«ПИМЕНОВ Николай Васильевич Разработка средств и совершенствование методов лечения и профилактики сальмонеллеза птиц ...»

На правах рукописи

ПИМЕНОВ Николай Васильевич

Разработка средств и совершенствование методов

лечения и профилактики сальмонеллеза птиц

03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии),

06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология,

эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Москва, 2012

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И.Скрябина» (ФГБОУ ВПО МГАВМиБ) .

Научный консультант: доктор ветеринарных наук, профессор Субботин Владимир Викторович

Официальные оппоненты:

Бессарабов Борис Филиппович – доктор ветеринарных наук, профессор, ФГБОУ ВПО МГАВМиБ, профессор кафедры птицеводства и болезней птиц;

Золотухин Сергей Николаевич – доктор биологических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия имени П.А.Столыпина», профессор кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы, заведующий лабораторией прикладной микробиологии и бактериофагии Научно-исследовательского инновационного центра микробиологии и биотехнологии;

Ирза Виктор Николаевич – доктор ветеринарных наук, профессор, ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», заведующий лабораторией эпизоотологии и мониторинга .

Ведущая организация: Государственное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» .

Защита состоится « 24 » декабря 2012 г. в_1400 _часов на заседании диссертационного совета Д 220.042.01 при ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» по адресу: 109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, 23;

тел. (495) 377-93-83 .

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО МГАВМиБ (109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, 23) .

Автореферат разослан «__04__»___октября____2012 г. и размещен на сайте http://www.vak.ed.gov.ru .

Ученый секретарь диссертационного совета, профессор Грязнева Т.Н .

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. По заключению экспертов Всемирной организации здравоохранения сальмонеллез, как зоонозная инфекция, не имеет себе равных по сложности эпизоотологии, эпидемиологии и трудностям борьбы с ним. Хозяйства, сталкиваясь с проблемой сальмонеллеза, несут большие потери из-за смертности молодняка, снижения продуктивности, качества продукции и наложения ограничительных мероприятий на выпуск продукции. Обсемененные сальмонеллами яйца и мясо птиц являютсяосновными причинами пищевых токсикоинфекций у людей .

Эффективность проводимых мероприятий против сальмонеллеза птиц недостаточна. Антибиотикообработки не позволяют избавить птицу от сальмоносительства, не способны профилактировать и ликвидировать инфекцию, а предотвращают лишь массовое клиническое проявление заболевания (Ленев С.В., Малахов Ю.А., 1995; Куриленко А.Н. 2003; Данилевская Н.В., 2007; WHO,1991; Bole-Hribovsek V., 1998) .

Требует совершенствования специфическая профилактика сальмонеллеза птиц с использованием средств активной иммунизации. Не разработана эффективная система специфических мероприятий по борьбе с сальмонеллезом в условиях непромышленного, мелкофермерского, частного птицеводства разных направлений и голубеводства .

Цель и задачи исследований. Целью настоящих исследований являлись разработка средств и методов лечения и профилактики сальмонеллеза птиц, совершенствование системы противоэпизоотических мероприятий, направленных на борьбу с сальмонеллезом птиц .

Для достижения поставленной цели были определены задачи:

1. Выяснить этиологическую структуру сальмонеллеза птиц разных видов, изучить биологические свойства и антибиотикорезистентность возбудителя .

2. Определить вирулентные и иммуногенные изоляты возбудителя со свойствами производственных и контрольных штаммов, провести их депонирование .

3. Определить технологические параметры изготовления и эффективность применения инактивированной вакцины против сальмонеллеза голубей .

4. Выделить и провести селекцию, изучение морфологической структуры и биологических свойств бактериофагов со свойствами производственных штаммов .

5. Сконструировать препараты бактериофагов против сальмонеллеза птиц, оценить их терапевтическую эффективность .

6. Разработать метод для лечения сальмонеллеза птиц с использованием препаратов бактериофагов и пробиотика .

7. Сконструировать и определить оптимальную иммунизирующую дозу ассоциированной вакцины против сальмонеллеза и ньюкаслской болезни птиц .

8. Разработать технологическую схему производства вакцины ассоциированной инактивированной против сальмонеллеза и болезни Ньюкасла птиц .

9. Провести доклинические и клинические испытания предложенной вакцины с целью ее регистрации и сертификации на территории РФ .

10. Усовершенствовать систему противоэпизоотических мероприятий по борьбе с сальмонеллезом птиц разных видов путем введения в нее разработанных средств и методов лечения и профилактики болезни .

Научная новизна. Изучена современная эпизоотическая ситуация по сальмонеллезу у птиц разных видов и направлений содержания .

Впервые проведен анализ свойств большого числа изолятов возбудителей сальмонеллеза голубей и декоративных птиц. Производственные и производственно-контрольные штаммы сальмонелл, выделенные автором, депонированы в коллекции ФГУ ВГНКИ и впервые использованы для создания средств специфической профилактики. Впервые разработана и апробирована вакцина инактивированная полиэтиленгликолевая против сальмонеллеза голубей .

Выделены бактериофаги с высокими литическими свойствами, адсорбционными свойствами, специфичностью действия, изучена их морфологическая структура, антигенное родство. Производственные штаммы бактериофагов, выделенные под руководством и с участием автора, депонированы в коллекции ФГУ ВГНКИ и впервые использованы для создания лечебно-профилактических препаратов против сальмонеллеза птиц .

Впервые разработан препарат Бактериофаг тифимуриум против сальмонеллеза голубей. Усовершенствованы лечебные средства против сальмонеллеза птиц. Впервые разработан метод селективной деконтаминации для лечения сальмонеллеза птиц с использованием предложенных препаратов бактериофагов и пробиотика лактобифадол .

Разработана и внедрена в производство и ветеринарную медицину вакцина «Виросальм» ассоциированная инактивированная против сальмонеллеза и болезни Ньюкасла голубей и декоративных птиц – новый эффективный биопрепарат, не имеющий аналогов в Российской Федерации .

Изучены биологические свойства нового вируса болезни Ньюкасла, выделенного автором, обладающего свойствами производственного штамма .

Усовершенствована система лечебно-профилактических мероприятий при сальмонеллезе птиц с использованием новых средств и методов, разработанных автором или под руководством автора .

Научная новизна работы подтверждена патентами: «Вакцина инактивированная против сальмонеллеза голубей и способ ее применения», «Препарат против сальмонеллеза голубей и способ лечения сальмонеллеза голубей», «Способ лечения птиц при сальмонеллезе, вызванном Salmonella typhimurium» .

Практическая значимость. По результатам исследований разработаны «Рекомендации по диагностике, профилактике и ликвидации сальмонеллеза кур» и «Рекомендации по диагностике, профилактике и ликвидации сальмонеллеза голубей», одобренные Департаментом ветеринарии Министерства сельского хозяйства Российской Федерации .

Вакцина «Виросальм» ассоциированная инактивированная против сальмонеллеза и болезни Ньюкасла голубей и декоративных птиц сертифицирована, зарегистрирована на территории Российской Федерации и внедрена в практику ветеринарной медицины .

Разработанные в ходе работы Бактериофаг тифимуриум против сальмонеллеза голубей, Бивалентный бактериофаг против сальмонеллеза птиц, вакцина инактивированная полиэтиленгликолевая против сальмонеллеза голубей рекомендованы для применения в качестве средств лечения и профилактики сальмонеллеза. Предложенные новые средства, а также способы их применения и метод селективной деконтаминации позволяют совершенствовать борьбу с сальмонеллезом птиц .

Материалы работы включены в «Методические рекомендации по недопущению распространения гриппа птиц и болезни Ньюкасла голубей в частных подворьях, птицеводческих хозяйствах и голубятнях», утвержденные Учебно-методическим советом ФГБОУ ВПО МГАВМиБ (пр .

№11 от 25.10.11) .

Личный вклад соискателя. Автору принадлежат непосредственное осуществление исследований этиологического профиля сальмонеллеза птиц, выделение и изучение биологических свойств изолятов сальмонелл, определение и депонирование производственных штаммов, создание вакцины инактивированной полиэтиленгликолевой против сальмонеллеза голубей, создание и внедрение вакцины «Виросальм» ассоциированной инактивированной против сальмонеллеза и болезни Ньюкасла голубей и декоративных птиц, создание бивалентного бактериофага против сальмонеллеза птиц .

Автору принадлежат организация и проведение работ по выделению бактериофагов, совместно с аспирантом Чирковой И.В. изучение их биологических свойств и депонирование производственных штаммов, разработка и испытание препарата Бактериофаг тифимуриум против сальмонеллеза голубей .

Автор принимал непосредственное участие во всех доклинических, клинических регистрационных испытаниях новых, предложенных им, средств и методов лечения и профилактики сальмонеллеза птиц .

Автору принадлежат анализ и обобщение полученных результатов, концепция совершенствования системы лечебно-профилактических мероприятий против сальмонеллеза птиц с использованием новых средств и методов .

Апробация результатов диссертации. Основные результаты исследований доложены на XI Московском международном ветеринарном конгрессе (2003), Межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых «Вклад молодых ученых в решение проблем аграрной науки» (Воронеж, 2005), на Международной школе-конференции молодых ученых «Проблемы рационального природопользования техногенного региона» (Кемерово, 2005), II Открытой Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Молодежь и наука XXI века» (Ульяновск, 2007), V Международном симпозиуме «ЕС-Россия: сотрудничество в области биотехнологии, сельского, лесного, рыбного хозяйства и пищи»

(Пущино, 2008), Междунар. научно-практической конференции «Вопросы ветеринарии и биотехнологий» (Москва, 2009), VII Международном ветеринарном конгрессе по птицеводству (Москва, 2010), Международной научно-практической конференции «Молодость, талант, знания – ветеринарной медицине и животноводству» (Троицк, 2010), IV Международной научно-практической конференции молодых ученых «Инновационные тенденции развития Российской науки» (Красноярск, 2011), Международной научно-практической конференции «Молодежь и инновации – 2011» (Горки, Беларусь, 2011), Международной российско-чешской научнопрактической конференции молодых ученых и специалистов «Актуальные вопросы ветеринарии и ветеринарной биологии» (Москва, 2012) и других .

