, маркирующей ранние стадии остеогенной дифференцировки, указывает на сниженный остеогенный потенциал костномозговых КОЕ-Ф на фибронектине по сравнению с пластиком, коллагеном I типа и ламинином .

Доля остеогенных клеток среди КОЕ-Ф зародышевой печени крайне низка независимо от присутствия белков внеклеточного матрикса. Анализ терминальной дифференцировки костномозговых МСК в остеогенной среде показал подавляющий эффект фибронектина на отложение кальция в остеогенных узелках. Коллаген I типа и ламинин существенного эффекта на остеогенную дифференцировку в данной экспериментальной системе не оказывали. Изучение молекулярных механизмов обнаруженных явлений представляется перспективной темой для дальнейших исследований .

Ключевые слова: мезенхимные стромальные клетки, колониеобразующие единицы фибробластов, остеогенез, адгезия, белки внеклеточного матрикса, коллаген I типа, ламинин, фибронектин .

Мезенхимные стромальные клетки (МСК), впервые описанные Фриденштейном (1, 2) как колониеобразующие единицы фибробластов (КОЕ-Ф), в настоящее время определяются как адгезивные к пластику клетки со специфическим поверхностным фенотипом (CD73+CD90+CD105+ при отсутствии кроветворных маркеров), способные к остео-, адипо- и хондрогенной дифференцировке in vitro (3). Клетки, удовлетворяющие критериям МСК, присутствуют в костном мозге, жировой ткани (4), стенке сосудов (5), надкостнице (6), пульпе зуба (7), пуповинной крови (8), синовиальной мембране (9) и некоторых фетальных органах – печени, сердце, поджелудочной железе, легком и селезенке (10). МСК из разных источников сходны по основным характеристикам, хотя могут иметь некоторые различия по потенциям к пролиферации и дифференцировке и по экспрессии некоторых маркеров. Например, показано, что при практически одинаковом иммунофенотипе МСК из фетальной селезенки имеют сниженные потенции к адипогенезу, а МСК из фетальной печени – к остеогенезу (10) .

Возможность получения МСК из аутологичных источников (например, костного мозга или жировой ткани), сравнительная легкость их культивирования и высокая способность к пролиферации и дифференцировке делают эти клетки перспективными для применения в регенеративной медицине .

Большое значение для понимания механизмов регуляции роста и дифференцировки МСК, а также для совершенствования методов их клинического использования, имеет изучение их взаимодействий с микроокружением, одним из важных компонентов которого является внеклеточный матрикс. МСК продуцируют такие молекулы внеклеточного матрикса, как коллаген I и III типов, фибронектин, ламинин, остеонектин и некоторые другие, и несут на своей поверхности рецепторы к этим белкам (11). Особое место среди этих рецепторов занимают интегрины - особый класс белков, состоящих из двух полипептидных цепей и. На мембране МСК присутствуют субъединицы интегринов 1,2,3,4,5,6,v,1,3,4. Есть свидетельства того, что образование групп интегринов в местах контакта с матриксом может инициировать сборку сигнального комплекса на цитоплазматической поверхности плазматической мембраны, подобно действию рецепторов факторов роста, и активировать некоторые сигнальные пути, в частности, инозитол-трифосфатный. Внутриклеточные сигналы, генерируемые при связывании белков внеклеточного матрикса с интегринами, могут влиять как на митотическую активность клеток, так и на их потенции к дифференцировке в том или ином направлении .

К настоящему моменту данные о влиянии различных белков матрикса на МСК довольно противоречивы. Разные авторы по-разному оценивают адгезивные способности МСК по отношению к этим молекулам. Данные об изменении дифференцировочных потенций МСК при культивировании на разных субстратах также неоднозначны. Одним из наиболее изученных к настоящему времени белков внеклеточного матрикса является коллаген I типа .

Известно, что МСК демонстрируют выраженную адгезивность к нему и высокую способность к пролиферации на коллагеновых носителях in vitro (12). При этом коллаген I типа способствует остеогенной дифференцировке МСК (13), что позволяет выращивать их на коллагеновых губках и применять для репарации костных и хрящевых дефектов (14), но делает коллагеновые носители непригодными для лечения повреждений сосудов и т.п .

В связи с вышесказанным, комплексное исследование влияния белков внеклеточного матрикса на адгезию, пролиферацию и дифференцировку МСК представляет значительный интерес как с теоретической точки зрения (для выяснения конкретных механизмов регуляторного воздействия микроокружения на функции клеток), так и с практической (для разработки оптимальных протоколов культивирования МСК и носителей для их трансплантации в разные области организма). В настоящей работе было проведено сравнительное исследование клонального роста и остеогенных потенций МСК костного мозга и зародышевой печени крысы при их культивировании на одних из основных компонентов внеклеточного матрикса - фибронектине, коллагене I типа и ламинине .

Материал и методы Животные. В качестве источника клеток были использованы крысы Wistar неинбредного разведения (самки в возрасте 3–5 мес. и весом 220–330 г) и их плоды 16 сут развития .

Первым днем эмбриогенеза считали день обнаружения сперматозоидов во влагалищном мазке .

Реактивы и материалы. Для культивирования клеток использовали среду -MEM, сыворотку плодов коровы, растворы L-глутамина, антибиотика-антимикотика, пенициллинастрептомицина и 0,25 %-ный трипсин с ЭДТА фирмы HyClone (США), флаконы с площадью дна 25 см2 и 12-луночные платы BD Biocoat, покрытые коллагеном I типа или ламинином (BD Biosciences, США), либо аналогичные флаконы и платы без белкового покрытия (Greiner, Германия). Фибронектин из плазмы крови человека был любезно предоставлен А.А. Мининым (Лаборатория биохимической эмбриологии Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН); культуральную посуду покрывали им, нанося на дно раствор фибронектина с концентрацией 50 мкг/мл и высушивая в ламинарном боксе в течение 2 ч. В работе были использованы дексаметазон, -глицерофосфат натрия, набор для выявления активности щелочной фосфатазы (ЩФ), ализариновый красный S, раствор гематоксилина Гилла фирмы Sigma (США) и 2-фосфо-L-аскорбат фирмы Fluka (Германия) .

Выделение и культивирование клеток. Клеточную суспензию, полученную из костного мозга половозрелых крыс или печени плодов, помещали в концентрации 1х106 клеток/мл в культуральные флаконы и инкубировали при 37 °С и 5 % CO2 в среде -MEM с 10% сыворотки плодов коровы с добавлением L-глутамина, антибиотика-антимикотика и пенициллинастрептомицина. В экспериментах по оценке числа КОЕ-Ф, прикрепляющихся к субстрату в разные сроки культивирования, клетки инкубировали в течение 7 сут во флаконах, покрытых белками внеклеточного матрикса, или в пластиковых флаконах без белкового покрытия, после чего проводили смену среды и продолжали культивировать клетки костного мозга в течение 4–5 сут, а клетки зародышевой печени – в течение 1 сут. Удаляемую при смене среду с неприкрепленными клетками переносили в новые флаконы с тем же покрытием и культивировали в течение 7 сут (костный мозг) или 5 сут (зародышевая печень). Для индукции остеогенной дифференцировки клетки костного мозга культивировали в непокрытых флаконах до слияния колоний, снимали трипсином с ЭДТА и пересевали с концентрацией 1– 5х104 клеток/мл в платы с индукционной средой (-MEM с 10% сыворотки плодов коровы с добавлением 10-8 M дексаметазона, 50 мкг/мл 2-фосфо-L-аскорбата и 10 мМ глицерофосфата натрия), покрытые изучаемыми белками. Культивирование продолжали в течение 14 сут, сменяя среду дважды в неделю .