Результаты исследований также доложены на международных, всероссийских и академических школах молодых ученых, научно-практических семинарах, методических совещаниях факультета ветеринарной медицины и факультета повышения квалификации, кафедральном и межкафедральных заседаниях ФГБОУ ВПО МГАВМиБ .

Публикации. По теме диссертации и материалам исследований опубликованы 48 научных работ, в т.ч. 20 статей в научных журналах, из которых 18 – в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, в т.ч. 3 патента, а также 1 монография, 3 рекомендации, 24 статьи в сборниках научных трудов .

Структура и объем диссертации. Материалы диссертации изложены на 307 листах машинописного текста и включают введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, сведения о практическом использовании результатов исследований, рекомендации по использованию научных выводов, список использованной литературы (301 источник, в т.ч. 153 – иностранных авторов). Диссертационная работа содержит 42 таблицы, 19 рисунков, 114 листов приложений .

На защиту выносятся следующие положения и результаты:

1. Этиологическая структура сальмонеллеза птиц разных видов в сравнительном аспекте .

2. Технология производства вакцины инактивированной полиэтиленгликолевой против сальмонеллеза голубей, ее свойства и эффективность применения .

3. Морфологическая характеристика, биологические, адсорбционные свойства и антигенное родство бактериофагов Phagum Salmonella typhimurium .

4. Технология производства и эффективность применения Бактериофага тифимуриум против сальмонеллеза голубей и бивалентного бактериофага против сальмонеллеза птиц .

5. Биологические свойства вируса ньюкаслской болезни «PN-T» .

6. Технология производства и протективная эффективность вакцины «Виросальм» ассоциированной инактивированной против сальмонеллеза и болезни Ньюкасла голубей и декоративных птиц .

7. Усовершенствованная система противоэпизоотических мероприятий против сальмонеллеза птиц разных видов, включающая метод селективной деконтаминации и способы профилактики сальмонеллеза птиц с использованием разработанных препаратов бактериофагов и вакцин .

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в 2002-2012 гг. на базе ФГБОУ ВПО МГАВМиБ .

Изучение эпизоотической ситуации, диагностические исследования, взятие материала и испытания препаратов проводили на голубятнях, в зоопарках и птицеводческих хозяйствах г. Москвы, Московской, Тульской, Владимирской, Калужской, Тверской областей, Краснодарского края, а также на базе ФГУ «Центральная научно-методическая ветеринарная лаборатория». Выделение и изучение биологических свойств изолятов сальмонелл и бактериофагов проводили на базе МГАВМиБ, ФГУ «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ ВГНКИ), НПФ «Бионит» .

Электронно-микроскопические исследования проводили на базе ГУ «Научно-исследовательский институт вирусологии имени Д.И.Ивановского РАМН». Молекулярно-генетические исследования проводили на базе ФГУ ВГНКИ. Испытания разработанных препаратов проводили на базе ФГБОУ ВПО МГАВМиБ и ООО «Торговый дом БиАгро» .

В работе использованы 71 музейный штамм бактерий, 4 производственных штамма и 129 полевых изолятов сальмонелл, 42 бактериофага, диагностические сыворотки, питательные среды, реактивы, лабораторная посуда и оборудование, животные: 2820 белых мышей, 9 кроликов, 5500 голубей, 15655 кур и цыплят, 103 утки, 95 гусей, 60 фазанов и другие птицы, СПФ куриные эмбрионы в количестве 3300, а также эпизоотологические, бактериологические, серологические, вирусологические, статистические методы исследований, методы молекулярной диагностики, электронной микроскопии и другие .

Бактериологическое исследование проводили согласно методическим указаниям по лабораторной диагностике сальмонеллезов животных и человека, утвержденным Департаментом ветеринарии МСХ РФ и Госкомсанэпиднадзором Минздрава РФ 18.06.96. Для выделения бактериофагов использовали метод обогащения, описанный Адамсом, активность фагов определяли методами Аппельмана и Грациа, адсорбционные свойства – по Адамсу, изучение морфологии вирионов фагов проводили по методике А.С. Тихоненко, определение способности бактериофагов к образованию литического фермента проводили по методу В.А. Зуева и В.В. Желтовой в модификации Л.Б. Борисова .

Контроль препаратов на стерильность, безвредность, определение токсичности биомассы и остаточной вирулентности проводили в соответствии с ГОСТами на препараты биологические. Определение антигенной активности проводили в РТГА, РНГА и РА, иммуногенной активности – путем инфицирования тест-объектов контрольными штаммами сальмонелл в дозах 5 LD50 .

Результаты исследований обрабатывали методами корреляционного, вариационного и факторного статистического анализа с использованием пакета компьютерных программ «Biostat» и «Statistica 6,0» и анализом результатов по Ашмарину И.П. и Воробьеву А.А .

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Этиологический профиль сальмонеллеза птиц При изучении эпизоотической ситуации и этиологической структуры сальмонеллеза птиц S. typhimurium выделяли в 189 из 194 случаев сальмонеллеза у голубей в 2003 г., что составило 97,4 %, 228 (93,1 %) из 245 в 2004 г., 198 (98,5 %) из 201 в 2005 г., 111 (97,4 %) из 114 в 2006 г., 128 (99,2 %) из 129 в 2007 г. и 133 из 146 случаев в 2008 году, что составило 91,2 %. Т.о. доля сероварианта S. typhimurium в этиопатогенезе сальмонеллеза голубей за 6 лет наблюдений составила в среднем 96,1 %. Доля сероварианта S. enteritidis составила за 6 лет 28 случаев из 1029 – 2,7 % .

Остальные сероварианты встречались единично и эпизоотического значения не имели .

Доля S. typhimurium от общего количества положительных исследований на сальмонеллез водоплавающих птиц составила 97,7 %. Доля других серовариантов не превышает 1 % (S. enteritidis – 0,8 % в среднем за 6 лет наблюдений). Анализ результатов исследований патологического материала от попугаев, фазанов, ворон, журавлей, страусов, индеек, перепелов и других диких, экзотических и вольерных птиц, показал также доминирующую роль S. typhimurium – 87,5 % .

Доля S. typhimurium в этиологии сальмонеллеза кур составляла 9,5 % в 2002 г.; 15,4 % в 2003 г.; 10,8 % в 2004 г.; 18,2 % в 2005 г. и 17,7 % в 2006 году. Доля S. enteritidis в этиологии сальмонеллеза кур – превалирующая (31,2 % - 51,2 %) .

Культуры сальмонелл, выделенные от птицы, обладали характерными морфологическими, тинкториальными, культуральными, биохимическими свойствами для своего рода и сероварианта. Все изоляты обладали патогенностью и широкой антибиотикорезистентностью. Спектр определения составлял по большинству изолятов не менее 25 антибактериальных препаратов различных фармакологических групп. Высокую или среднюю чувствительность среди 28 исследованных изолятов S. typhimurium отмечали только к имипенему, у половины культур – к клафорану, левомицетину, байтрилу, фурагину. К мономицину, ципрофлоксацину, азитромицину, клотримазолу, доксициклину, метронидазолу, карбенициллину, колистину, стрептомицину, белкоспире, рифампицину, канамицину, тетрациклину, линкомицину, неомицину, эритромицину большинство выделенных изолятов сальмонелл обладали резистентностью или низкой чувствительностью .

Исследованиями на белых мышах выявили наиболее вирулентные и иммуногенные штаммы сальмонелл, что в дальнейшем подтвердили и на голубях (табл. 1) .

Таблица 1. Показатели LD50 и ImD50 производственных штаммов сальмонелл для белых мышей и голубей (k=0-1,57)

–  –  –

Штаммы S. typhimurium М-2ф t, S. typhimurium М-5в t, S. typhimurium Д-1в t, S. enteritidis 25 Яв e были депонированы в ФГУ ВГНКИ в качестве производственных и производственно-контрольных .

Изготовление вакцины инактивированной полиэтиленгликолевой против сальмонеллеза голубей, контроль вакцины Необходимость создания эффективной инактивированной вакцины против сальмонеллеза голубей была продиктована отсутствием сертифицированного аналогового препарата в нашей стране и насущной востребованностью со стороны голубеводов и ветеринарной службы .

Операционная схема изготовления вакцины инактивированной полиэтиленгликолевой против салмонеллеза голубей включала следующие этапы (рис.

1):

1. Исследование свойств штаммов, контроль заявленных свойств штаммов S. typhimurium М-5в t -ДЕП, S. typhimurium Д-1в t -ДЕП, S .

enteritidis 25 Яв e –ДЕП, используемых в качестве производственных .

2. Для накопления бактериальной массы посев лиофильно высушенной культуры производственных штаммов осуществляли внесением стерильного физраствора во вскрытые ампулы и переносом в пробирки с бульоном Хоттингера. Через 24 часа инкубации при 37С проводили пересев, а на третий день – высев во флаконы с бульоном Хоттингера в соотношении 1:10 .

3. Культивирование штаммов в 6-литровых бутылях с добавлением через 4 часа 40 %-ного раствора глюкозы до 0,5 %-ной концентрации. Дальнейшее культивирование 18-24 часов с периодическим контролем чистоты роста .

4. Инактивация бульонных культур формалином из расчета 0,3 % к общему объему в течение 19-21 суток при 200С .

6. Концентрирование и декантация антигенов в приведенных ниже оптимальных условиях .

7. Определение концентрации бактериальной массы .

8. Составление серии вакцины .

9. Фасовка вакцины .

10. Упаковка и маркировка (этикетирование) вакцины .

11. Контроль вакцины на стерильность .

12. Контроль вакцины на безвредность .

13. Контроль вакцины на активность .