Анализ результатов. Для подсчета колоний и анализа активности щелочной фосфатазы культуры фиксировали смесью цитрата, ацетона и формальдегида и проводили реакцию азосочетания прочного красно-фиолетового FRV с нафтолом AS-BI согласно протоколу фирмы-производителя. Численность КОЕ-Ф определяли подсчетом колоний, содержащих не менее 50 клеток. В экспериментах по индукции остеогенеза культуры фиксировали 960-ным этанолом и выявляли отложения солей кальция путем окрашивания ализариновым красным S в течение 10 мин при pH 4.1 (15); ядра докрашивали гематоксилином. Величину минерализованных очагов остеогенеза оценивали, измеряя площадь окрашенных ализариновым красным S областей на отсканированных изображениях лунок в программе ImageJ (16). Морфологию клеток и результаты цитохимических реакций анализировали с помощью микроскопа Olympus AH-3 (Япония). Результаты обрабатывали статистически с использованием таблиц Стрелкова (17) .

Результаты и обсуждение Численность и остеогенные потенции КОЕ-Ф, прикрепляющихся к субстрату в различные сроки культивирования. Было проведено сравнительное изучение динамики прикрепления КОЕ-Ф, содержащихся в костном мозге или зародышевой печени, к культуральному пластику и белкам внеклеточного матрикса. Для оценки остеогенных потенций КОЕ-Ф, прикрепившихся и не прикрепившихся к субстрату за первые 7 сут культивирования, в образованных ими колониях была проанализирована активность щелочной фосфатазы, маркирующая ранние стадии остеогенеза. Полученные данные представлены в таблицах 1 и 2 .

Как показал подсчет числа колоний, после 7 сут культивирования на пластике часть КОЕ-Ф зародышевой печени и еще более высокая доля КОЕ-Ф костного мозга оставались неприкрепленными. Покрытие флаконов фибронектином или коллагеном I типа значительно повышало долю КОЕ-Ф, прикрепившихся в первые 7 сут; влияние ламинина на динамику прикрепления КОЕ-Ф было выражено слабее. В целом, судя по соотношению числа колоний, образованных прикрепившимися и не прикрепившимися за этот срок клетками, КОЕ-Ф зародышевой печени были более адгезивны к изучаемым белкам, чем КОЕ-Ф костного мозга .

Бльшая адгезивность МСК из зародышевой печени по сравнению с МСК из костного мозга половозрелого животного может быть объяснена особой ролью, которую играют адгезивные взаимодействия клеток в эмбриогенезе. Возможно, МСК, как и другие клетки зародыша, несут на своей поверхности больше молекул адгезии, чем клетки взрослого животного .

Наши результаты согласуются с данными некоторых авторов, показавших более эффективное прикрепление МСК к коллагену I типа и фибронектину по сравнению с коллагеном IV типа и ламинином (18,19). Эти данные были получены на пассируемых культурах путем оценки общего числа прикрепившихся клеток. Исследование же клонального роста КОЕ-Ф в первичной культуре костного мозга мыши, проведенное американскими учеными, показало, что покрытие культуральной посуды белками матрикса, в том числе коллагеном I типа и фибронектином, не приводит к усиленному прикреплению клоногенных клеток в первые 8 сут культивирования по сравнению с контролем на пластике (20). Сходные данные получены и в нашей работе, однако они расширены исследованием популяции клеток, прикрепляющихся в более поздний срок культивирования. Именно анализ численности колоний в этой популяции и демонстрирует нам влияние белков внеклеточного матрикса на адгезивные свойства КОЕ-Ф .

Оценка активности щелочной фосфатазы показала, что среди КОЕ-Ф костного мозга, культивируемых на коллагене I типа или ламинине, доля остеогенных клеток сопоставима с таковой на пластике, тогда как на фибронектине она существенно снижена. Доля остеогенных клеток среди КОЕ-Ф из зародышевой печени была крайне низкой независимо от присутствия белков матрикса. Полученные нами данные о сниженных остеогенных потенциях клеток зародышевой печени подтверждаются и в исследованиях других авторов, о чем говорилось выше (10). Интересным является то, что, по-видимому, потенции клеток зародышевой печени к остеогенной дифференцировке настолько низки, что ни один из исследуемых белков внеклеточного матрикса не способен на них повлиять .