Опытные образцы препарата – вакцины инактивированной против сальмонеллеза голубей готовили в нескольких вариантах. Всего было изготовлено 9 опытных серий: 3 из них (серии № 1, № 2, № 3) изготовили, используя в качестве средства концентрирования антигена 50 % полиэтиленгликоль-6000 (ПЭГ-6000); серии № 4, № 5, № 6 с использованием геля гидрата окиси алюминия; серии № 7, № 8, № 9 были эмульгированными с использованием масляного адъюванта на основе масла «Markol-52» и эмульгатора №134 (Франция) .

Рис.1. Операционная схема изготовления вакцины инактивир ованной полиэтиленгликолевой против сальмонеллеза голубей Через 18-24 часов культивирования производственных штаммов определяли концентрацию биомассы и инактивировали бульонные культуры формалином, внося его до концентрации в биомассе 0,3 %. Инактивацию проводили, выдерживая бутыли в темном месте при комнатной температуре и перемешивая их содержимое ежедневно .

Осаждение бактериальных клеток проводили внесением растворов ПЭГ-6000 или геля гидрата окиси алюминия в объеме 18-20 % к объему среды. Через 72 часа проводили декантацию надосадочной жидкости в количестве 75-80 % от первоначального объема, а оставшуюся в виде осадка бактериальную массу ресуспендировали в стерильном изотоническом растворе хлорида натрия до концентрации каждого штамма 6 млрд .

мкр. кл. в 1 см3 в образцах № 2 и № 5, в образцах № 1 и № 4 – 3 млрд. мкр .

кл., в образцах № 3 и № 6 – 9 млрд. мкр. кл .

Для получения экспериментальных образцов № 7, № 8, № 9 бактериальную суспензию центрифугировали в течение 30 минут при 4000 тыс .

об./мин. Надосадочную жидкость полностью удаляли, а осадок ресуспендировали в физиологическом фосфатно-буферном растворе с рН 7,2. Бактериальную массу разводили с тем расчетом, чтобы в последующем при добавлении минерального масла в качестве эмульгатора концентрация в готовом препарате также составила 6 млрд. мкр. кл. в 1 см3 вакцины (№ 8), 3 млрд. мкр. кл. (№ 7) и 9 млрд. мкр. кл. (№ 9) .

Для проверки безвредности препарата использовали беспородных взрослых голубей, которым образцы вакцины вводили в удвоенной дозе .

При этом образцы № 1-6 вводили внутримышечно, образцы масляной вакцины № 7-9 вводили подкожно .

Наблюдения показали, что после введения голубям образцов № 1-3 у птицы не было отмечено системных реакций. При индивидуальном осмотре местных негативных признаков реакции организма на введение препарата не выявлено .

Введение голубям экспериментальных образцов № 4-6 также не провоцировало каких либо системных реакций. Однако, при индивидуальном осмотре вакцинированной птицы, у отдельных голубей на месте введения вакцины выявляли болезненные уплотнения диаметром 0,8-1,6 см. Их пальпация доставляла птице четко выраженное беспокойство. В течение последующего после вакцинации месяца у таких птиц наблюдалось отсутствие стремления к полету .

Введение образцов № 7-9 голубям в двукратной дозе подкожно в области средней трети шеи было отмечено образованием быстро развивающихся асептических абсцедирующих припуханий. При этом появившееся образование быстро смещалось в область спины, голуби становились вялыми, адинамичными. У отдельных особей отмечали искривление шеи и прогрессирующее исхудание. В последующем на месте введения отмечали фиброзные образования. Таким образом, проведенные исследования показали, что оптимальным средством концентрирования антигенов для вакцины инактивированной против сальмонеллеза голубей является полиэтиленгликоль-6000. Его использование не вызывало негативных воздействий на организм птиц .

Для определения оптимальной концентрации бактериальной массы в одной вакцинальной дозе, способной вызвать формирование напряженного иммунитета, проводили вакцинацию голубей препаратом с разной плотностью бактерийного антигена. Были сделаны опытные образцы полиэтиленгликолевой вакцины с содержанием 9х109; 7,5х109; 6х109;

4,5х109; 3х109 мкр. кл. в 1 см3 .

Вакцинировали голубей беспородных массой 280-320 г внутримышечно двукратно в дозе 0,5 см3 с интервалом 30 дней. Через 18 дней после повторной вакцинации у иммунизированных голубей брали кровь, которую исследовали в ККРА с эритроцитарными антигенами. После этого птицу инфицировали внутримышечно контрольными штаммами S. typhimurium Д-1в t в дозе 11,5 млн. мкр. кл. (5 LD50) и S. enteritidis 25 Яв е в дозе 247,7 млн. мкр. кл. (5 LD50). В качестве контрольной группы использовали 8 невакцинированных голубей, по 4 на каждый штамм. Результаты опыта отражены в таблице 2 .

Таблица 2. Определение оптимальной концентрации микробных клеток сальмонелл в вакцинальной дозе Количество выживших голубей, гол .

к количеству голубей в группе, гол .

Заражающая культура Контроль 1 группа 2 группа 3 группа 4 группа 5 группа (9109 (7,5109 (6109 (4,5109 (3109 мкр.кл.) мкр.кл.) мкр.кл.) мкр.кл.) мкр.кл.) S. typhimurium 0/4 4/4 4/4 4/4 4/4 3/4 Д-1в t S. enteritidis 0/4 4/4 4/4 4/4 4/4 3/4 25 Яв е В соответствии с данными, отраженными в таблице 2, оптимальной иммунизирующей дозой является 4,5 и 6,0 млрд. мкр. кл. в 1 см3 вакцины .

Однако в течение 3-7 дней после заражения у голубей 4 группы отмечали признаки подострого заболевания: незначительное угнетение, вялость, снижение аппетита, усиленную жажду, иногда разжиженную консистенцию помета. Признаки самопроизвольно заканчивались в течение 1 недели. Т.о., в качестве иммунизирующей дозы мы определили 6,0 млрд. мкр .

кл. инактивированных сальмонелл. При введении вакцины в дозе, содержащей данное количество клеток, у птиц вырабатывался иммунитет, способный предохранить от гибели 100 % голубей в лабораторных условиях .

На всех этапах работы по получению экспериментальных серий вакцины проводили проверки стерильности и безвредности препарата .

Лабораторное испытание вакцины инактивированной полиэтиленгликолевой против сальмонеллеза голубей (контроль иммуногенности) проводили на 20 голубях, беспородных, массой 250-280 г. Голубей опытной группы прививали вакциной в дозе 0,5 см3, голубям контрольной группы вводили стерильный изотонический раствор хлорида натрия в той же дозе. Через 21 день после инъекции проводили инфицирование голубей обеих групп внутримышечно штаммом S. typhimurium М-2ф t в дозе 5 млн .

мкр. кл (2,5 LD50). В течение 14 дней наблюдения отмечали сохранность в опытной группе – 90 % при 80 %-ной летальности в контроле .

Определение эффективности вакцины осуществляли на голубятне с поголовьем 160 птиц, в т.ч. молодняка до года – 104. В течение предшествующего исследованию года у птиц периодически отмечали случаи болезни с отказом от корма, угнетением, расстройством дефекации, появлением зеленой окраски фекальных масс. У взрослых голубей болезнь носила хронический характер, проявляясь поражением суставов ног и крыльев, у молодняка в возрасте до 3-4 месяцев – явлениями в виде дрожи, судорожных подергиваний головы, нарушения естествен-ного положения головы, опистотонуса .

Для оздоровления данной голубятни наряду с комплексом ветеринарно-санитарных мероприятий проводили вакцинацию птицы вакциной инактивированной полиэтиленгликолевой против сальмонеллеза голубей двукратно с интервалом 40 дней в дозе 0,5 см3. Больных и подозрительных по заболеванию голубей лечили цефалексином в течение 10 дней согласно результатам исследований чувствительности возбудителя к антибиотикам. В качестве контроля нами были оставлены 20 взрослых голубей без вакцинации, имевших до лечения признаки, характерные для сальмонеллеза. После лечения эти голуби были помечены и оставлены в общем помещении с основным вакцинированным поголовьем. Наблюдение вели в течение 12 месяцев. Среди контрольных птиц периодически наблюдали признаки заболевания в виде угнетения, отказа от корма, появления артритов и т.д. Первые клинические явления отмечали через 4,5 месяца после начала эксперимента. При проведении бактериологического исследования фекалий и содержимого внутрисуставных абсцессов от заболевших голубей выделяли S. typhimurium – всего от 6 птиц. При этом два голубя были вынужденно убиты. При бактериологическом исследовании из печени, селезенки, красного костного мозга выделена S. typhimurium от обоих голубей .

Среди вакцинированных птиц не было выявлено голубей с поражением суставов и другими признаками, характерными для сальмонеллеза. Случаев заболевания сальмонеллезом среди моло-дняка голубей также не выявили. Сальмонелл не выделяли .

Селекция и изучение биологических свойств высокоактивных бактериофагов к S. typhimurium Для выделения бактериофагов к S. typhimurium были отобраны и исследованы по методу обогащения пробы пометных вод и фекалий из голубятен и птицеферм Московской области, Москвы, Тулы и Тульской области в общем количестве 116. Выделены 39 бактериофагов Phagum Salmonella typhimurium, 16 из которых по методу Аппельмана обладали активностью 10-8-10-10, еще 2 бактериофага – 10-5-10-7 .

Отобранные фаги обладали широким спектром действия в отношении сальмонелл специфичного сероварианта, лизируя не менее 81 % полевых изолятов и музейных штаммов S. typhimurium, а преимущественно 90-100 % культур сальмонеллы тифимуриум (15 из 18 фагов) .

Высокие результаты литической активности у исследованных бактериофагов отмечены и к другим серовариантам сальмонеллы, этиопатогенным для птиц: к S. enteritidis лизис культур на уровне 73-93 % отмечен у 16 фагов, еще 2 бактериофага – Ph. S. typhimurium №14 ПП и №17Ф2М лизировали все 15 тестовых культур. Лизис штаммов S. gallinarumpullorum фагами отмечен на уровне 5-6 из 7 (71-85 %), S. dublin – преимущественно 3 из 4, S. newlands – 1-2 из 3. В то же время проведенные исследования не выявили ни одного случая литической активности у исследованных изолятов фагов к бактериям других родов семейства Enterobacteriaceae – Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Yersinia pseudotuberculesis, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis и к бактериям других семейств – Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes, Staphilococcus aureus. Результаты данных исследований констатируют специфичность литического действия отобранных фагов вариантами вида Salmonella enterica .

Выделенные бактериофаги характеризовались проявлением роста в виде негативных колоний преимущественно типа «А». При электронномикроскопическом исследовании мы получали ультрафотографии фагов с инструментальным увеличением в 53018 раз и фотографическом увеличении – в 1,8-4,9 раз. По морфологии структурных элементов бактериофаги отнесены к семейству Siphoviridae и четвертой морфологической группе по А.С. Тихоненко .

При исследовании адсорбционных свойств фагов на депонированных штаммах сальмонелл, выявлены выраженные свойства адсорбции на клетках хозяев. При этом наибольшие показатели скорости адсорбции – (4,96±0,05)х10-9 см3мин-1 и количества адсорбировавшихся фаговых частиц –91,7±0,25 %, отмечены у бактериофага Ph. S. typhimurium №8 МЕ, который также наиболее интенсивно формировал литический фермент .

При проведении опытов одиночного цикла развития фага Ph. S .

typhimurium №5 ТЗ среднее число негативных колоний в разведении 1:40 составляло 30-32 на протяжении 22 минут, с 26 минуты отмечался выраженный рост, на 28 минуте появлялись негативные колонии в чашках, засеянных из разведения 1:100, и на 30 минуте проявляется полный лизис колоний в посевах из второго разведения (1:40). Таким образом, конец латентного периода начинает проявляться на 24-25 минутах и стабилизируется за 8 минут. Среднее число негативных колоний, полученных из разведения фага 1:100 – 132, т.е. по окончании лизиса бактерий количество фаговых частиц составило 13200 в 0,1 мл материала. Средний выход фага рассчитывали отношением количества выхода бактериофага к исходному количеству в латентный период. Для Ph. S. typhimurium №5 ТЗ он составил

426. Штаммы Ph. S. typhimurium №8 МЕ, Ph. S. typhimurium №9 ММ аналогично обладали выраженной интенсивностью формирования литического фермента, минимальным латентным периодом внутриклеточного развития, высокой урожайностью, периодом стабилизации лизиса 6-8 минут, скоростью адсорбции 4,0-4,96 х 10-9 см3мин-1. Полученные результаты свидетельствует о том, что данные штаммы могут быть использованы в качестве производственных, в связи с этим они были депонированы в коллекции ФГУ ВГНКИ .

Полученные гипериммунные сыворотки на производственные штаммы бактериофагов проявляли нейтрализующую активность в разведениях 1:5Константы скорости нейтрализации фагов с гомологичными антисыворотками были 240,21-270,26 мин-1, с гетерологичными антисыворотками – 124,42-163,67 мин-1. Т.о. штаммы Ph. S. typhimurium №5 ТЗ, Ph. S .

typhimurium №8 МЕ, Ph. S. typhimurium №9 ММ являются родственными и обладают выраженной иммуногенностью .

Создание фагового препарата против сальмонеллеза голубей Работа по разработке и созданию препарата выполнялась совместно с Чирковой И.В. Препарат Бактериофаг тифимуриум против сальмонеллеза голубей готовили, производя высев в разные емкости с предварительно нагретым до 37°С и разведенным 1:5 МПБ суспензий 6-часовой культуры S. typhimurium М-2ф t и фильтрата каждого из депонированных бактериофагов .

Культивирование фагов на молодых культурах сальмонелл проводили 18 часов, после чего осуществляли очистку культуральной жидкости от биомассы сальмонелл, остатков клеток и компонентов питательной среды .

Следующим этапом осуществляли центрифугирование при 6000 об./мин. в течение 30 минут, фильтрацию через системы бактериальных фильтров Шамберленда и приготовление концентрированной суспензии бактериофагов. Контролем служили отсутствие роста при посеве суспензии бактериофагов в разведенный МПБ и рост сальмонеллы без фагов по выраженной мутности питательной среды .

В качестве консерванта приготовленной суспензии фагов применяли раствор хинозола до его конечной концентрации в фаголизате – 0,01 % .

Готовый препарат формировали смешиванием консервированных суспензий бактериофагов Ph. S. typhimurium №5 ТЗ, Ph. S. typhimurium №8 МЕ и Ph. S. typhimurium №9 ММ в соотношении 1:1:1. Контроль на стерильность осуществляли высевом на МПА и в МПБ по отсутствию роста после 18-20-часовой инкубации при температуре 37°С. Контроль на активность осуществляли на белых мышах массой 14-16 г, для чего 10 мышам подкожно вводили S. typhimurium M-2ф t в дозе 10 тыс. мкр. кл. (5 LD50) .

Спустя 20 минут мышам подкожно вводили Бактериофаг тифимуриум против сальмонеллеза голубей в дозе 0,5 см3, что соответствует 104 фаговых частиц. Контрольной группе – 10 голов белых мышей, вводили только культуру сальмонеллы в аналогичной дозе. За лабораторными животными наблюдали 8-10 дней, павших мышей вскрывали, проводили бактериологический анализ .

Контроль осуществляли для каждой экспериментальной серии приготовленного препарата (всего более 24). При контроле активности сохранность белых мышей в опытных группах составляла 100 %, в контрольных группах отмечали гибель 90-100 % мышей, из патологического материала которых была выделена S. typhimurium .

Создание бивалентного бактериофага против сальмонеллеза птиц Для создания бивалентного бактериофага против сальмонеллеза птиц были использованы фаги к S. enteritidis, выделенные нами при исследовании по методу обогащения 52 проб сточных вод из цехов содержания молодняка и маточного поголовья птицефабрик и депонированные ранее в ФГУ ВГНКИ в качестве производственных .

Бивалентный бактериофаг против сальмонеллеза птиц готовили по аналогичной схеме, смешивая в конечный препарат консервированные суспензии 3 фагов тифимуриум и 3 фагов энтеритидис в равных соотношениях (рис. 2) .

Исследования на активность бивалентного бактериофага осуществляли на белых мышах массой 14-16 г. Для этого формировали 3 опытные и 3 контрольные группы мышей по 10 голов. В первых группах инфицирование перед фагообработкой проводили S. typhimurium M-2ф t в дозе 10 тыс .

мкр. кл. (5 LD50), во вторых – S. enteritidis 25 Яв e в дозе 70 тыс. мкр. кл. (5 LD50), в третьих – обоими штаммами в дозах по 2,5 LD50 .

В опытных группах, где вслед за летальной дозой культуры возбудителя вводили бивалентный бактериофаг, сохранность составила 90-100% .

При этом, по окончании периода наблюдения – 14 дней и бактериологическом исследовании всех мышей опытных групп, бактерий рода Salmonella не выделяли. В контрольных группах, инфицированных как монокультурами, так и (в третьей группе) смесью штаммов обоих серовариантов, гибель мышей была максимальной, составила 90-100 % .

Аналогичные исследования провели с голубями .

Рис. 2. Схема изготовления бивалентного бактериофага против сальмонеллеза птиц Сохранность голубей в опытных группах стабильно составляла 90-100 % при сохранности в контрольных группах без фагообработки – 0-10 % .

Летальные случаи в опытных группах могли быть спровоцированы сальмонеллезными токсинами, т.к. гибель птицы отмечали в первые (2 опытная группа) и вторые (3 опытная группа) сутки после начала эксперимента, что не характеризует развитие инфекционного процесса .

Проведенные исследования бактериологическими методами материала от птицы в опытных группах спустя 14 дней после начала эксперимента не выявили культуры сальмонелл ни у павших, ни у выживших голубей, тогда как у всех птиц в контрольных группах были выделены изоляты рода Salmonella серовариантов соответственных инфицированию. Причем в третьей опытной группе, где заражение проводилось культурами двух серовариантов, в 60% была выделена S.typhimurium, не смотря на меньшее количество введенных микробов. Гибель голубей в контрольных группах проходила, начиная с 3-4 до 10-12 суток эксперимента, как правило, после развития клиники угнетения, одышки, отказа от корма, быстрой потери массы, диареи серо-зеленого цвета, потери координации движений, развития опистотонуса или нехарактерных колебательных движений головой .

Эффективность метода селективной деконтаминации для лечения сальмонеллеза птиц с использованием бактериофагов и пробиотика лактобифадол Для эффективного оздоровления хозяйств от сальмонеллеза нами разработан метод селективной деконтаминации, основанный на санировании организма птиц разных видов с одновременным использованием препаратов бактериофагов против сальмонеллеза и пробиотика лактобифадол .

Лактобифадол содержит живые микробные клетки бифидобактерий вида Bifidobacterium adolescentis и живые микробные клетки лактобактерий Lactobacillus acidophilum. Штаммы отличаются выраженными антагонистическими свойствами к патогенным бактериям, имеют выраженные адгезивные свойства, устойчивы к широкому диапазону рН, устойчивы к желчи, фенолу, повышенной концентрации хлорида натрия, имеют выраженную кислотообразующую, антагонистическую, биохимическую и ферментативную активность, образуют органические кислоты, витамины, ферменты, повышающие продуктивность и конверсию корма у животных и птиц. Сочетание конкурентного действия на патогенную микрофлору лактобифадола со специфическим литическим действием Бактериофага тифимуриум или бивалентного бактериофага обеспечивает выраженный лечебный и профилактический эффект против сальмонеллеза птиц .

Метод селективной деконтаминации был апробирован при пероральном применении птице Бактериофага тифимуриум и лактобифадола .