–  –  –

Примечание. Пл – пластик, Фн – фибронектин, Кол – коллаген I типа, Лам – ламинин, ЩФ – щелочная фосфатаза. Достоверность различий между контролем (пластик) и опытом (белок матрикса): * p0,05; ** - p0,01; *** - p0,001 .

<

–  –  –

Примечание. Обозначения те же, что в таблице 1 .

Дифференцировка МСК костного мозга в остеогенной среде. Заключение о влиянии исследуемых белков внеклеточного матрикса на остеогенные потенции МСК костного мозга, сделанное на основании оценки спонтанной экспрессии щелочной фосфатазы в первичной культуре, подтверждается анализом терминальной остеогенной дифференцировки клеток первого пассажа в индукционной среде. Очаги остеогенеза, представляющие собой плотные скопления клеток с морфологией остеобластов (кубической формы, с рыхлыми ядрами и интенсивной базофилией цитоплазмы) образовывались на всех изучаемых субстратах .

Однако количество откладываемых в таких очагах солей кальция на фибронектине было значительно меньшим, чем на пластике, тогда как коллаген I типа и ламинин не оказывали достоверного влияния на минерализацию костного матрикса (см. рисунок) .

–  –  –

Рисунок. Площадь отложений Ca2+ в очагах остеогенной дифференцировки МСК костного мозга на пластике (пл), коллагене I типа (кол), ламинине (лам) и фибронектине (фн) .

Наши данные об ингибирующем влиянии фибронектина на остеогенез не согласуются с литературными. Напротив, имеются сообщения, что в культуре остеобластов фибронектин стимулирует остеогенную дифференцировку (21). Мы же наблюдали на фибронектине не только уменьшенную минерализацию в процессе индукции остеогенной дифференцировки МСК, но и сниженные остеогенные потенции КОЕ-Ф. При этом интересно, что образование костных узелков на фибронектине происходило, но кальций не откладывался. Возможно, фибронектин замедляет остеогенную дифференцировку в культуре МСК или блокирует ее терминальные стадии. Не исключено также, что высокая способность недифференцированных МСК прикрепляться к фибронектину ведет к преимущественной адгезии к этому субстрату наименее зрелых предшественников, что также влияет на скорость дифференцировки в культуре. Все эти предположения требуют подробного рассмотрения в ходе дальнейшей работы .

Стоит отметить, что для объяснения наблюдаемых нами эффектов необходимо исследовать профиль экспрессии интегринов на поверхности МСК на разных сроках культивирования и в разных средах, поскольку, скорее всего, именно связывание клеток с белками внеклеточного матрикса через интегрины запускает внутриклеточные каскады, приводящие к изменению цитоскелета, потенций и митотической активности клеток .

Таким образом, результаты проведенных экспериментов свидетельствуют о стимулирующем влиянии изученных белков внеклеточного матрикса на адгезию клоногенных МСК, выражающемся в более раннем прикреплении клеток к субстрату, а также о снижении остеогенных потенций МСК при их культивировании на фибронектине. В дальнейших исследованиях будет продолжена оценка влияния белков внеклеточного матрикса на дифференцировку МСК и проанализированы молекулярные механизмы этого влияния .

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект 09-04-00002-а) и проекта «Ведущие научные школы» (НШ-1134.2008.4) .

Список литературы

1. Фриденштейн А. Я., Чайлахян Р. К., Лалыкина К. С. О фибробластоподобных клетках в культурах кроветворной ткани морских свинок. Цитология, 1970, 12, 9: 11471155 .

2. Friedenstein A. J., Gorskaja J. F., Kulagina N. N. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs. Exp. Hematol., 1976, 4: 267274 .

3. Dominici M., Le Blanc K., Mueller I., Slaper-Cortenbach I., Marini F., Krause D., Deans R., Keating A., Prockop D., Horwitz E. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy, 2006, 8: 315– 317 .

4. Nathan S., Das De S., Thambyah A., Fen C., Goh J., Lee E.H. Cell-based therapy in the repair of osteochondral defects: a novel use for adipose tissue. Tissue Eng., 2003, 9, 4: 733-744 .