Испытание метода в остром опыте проводили на 30 цыплятах 14дневного возраста, для чего были созданы 3 группы по 10 голов – 2 опытные и контрольная. Птицу в группах кормили и содержали по принципу аналогов. Инфицирование цыплят проводили смесью из свежих культур штаммов S. typhimurium Д-1в t и S. typhimurium М-2ф t орально в дозе 2 млрд. мкр. кл .

После появления клинических признаков заболевания, проявлявшихся в потере аппетита, одышке, взъерошенности оперения, иногда – диарее, цыплятам первой опытной группы орально вводили Бактериофаг тифимуриум из расчета 0,5 см3, что соответствует 104-105 фаговых частиц, индивидуально при помощи автоматической пипетки-дозатора. Обработку проводили трижды с интервалом 12 часов, а затем еще дважды с интервалом 48 часов. За три часа до выпойки препарата цыплят выдерживали без поения. Лактобифадол вводили в корм из расчета 1,0 г на всех цыплят опытной группы ежедневно в течение 10 дней в виде формы препарата на отрубях. Цыплятам второй опытной группы использовали метод лечения с применением энрофлоксацина – энрофлон 10 %-ный раствор в дозе 0,5 см3 на 1 л воды 5 дней согласно «Наставлению по применению энрофлона 10 % раствора для орального применения», утвержденному Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 14.07.98 г. Цыплят контрольной группы препаратами не обрабатывали .

За птицей наблюдали 15 дней, после чего проводили убой. Исследования показали, что в контрольной группе цыплят летальность составила 90%. Павшие цыплята имели характерные патологоанатомические изменения. При бактериологическом исследовании у всех 10 цыплят контрольной группы была выделена S. typhimurium (табл. 3) .

Таблица 3. Эффективность применения Бактериофага тифимуриум и лактобифадола в лабораторных условиях Кол-во цыплят, из коКол-во Пало, Сохран- торых выделена кульГруппа тура S .

typhimurium гол. гол. ность, % голов % Опытная 1 (Бактериофаг тифимуриум + лактобифадол) Опытная 2 (энрофлоксацин) 10 3 70 2 20 Контрольная 10 9 10 10 100 Испытание метода селективной деконтаминации в «полевых» условиях проводили на неблагополучных по сальмонеллезу голубятнях Подольского и Домодедовского районов Московской области. Диагноз был подтвержден бактериологически – выделена культура S. typhimurium, и методом молекулярной диагностики – положительные результаты ПЦР с пометом и смывами из клоаки у клинически больных и здоровых птиц .

В голубятне Домодедово отмечали полную заболеваемость среди молодняка 2-3-месячного возраста, полученного от основных самок. Общая заболеваемость по птицепоголовью голубятни составила 80 % (120 из 150 голубей). Летальность составила 65 % (пали 78 из 120 заболевших голубей). До начала терапевтических мероприятий методом селективной деконтаминации владельцем голубятни принимались попытки по лечению птицы в виде выпоек энрофлона и бактисубтила, что ослабило развитие эпизоотического процесса, но не остановило инфекцию и появление новых случаев болезни .

Выпойку Бактериофага тифимуриум в неблагополучной голубятне проводили согласно разработанной и использованной в лабораторном эксперименте схеме. Лактобифадол в виде мучной формы давали с кормом из расчета 0,4 г на 1 кг массы птицы в течение первых 10 дней лечения, далее

– в дозе 0,2 г на 1 кг массы птицы еще в течение 20 суток .

Случаи гибели птицы прекратились со вторых суток применения предложенного способа лечения. В течение 4 суток состояние птицы нормализовалось. При бакисследованиях смывов из клоаки от 50 голубей через 30 дней бактерий рода Salmonella не выявляли .

В двух голубятнях Подольского района на поголовье в 175 голубей пород пермские, свердловские, гривуны и синие выявили заболеваемость 14,3 %. Ежедневный отход составлял до 3 голубей (1,7 %). При этом вспышка была отмечена на фоне применения владельцем байтрила. С третьих суток после начала лечения Бактериофагом тифимуриум против сальмонеллеза голубей и лактобифадолом состояние больных голубей стабилизировалось, появилась активность, восстановился аппетит, дефекациия нормализовалась. Через 14 дней при исследовании 47 проб (27,3 %) фекалий от голубей бактерий рода Salmonella не выделяли. Через 30 дней после проведения терапевтических мероприятий в ПЦР с 20 пробами материала от излеченных голубей и со сборными пробами помета положительных результатов на сальмонеллез не регистрировали .

Пример терапевтической эффективности применения Бактериофага тифимуриум и пробиотика лактобифадол отмечали на птице разных видов вольерного содержания передвижного частного зоопарка «Ташир». У фазанов 4-5-месячного возраста проявлялся жидкий помет зеленого цвета, птицы отставали в росте и развитии. Взрослая птица имела матовое взъерошенное оперение. Из 28 фазанов разных пород у 6 (21 %) отмечали картину острого заболевания – повышение температуры тела до 43,0 °С, угнетение, снижение аппетита, взъерошенность оперения, одышку, диарею. 2 фазана 3-месячного возраста пали. В 25-40-дневном возрасте среди утят отмечали развитие угнетения, анорексию, диарею серо-желтого цвета с примесью крови. Летальность молодняка составила 62,5 %. Из патологического материала выделена S. typhimurium .

Выпойку Бактериофага тифимуриум против сальмонеллеза осуществляли групповым способом всей птице зоопарка «Ташир» из расчета: перепелам – по 0,5 см3 препарата, фазанам, уткам – по 1,0 см3, селезням, павлинам – по 3,0 см3, гусям и лебедям – по 5,0 см3 трижды с интервалом 12 часов, затем четвертую и пятую выпойки – через 48 часов. Препарат растворяли в воде из расчета 1:20. Лактобифадол давали ежедневно всей птице в формах, сорбированных на муке и на отрубях, по схеме .

Констатировали улучшение состояния птицы на 3 сутки, температура тела стабилизировалась в пределах физиологических норм, восстановился аппетит, помет оформился и приобрел характерную серо-коричневую окраску. Заболеваемость и гибель птицы больше не отмечали в течение 5месячного периода наблюдения .

Создание вакцины «Виросальм» ассоциированной инактивированной против сальмонеллеза и ньюкаслской болезни птиц Создание ассоциированной инактивированной вакцины против сальмонеллеза и болезни Ньюкасла птиц обосновано удобством применения и контроля иммунизации, возможностью точного дозирования, что является основополагающим фактором при профилактической противоэпизоотической работе с малыми поголовьями и ценной птицей. Такая вакцина обеспечивает напряженный иммунитет на длительный период против двух основных инфекционных болезней птиц, протекающих нередко совместно, снижение трудоемкости и повышение экономической эффективности ветеринарных мероприятий, снижение вероятности поствакцинальных осложнений, реактогенности и развития суперинфекции при иммунизации по инфицированному фону. При применении инактивированной вакцины исключается циркуляция живых вакцинных штаммов, провоцирующих положительные результаты контрольных, надзорных и мониторинговых исследований с наложением ограничений на хозяйство (ферму, вольер), а также провоцирующих снижение воспроизводительных качеств декоративных птиц .

Схема технологического процесса производства вакцины ассоциированной инактивированной против сальмонеллеза и болезни Ньюкасла голубей и декоративных птиц представлена на рисунке 3.

Производственный процесс включал следующие этапы:

1. Приготовление питательной среды для культивирования штаммов сальмонелл – бульона Хоттингера или триптон-соевого бульона .

2. Приготовление посевного материала. Производственные штаммы высевали в МПБ, а через 2-3 часа пересевали во флаконы с бульоном Хоттингера или триптон-соевым бульоном. Затем проводили посевы второй и третьей генерации до получения максимальной концентрации сальмонелл. Одновременно делали контрольные посевы на МПБ, МПА, МППБ под вазелиновым маслом, среду Сабуро .

3. Инактивация микробных клеток сальмонелл. Полученную в результате культивирования бактериальную массу сальмонелл перекачивали в стерильные ёмкости разного объема, добавляли 0,3 % формалина (с содержанием формальдегида не менее 37 %) по объёму и тщательно перемешивали. Инактивацию бактериальной массы проводили в течение 21 дня при температуре 20-22С с ежедневным перемешиванием. Контроль полноты инактивации проверяли путем посевов бактериальной массы на МПА, МПБ, МППБ под вазелиновым маслом и среду Сабуро, а также путем инокуляции полученной взвеси белым мышам подкожно в объеме 0,5 см3. Белые мыши при этом оставались живыми и клинически здоровыми в течение 10 суток наблюдения. При выявлении нарушений стерильности объем полученного антигена забраковывали .

4. Концентрирование, очистку и стандартизацию сальмонеллезных антигенов проводили путем осаждения микробных клеток 50 %-ным раствором ПЭГ-6000 в течение 48-72 часов и декантирования надосадочной жидкости, удаляя 80-85 % объёма. В полученной массе устанавливали концентрацию микробных клеток (для каждого штамма отдельно) и разводили стерильным фосфатно-буферным раствором до конечной концентрации 6х109 мкр. кл. в 1,0 см3 .

5. Исследование токсичности биомассы. Для этого бактериальную суспензию сальмонелл, осажденную полиэтиленгликолем, ресуспендировали до концентрации 12х109 мкр. кл. в 1 см3 0,85 %-ного раствора хлорида натрия. Токсичность инактивированной бактериальной массы определяли на 30 белых мышах массой 16-18 г в трех группах путем подкожной инъекции суспензии в объеме 0,5 см3 с концентрацией 3х109 мкр. кл./см3, 6х109 мкр. кл./см3, 12х109 мкр. кл./см3. Также токсичность определяли на 10 голубях 3-4-месячного возраста породы тульские синие массой 160-180 г путем подкожной инъекции суспензии в аналогичных концентрациях .

Все мыши и голуби оставались живы и клинически здоровы в течение 10 дней наблюдения .

–  –  –

Рис.3. Технологическая схема производства вакцины «Виросальм»

6. Получение вируссодержащей эмбриональной жидкости. Для изготовления опытных образцов вакцины использовали штамм вируса ньюкаслской болезни «Н» или его аналог – авторский штамм, названный «PNT». Вирус болезни Ньюкасла (голубиный вариант) PN-T выделен нами из трупа голубя в 2003 году, активен в РН, РТГА, патогенен для СПФ куриных эмбрионов, реактогенен для цыплят моложе 2-х месяцев. В качестве оптимальной защитной среды для вируса PN-T нами экспериментально определено обезжиренное молоко, сохраняющее титр после сушки инфекционности вируса 7 ЭЛД50/ см3 и титр в РГА 6,0 log2 .

При сравнении нуклеотидных последовательностей в области F0 гена и сопоставлении аминокислотных последовательностей фрагмента F0 предшественника выявлено, что штамм PN-T имеет сайт, характерный для вирулентных штаммов 112-RRQKRF-117. Уровень гомологии проанализированного нуклеотидного фрагмента штамма PN-T с аналогичными областями производственных вакцинных штаммов вируса ньюкаслской болезни колеблется от 80 % до 87 %, что является показателем высокой степени отличий авторского штамма PN-T .

Для получения вируссодержащего материала в аллантоисную полость заражали 9-10-тисуточные куриные эмбрионы, которые затем помещали в термостат с температурой 37,0±0,5°С и относительной влажностью 60-70 % на 47-48 часов. Овоскопирование проводили 2 раза в сутки. Эмбрионы, павшие в течение 24 часов, утилизировали .

Перед сбором вируссодержащего материала эмбрионы охлаждали при температуре 4-6°С в течение 12 часов. Экстраэмбриональную вируссодержащую жидкость собирали во флаконы в стерильных условиях. Исследовали титр вируса. Для дальнейшей работы и инактивации допускали вируссодержащий материал с исходным титром в пределах от 8,5 lоg2 до 9,0 lоg2 вируса «Н» и от 7,5 до 9,0 lоg2 вируса «PN-T» .

Из полученного вируссодержащего материала отбирали пробы для проведения контролей, а оставшуюся часть инактивировали путем добавления в нее 0,1 %-ного раствора формалина с содержанием активного формальдегида не менее 37 %. Контроль на наличие контаминации проводили посевами на МПА, МПБ, МППБ под вазелиновым маслом, тиогликолевую среду, среду Эдвардса, среду Сабуро. Параллельно проводили проверку гемагглютинирующей активности экстраэмбриональной жидкости .

Для изготовления вакцины допускали вируссодержащий материал с гемагглютинирующим титром не ниже 6,0 log2 .

7. Контроль качества готового препарата осуществляли исследованиями стерильности, безвредности, антигенности и иммуногенности .

8. Изготовление серии вакцины. Для изготовления серии вакцины проводили объединение суспензии сальмонелл (при концентрации 6х109 мкр .

кл. и соотношении штаммов 1:1:1) и вируссодержащей эмбриональной жидкости до получения в готовом препарате 90 % суспензии бактериальных клеток и 10 % эмбриональной жидкости по объему .

9. Фасовка. Полученную серию вакцины расфасовывали в стерильных условиях на базе биопредприятия ООО «Торговый дом «БиАгро» в стерильные стеклянные флаконы по 10,0 и 20,0 см3 (20 и 40 доз соответственно) по ТУ 9467-003-05749470-94 или в ампулы соответствующей вместимости. При регистрации в ФГУ ВГНКИ вакцине определено название «Вакцина «Виросальм» ассоциированная инактивированная против сальмонеллеза и болезни Ньюкасла голубей и декоративных птиц» .

Исследования по безопасности рекомендуемой прививочной дозы, при передозировке и повторном введении вакцины проводили при подкожном введении препарата 10-и белым мышам весом 18-20 г в объёме 0,3 см3, 0,5 см3 по 5 голов на каждую дозу, взрослым беспородным голубям массой 250-350 г, 3-4-месячным голубям породы синий массой 120-150 г путем внутримышечного введения вакцины в объеме 0,5 см3; 1,0 см3; 2,0 см3. Использовали по 5 голубей в каждой группе. Учет результатов проводили на 1, 2, 10 сутки. Все лабораторные объекты оставались живы и здоровы. При убое в месте инъекции вакцины не отмечали никаких морфологических изменений. Исследования подтвердили безвредность вакцины и при повторном введении в рекомендуемой и удвоенной дозах .

Изучение антигенных и иммуногенных свойств вакцины «Виросальм»

Для изучения антигенных и иммуногенных свойств вакцины «Виросальм» формировали по принципу аналогов 2 группы голубей, беспородных, 3-8-месячного возраста, массой 220-350 г. Опытной группе (10 голов) вводили внутримышечно вакцину «Виросальм» в рекомендованной дозе с последующей ревакцинацией через 30 дней. Контрольной группе (5 голубей) инъецировали стерильный физиологический раствор. До инъекции и на 14, 30, 60, 90, 150, 210, 270 сутки после повторного введения у голубей из подкрыльцовой вены брали кровь для серологических исследований .

Исследования в РТГА к вирусу ньюкаслской болезни показали, что средний титр антител в опытной группе составил на 14 сутки – 6,4±0,22 log2, 30 сутки – 6,5±0,17 log2, 60 сутки – 5,8±0,20 log2, 90 сутки – 5,5±0,27 log2, 150 сутки – 4,3±0,15 log2, 210 сутки – 3,5±0,17 log2, 270 сутки – 2,6±0,31 log2. В контрольной группе титры были нулевыми весь период наблюдения. Данные исследования были проведены на птице других видов и подтвердили выраженные антигенные свойства вакцины «Виросальм». Максимальные титры отмечали у перепелов и цыплят, в течение всего периода наблюдения они превышали 5 log2. Уровень антигенной напряженности у остальных птиц плавно снижался от 7-9 log2 в первый месяц после вакцинации до 2-5 log2 к одиннадцатому месяцу .

Антигенную активность вакцины «Виросальм» по сальмонеллезным компонентам оценивали при постановке РА. Положительной оценкой считали наличие титра антител не менее чем на два креста. На 14, 30, 60, 90, 150, 210 и 270 сутки после повторного введения вакцины у голубей опытной группы отмечали положительные результаты в РА с антигенами S .

typhimurium и S. enteritidis, оцененные на ++++ и +++. В сыворотке крови голубей контрольной группы при аналогичных исследованиях отмечали отрицательные и сомнительные результаты в РА .

При определении иммуногенной активности вакцину в дозе 0,5 см3 вводили 20 интактным голубям опытных групп внутримышечно двукратно с интервалом 35 дней. В качестве контрольных использовали 10 невакцинированных голубей, которым вводили стерильный физраствор в той же дозе и содержали в аналогичных опытной группе условиях. Через 12суток после повторной иммунизации голубей инфицировали контрольно-производственны-ми штаммами в дозах 5 LD50. В опытных группах получена сохранность 90-100 % при полной гибели птицы в контрольных группах. При бактериологическом исследовании из патматериала от трупов голубей были выделены в соответствующих группах культуры S .

typhimurium и S. enteritidis. Опыт был проведен в аналоговых условиях еще дважды, полученные результаты были аналогичными, что свидетельствует о высоких иммуногенных свойствах вакцины «Виросальм» .

При использовании вакцины «Виросальм», хранившейся согласно инструкции по применению при 4°С в течение 6, 12, 18, 24 месяцев, не выявлено достоверных изменений значений антигенных и иммуногенных свойств, что характеризует стабильность вакцины при хранении .

Эффективность применения вакцины «Виросальм»

в производственных условиях В КФХ «Барбасов» Наро-Фоминского района Московской области вакцинации подвергли 76 голубей породы типлеры разных возрастных групп, 52 молодки и курицы кросса Ломан-браун, 23 утки породы пекинские, гусей породы горьковские и индеек породы белые широкогрудые (легкий кросс). Вакцину «Виросальм» вводили дважды с интервалом 28 дней по одной вакцинной дозе 0,5 см3 голубям, курам и уткам, 43 гусятам в возрасте 3-4 мес., 19 индюшатам в возрасте 62 дней; по 1,0 см3 взрослой птице массой более 4 кг – 14 гусям и 7 индейкам. Наблюдение за птицей вели в течение 8 месяцев, фиксировали случаи заболеваемости. Перед применением вакцины и на 30, 100, 150 и 200-е сутки после повторной вакцинации у голубей и кур (по 4 пробы) исследовали кровь в РТГА, определяли титры антител к вирусу ньюкаслской болезни и к парамиксовирусу типа 2. Результаты исследований приведены в таблице 4 .

Таблица 4. Антигенная активность вакцины «Виросальм» к вирусу ньюкаслской болезни в условиях КФХ «Барбасов»

Вид Средние титры антител в РТГА к вирусу болезни Ньюкасла в период исследований, log2 птицы До вакцисутки 100 сутки 150 сутки 200 сутки нации Куры 9,00±0,41 8,75±0,25 7,00±0,41 0 7,75±0,25 Голуби 5,75±0,63 5,25±0,25 5,25±0,25 4,00±0,41 Как видно из таблицы 4, титры антител к вирусу болезни Ньюкасла в период исследований находились на высоком уровне. Титры антител к парамиксовирусу типа 2 не менялись и оставались в пределах 0-2 log2 .

До вакцинации у птицы КФК «Барбасов» отмечали отход молодняка с признаками расстройства пищеварения, «вертячки» у голубей, одышки, угнетения. После вакцинации в период наблюдения 8 месяцев не отмечено ни одного случая заболевания кур, голубей, уток, гусей и индеек ньюкаслской болезнью и сальмонеллезом, в т.ч. – у полученного в период наблюдения молодняка .

Сохранность птиц составила: цыплят и кур – 100 % (к 93,4 % в период предыдущих 9 месяцев), голубей – 100 % (к 61,8 %), уток – 100 % (к 96,6 %), гусей – 98,2 % (1 случай гибели гусенка по причинам травматического характера) к 81,6 % в аналогичный период, индеек 100 %. Контрольные исследования на сальмонеллез со сборными пробами помета на 30, 100, 150 и 200 сутки после повторной вакцинации в ПЦР и бактериологическими методами были отрицательными .