5. Abedin M., Tintut Y., Demer L.L. Mesenchymal stem cells and the artery wall. Circ Res., 2004, 95, 7: 671- 676 .

6. Nakahara H., Bruder S.P., Goldberg V.M., Caplan A.I. In vivo osteochondrogenic potential of cultured cells derived from the periosteum. Clin. Orthop. Relat. Res., 1990, 259: 223-232 .

7. Pierdomenico L., Bonsi L., Calvitti M., Rondelli D., Arpinati M., Chirumbolo G., Becchetti E., Marchionni C., Alviano F., Fossati V., Staffolani N., Franchina M., Grossi A., Bagnara G.P .

Multipotent mesenchymal stem cells with immunosuppressive activity can be easily isolated from dental pulp. Transplantation, 2005, 80, 6: 836-842 .

8. Erices A., Conget P., Minguell J.J. Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood. Br. J. Haematol., 2000, 109, 1: 235-242 .

9. Fickert S., Fiedler J., Brenner R.E. Identification of subpopulations with characteristics of mesenchymal progenitor cells from human osteoarthritic cartilage using triple staining for cell surface markers. Arthritis Res. Ther., 2004, 6, 5: 422-432 .

10. in’t Anker P.S., Noort W.A., Scherjon S.A., Kleuburg-van der Keur G., Krusselbrink A.B., van Bezoouen R.L., Beekhuizen W., Willemze R., Kanhai H.H., Fibbe W.E. Mesenchymal stem cells in human second-trimester bone marrow, liver, lung, and spleen exhibit a similar

immunophenotype but a heterogeneous multilineage differentiation potential. J. Hematol., 2003, 88:

845-852 .

11. Minguell J.J., Erices A., Conget P. Mesenchymal stem cells. Exp. Biol. Med., 2001, 226, 6:

507-520 .

12. Liu G., Hu Y.Y., Zhao J.N., Wu S.J., Xiong Z., Lu R. Effect of type I collagen on the adhesion, proliferation, and osteoblastic gene expression of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Chin. J. Traumatol., 2004, 7, 6: 358-362 .

13. Mizuno M., Kuboki Y. Osteoblast-related gene expression of bone marrow cells during the osteoblastic differentiation induced by type I collagen. J. Biochem., 2001, 129, 1: 133-138 .

14. Ponticiello M.S., Schinagl R.M., Kadiyala S., Barry F.P. Gelatin-based resorbable sponge as a carrier matrix for human mesenchymal stem cells in cartilage regeneration therapy. J. Biomed .

Mater. Res., 2000, 52: 246-255 .

15. Пирс Э. Гистохимия. Москва, 1962, 962 с .

16. Abramoff M.D., Magelhaes P.J., Ram S.J. Image processing with ImageJ. Biophoton. Int., 2004, 11: 36–42 .

17. Стрелков Р.Б. Таблицы Стрелкова и экспресс-метод статистической обработки данных. Москва, 1999, 96 с .

18. Salasznyk R.M., Williams W.A., Boskey A., Batorsky A., Plopper G.E. Adhesion to Vitronectin and Collagen I Promotes Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells .

J. Biomed. Biotechnol., 2004, 1: 24-34 .

19. Ogura N., Kawada M., Chang W., Zhang Q., Lee S., Kondoh T., Abiko Y. Differentiation of the human mesenchymal stem cells derived from marrow and enhancement of cell attachment by fibronectin. J. Oral Sci., 2004, 46: 207-213 .

20. Phinney D.G., Kopen G., Isaacson R.L., Prockop D.J. Plastic adherent stromal cells from the bone marrow of commonly used strains of inbred mice: variations in yield, growth, and differentiation. J. Cell Biochem., 1999, 72: 570–585 .

21. Moursi A.M., Damsky C.H., Lull J., Zimmerman D., Doty S.B., Aota S.-I., Globus R.K .

Fibronectin regulates calvarial osteoblast differentiation. J. Cell Sci., 1996, 109: 13691380 .