В условиях ОАО «Птицефабрика «Тульская» вакцину применяли на группе 15500 цыплят кросса Ломан-браун 20-суточного возраста внутримышечно дважды с интервалом 30 дней в дозе 0,5 см3. Предварительно у 40 произвольно выбранных цыплят из группы были отобраны пробы крови для получения сыворотки и исследования на наличие остаточных антител к вирусу болезни Ньюкасла. Цыплят с титрами антител 2 и более log2 до вакцинации из группы исследуемых исключали. 10 цыплят были сформированы в качестве контрольной группы, их не вакцинировали. Сыворотку крови исследовали в РНГА на наличие антител к вирусу ньюкаслской болезни на 14, 30, 60 и 100-е сутки после проведения вакцинации .

Результаты исследований представлены в таблице 5 .

Титры цыплят контрольной группы, содержавшихся совместно со всей птицей, показывают, что в цехе отсутствует циркуляция вируса болезни Ньюкасла и рост титров антител в опытной группе не спровоцирован эпизоотическим процессом. При применении вакцины «Виросальм» в производственных условиях птицефабрики не отмечали признаков реактогенности, любого рода изменений физиологического статуса птицы и местных морфологических изменений в области инъекции препарата .

–  –  –

Под контролем специалистов СББЖ ЗАО г. Москвы были проведены испытания вакцины «Виросальм» в условиях неблагополучных голубятен .

Вакцину вводили клинически здоровым голубям в дозе 0,5 см3 двукратно с интервалом 28 дней. Исследования титров антител проводили через 14, 60, 90, 150 и 210 дней после повторной вакцинации (по 10 проб сыворотки крови голубей). Динамика изменений титров антител к S. enteritidis и S .

typhimurium представлена в таблице 6 .

–  –  –

Применение вакцины «Виросальм» вызывало образование защитных антител на уровне, достаточном для предотвращения возникновения инфекции. До иммунизации у невакцинированных птиц в РТГА титр антител против болезни Ньюкасла и сальмонеллеза был на уровне менее 1 log2, после вакцинации уровень антител вырос в несколько раз и в среднем по поголовью колебался в диапазоне от 6 до 7 log2. Индекс нейтрализации у птиц, участвовавших в эксперименте, до вакцинации составил 0,2-0,42, после ревакцинации – 4,4-7,2. Уровень антител был стабильно высоким через 3 и 6 мес. после применения вакцины «Виросальм» .

Схема лечебно-профилактических мероприятий, направленных против сальмонеллеза птиц Согласно представленным данным комплекс эффективных мероприятий по профилактике сальмонеллеза птиц был дополнен специфической иммунизацией вакциной «Виросальм» инактивированной ассоциированной против сальмонеллеза и болезни Ньюкасла голубей и декоративных птиц. Осуществление вакцинации необходимо проводить по санированному фону, для чего рекомендуется применение бактериофага против сальмонеллеза (бивалентного или моновалентного в зависимости от вида птиц и эпизоотической ситуации в районе) .

Апробированная схема специфической профилактики сальмонеллеза голубей, а также водоплавающих птиц, где доминирующим возбудителем является серовариант S. typhimurium, состоит из выпойки Бактериофага тифимуриум против сальмонеллеза голубей в дозе 0,5 см3 двукратно с интервалом 72 часа и последующей иммунизацией вакциной инактивированной полиэтиленгликолевой против сальмонеллеза голубей или вакциной «Виросальм» двукратно с интервалом 28-30 дней внутримышечно в дозе 0,5 см3 .

Схема специфической профилактики сальмонеллеза кур и других птиц (индеек, индоуток, фазанов, перепелов, страусов, попугаев и т.д.) в условиях частных подворий, мелких ферм, вольеров, зоопарков, квартирноклеточного содержания включает выпойку бивалентного бактериофага против сальмонеллеза птиц двукратно в дозе 0,5 см3 с интервалом 72 часа и последующей двукратной иммунизацией вакциной «Виросальм» с 20дневного возраста с интервалом 28-30 дней .

Предложенная комплексная схема лечения и профилактики сальмонеллеза птиц успешно апробирована в условиях зоопарка ООО «Парк живой природы «До-До» Анапского района Краснодарского края, где была зафиксирована заболеваемость сальмонеллезом водоплавающих и фазаньих птиц. Болезнь отмечали в острой клинической форме у 2 фазанов охотничьих (Phasianus venaticus) трехмесячного возраста, у уток-мандаринок (Aix galericulata), пеганок (Tadorna tadorna) и каролинок (Aix sponsa) – всего 24 голов. 2 утенка 44-дневного возраста и 1 фазан 27-дневного возраста пали. При патологоанатомическом вскрытии выявлена картина катарально-геморрагического энтероколита, дистрофии печени с очагами некроза, зернистой дистрофии селезенки и почек, острой застойной гиперемии и отека легких, инъекции сосудов в головном мозге и отека мозговых оболочек. При лабораторной диагностике выделена S. typhimurium. Кроме того, из помета журавлей-красавок (Anthropoides virgo) была выделена S .

enteritidis .

Для борьбы с сальмонеллезной инфекцией были организованы и проведены общие санитарные мероприятия: дезинфекция вольеров, кормушек, предметов ухода и смотровых зон 1 %-ным раствором виркона. Для лечения и профилактики сальмонеллеза применен метод селективной деконтаминации с использованием бивалентного бактериофага и пробиотика лактобифадола. Препараты использовали всем птицам зоопарка: больным и клинически здоровым .

Проведенные мероприятия оказали выраженный терапевтический эффект. Заболеваемость птицы прекратилась уже после первичной выпойки бактериофага. Выздоровление больной птицы отмечали в течение 6-8 суток. Через 20 дней после проведения лечения были взяты контрольные анализы, культуры рода Salmonella из помета и смывов не выделяли .

Спустя 3 недели была осуществлена иммунизация клинически здоровых птиц вакциной «Виросальм» внутримышечно: уток-мандаринок – 7 голов, уток-каролинок – 4, пеганок – 2 головы в дозе по 0,5 см3; аистов белых (Ciconia ciconia) – 2 гол., журавлей: стерхов (Grus leucogeranus) – 2, серого (G. grus) – 1, японского (G. japonensis) – 1, красавок (Anthropoides virgo) – 3, черношейных (G. nigricollis) – 2; пеликанов розовых (Pelecanus onocrotalus) – 2 гол., больших гокко (кракс, Pauxi rubra) – 2 в дозе 1,0 см3;

фазанов: серебряных (Phasianus nycthemera) – 2, кавказских (P. colchicus) – 4, желто-золотых (Р. flavus) – 5 голов в дозе 0,5 см3; майн: обыкновенных (Acridotheres tristis) – 2, священных (Gracula religiosa) – 5; розовых скорцов (Sturnus roseus) – 4; турако: перса (Tauraco persa) – 2, фиолетовочубых (T .

porphyreolophus) – 2 в дозе 0,5 см3; попугаев: зеленокрылых ара (Ara chloroptera) – 4, сине-желтых ара (A.

ararauna) – 4, венесуэльских амазонов (Amazona amazonica) – 2, веерных (Deroptyus accipitrinus) – 5, бразильских черноухих (Pionus menstruus) – 2 голов в дозе 0,5 см3; африканских страусов (Struthio camelus) – 3 в дозе 5,0 см3; кур (Gallus gallus) декоративных:

шамо – 17, сибрайт – 7, китайских шелковых – 12, орпингтон – 11 голов в дозе 0,5 см3. Повторную вакцинацию проводили согласно временному наставлению через 30 дней. Ревакцинации проводили каждые 11 мес. Полученных птенцов вакцинировали с 20-дневного возраста по аналогичной схеме в половинных дозах. Перед вакцинациями птице групповым способом выпаивали бивалентный бактериофаг против сальмонеллеза птиц дважды с интервалом 72 часа и задавали с кормом лактобифадол 10 дней .

Случаев заболеваемости и падежа птицы в зоопарке ООО «Парк живой природы «До-До» с начала наблюдения и в течение 3 лет не отмечали .

При контрольных исследованиях на сальмонеллез и сальмонеллоносительство, проводимых ежеквартально бактериологическими методами и в ПЦР с пометом птицы разных видов из всех вольеров, положительных результатов не отмечали, культуры сальмонелл не выделяли .

ВЫВОДЫ

1. Для лечения и профилактики сальмонеллеза птиц научно обоснованы и клинически подтверждены метод селективной деконтаминации и последующая вакцинация, эффективность которых доказана полным оздоровлением неблагополучных по сальмонеллезу пунктов с формированием у птиц стойкого иммунитета .

2. Преобладающим этиотропным серовариантом возбудителя сальмонеллеза (87,5-97,7 %) у голубей, уток, мускусных уток, гусей, фазанов, перепелов, декоративных птиц является Salmonella typhimurium. Роль S .

typhimurium в возникновении сальмонеллеза кур является основной после S. enteritidis и S. gallinarum-pullorum. Выделенные изоляты сальмонелл обладают широкой антибиотикорезистентностью .

3. Культуры штаммов S. typhimurium М-2ф t, S. typhimurium М-5в t, S. typhimurium Д-1в t, S. enteritidis 25 Яв e обладают типичными биологическими, высокими вирулентными и иммуногенными свойствами для белых мышей и голубей, отвечают требованиям, предъявляемым к производственным и контрольно-производственным штаммам .

4. На основе штаммов S. typhimurium М-5в t -ДЕП, S. typhimurium Дв t -ДЕП, S. enteritidis 25 Яв e -ДЕП создана вакцина инактивированная полиэтиленгликолевая против сальмонеллеза голубей. Определены биотехнологические параметры изготовления вакцины и оптимальное средство концентрирования антигенов – полиэтиленгликоль-6000. Готовый вакцинный препарат с оптимальной иммунизирующей дозой 6,0 млрд. мкр .

кл. в 1 см3 является безвредным и ареактогенным для голубей, обладает выраженной иммуногенностью и протективной активностью в течение 12 месяцев .

5. Выделенные бактериофаги Phagum Salmonella typhimurium №5 ТЗ, Ph. S. typhimurium №8 МЕ, Ph. S. typhimurium №9 ММ обладают свойствами производственных штаммов: высокой литической активностью, специфичностью в отношении вида Salmonella enterica, широким диапазоном литической активности, минимальным латентным периодом внутриклеточного развития, высокой урожайностью, периодом стабилизации лизиса в течение 6-8 минут, скоростью адсорбции 4,0-4,96 х 10-9 см3мин-1. По своей структурной организации они относятся к семейству Siphoviridae, B1 морфотипу и четвертой морфологической группе по А.С. Тихоненко .

6. Полученные гипериммунные сыворотки на производственные штаммы бактериофагов проявляли нейтрализующую активность в разведениях 1:5-1:400. Константы скорости нейтрализации фагов с гомологичными антисыворотками составили 240,21-270,26 мин-1, с гетерологичными антисыворотками – 124,42-163,67 мин-1. Штаммы Ph. S .

typhimurium №5 ТЗ, Ph. S. typhimurium №8 МЕ, Ph. S. typhimurium №9 ММ являются родственными и обладают выраженной иммуногенностью .

7. На основе производственных штаммов Ph. S. typhimurium создан препарат Бактериофаг тифимуриум против сальмонеллеза голубей, обладающий выраженной активностью на модельных объектах (белых мышах): сохранность в опытных группах составила 100 % при 90-100 % гибели в контроле .

8. На основе производственных штаммов фагов тифимуриум и энтеритидис сконструирован бивалентный бактериофаг против сальмонеллеза птиц, определены технологические параметры его производства и контроля. Эффективность препарата при инфицировании контрольными штаммами S. typhimurium и S. enteritidis в дозах 5 LD50 характеризовалась 90-100 %-ной сохранностью лабораторных объектов (белых мышей, голубей) в опытных группах при 90-100 %-ной гибели в контроле .

9. Разработан метод селективной деконтаминации поголовья птиц, основанный на применении Бактериофага тифимуриум против сальмонеллеза голубей или бивалентного бактериофага против сальмонеллеза птиц с водой и пробиотика лактобифадол с кормом. Использование данного метода обеспечило высокий терапевтический эффект при сальмонеллезе птиц разных видов в условиях лаборатории, голубятен, вольеров зоопарка «Ташир» .

10. Выделенный вирус болезни Ньюкасла «PN-T» относится к мезогенным парамиксовирусам типа 1, имеет высокую степень отличий от штаммов «Н», «ГАМ-61», «В1», «La Sota», «Бор-74 ВГНКИ» и обладает высокой иммуногенностью. Оптимальной защитной средой для штамма является обезжиренное молоко .

11. На основе штаммов сальмонелл S. typhimurium М-5в t -ДЕП, S .

typhimurium Д-1в t -ДЕП, S. enteritidis 25 Яв e -ДЕП и вируса болезни Ньюкасла штамма «Н» или «PN-T» сконструирована вакцина «Виросальм» ассоциированная инактивированная против сальмонеллеза и болезни Ньюкасла голубей и декоративных птиц. Разработаны технология ее производства, методы контроля и способ применения .

12. У голубей, иммунизированных вакциной «Виросальм», титры антител к вирусу ньюкаслской болезни составили 6,4-2,05 log2 в течение 320 суток наблюдения, у уток, фазанов, мускусных уток, гусей, индеек, цесарок 7,7-3,5 log2, у цыплят, перепелов – 9,6-5,15 log2. Антигенная активность по сальмонеллезным компонентам характеризовалась выраженной агглютинацией антигенов S. typhimurium и S. enteritidis с сыворотками крови вакцинированных птиц. Сохранность иммунизированных голубей при инфицировании в летальных дозах 5 LD50 составила 90-100 % при полной гибели птицы в контроле .

13. Доказана эффективность применения вакцины «Виросальм» на птице разных видов в условиях ОАО «Птицефабрика «Тульская», птицеферм, голубятен и индивидуальных подсобных хозяйств. Антигенная активность вакцины «Виросальм» к S. typhimurium и S. enteritidis на голубях в «полевых» условиях составила 8-5 log2 в РНГА в течение 210 дней наблюдения .

14. Усовершенствована система противоэпизоотических мероприятий для борьбы с сальмонеллезом птиц разных видов, родов и семейств .

Помимо неспецифических ветеринарно-санитарных мероприятий система предусматривает использование препаратов бактериофагов и пробиотика лактобифадол для лечения больных птиц и ликвидации сальмонеллоносительства с последующей иммунизацией вакциной «Виросальм». В условиях зоопарка ООО «Парк живой природы «До-До» Краснодарского края разработанная система позволила со 100 %-ной эффективностью ликвидировать сальмонеллез и сальмонеллоносительство у птиц, обеспечить профилактику болезни в течение трехлетнего периода наблюдения .

СВЕДЕНИЯ О ПРАКТИЧЕСКОМ ИСПОЛЬЗОВАНИИ

РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Результаты, полученные в ходе исследований, включены в «Рекомендации по диагностике, профилактике и ликвидации сальмонеллеза кур», одобренные Департаментом ветеринарии Министерства сельского хозяйства Российской Федерации (№13-3-6/1965 от 04.11.2002) .

2. Штаммы сальмонелл Salmonella typhimurium М-2ф t -ДЕП, S .

typhimurium М-5в t -ДЕП, S. typhimurium Д-1в t -ДЕП, Salmonella enteritidis 25 Яв e -ДЕП паспортизированы и депонированы в ФГУ ВГНКИ в качестве производственных, контрольно-производственных и использованы для изготовления биопрепаратов .

3. Способы изготовления и применения вакцины инактивированной полиэтиленгликолевой против сальмонеллеза голубей запатентованы, патент №2377015 от 27.12.09 .

4. Бактериофаги Phagum Salmonella typhimurium №5 ТЗ -ДЕП, Ph. S .

typhimurium №8 МЕ -ДЕП, Ph. S. typhimurium №9 ММ -ДЕП, Ph. S .

enteritidis A-1 -ДЕП, Ph. S. enteritidis ЮН-1 -ДЕП, Ph. S. enteritidis ЮН-2

-ДЕП паспортизированы, депонированы в ФГУ ВГНКИ в качестве производственных и использованы для изготовления биопрепаратов .

5. Полученные дополнительно 15 бактериофагов с высокой литической активностью к S. typhimurium сохранены в качестве резервных, 6 из них с исследованной морфологией структурных элементов паспортизированы .

6. Способы изготовления и применения Бактериофага тифимуриум против сальмонеллеза голубей запатентованы, патент №2366456 от 10.09.09 .

7. Разработаны инструкции по применению и другая научнотехническая документация на Бактериофаг тифимуриум против сальмонеллеза голубей и бивалентный бактериофаг против сальмонеллеза птиц .

8. Метод селективной деконтамицации для лечения сальмонеллеза птиц с использованием Бактериофага тифимуриум и пробиотика лактобифадол запатентован, патент №2375075 от 10.12.09 .

9. Результаты, полученные в ходе исследований, включены в «Рекомендации по диагностике, профилактике и ликвидации сальмонеллеза голубей», одобренные Департаментом ветеринарии Министерства сельского хозяйства Российской Федерации (№25-25/162 от 11.04.2008) .

10. Вирус болезни Ньюкасла «PN-T» (парамиксовирус типа 1 голубиный вариант) паспортизирован и использован для изготовления экспериментальных серий инактивированной вакцины против сальмонеллеза и ньюкаслской болезни птиц .

11. Способы изготовления, производства и применения вакцины «Виросальм» ассоциированной инактивированной против сальмонеллеза и болезни Ньюкасла голубей и декоративных птиц использованы для составления отчета о доклинических исследованиях и научно-технической документации для регистрации и сертификации препарата .

12. Вакцина «Виросальм» ассоциированная инактивированная против сальмонеллеза и болезни Ньюкасла голубей и декоративных птиц сертифицирована и зарегистрирована на территории Российской Федерации .

13. Результаты, полученные в ходе исследований, включены в «Методические рекомендации по недопущению распространения гриппа птиц и болезни Ньюкасла голубей в частных подворьях, птицеводческих хозяйствах и голубятнях», утвержденные учебно-методическим советом ФГБОУ ВПО МГАВМиБ (протокол №11 от 25.10.2011) .

14. Результаты, полученные при исследовании иммунобиологических и протективных свойств новых методов и средств против сальмонеллеза и ньюкаслской болезни, внедрены в ветеринарную практику голубеводства и птицеводства .

15. Материалы научных исследований, представленные в диссертационной работе, используются в учебном процессе во ФГБОУ ВПО МГАВМиБ по дисциплинам: «Эпизоотология и ифекционные болезни животных», «Болезни птиц», «Фармакология», «Болезни молодняка сельскохозяйственных животных», «Болезни лабораторных животных», «Болезни экзотических животных» .

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ

НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1. Ветеринарным специалистам, заводчикам голубей, владельцам ферм, вольеров, частных индивидуальных хозяйств и мест содержания птицы рекомендуется проводить мониторинг сальмонеллезной инфекции бактериологическими методами и совершенствовать лечебнопрофилактические мероприятия, направленные против сальмонеллеза птиц, с применением новых средств и методов, предложенных в данной работе .

2. Штаммы Salmonella typhimurium М-2ф t -ДЕП, S. typhimurium Мв t -ДЕП, S. typhimurium Д-1в t -ДЕП, S. enteritidis 25 Яв e -ДЕП рекомендуется использовать в качестве производственных и контрольнопроизводственных для создания ветеринарных препаратов .

3. Для профилактики сальмонеллеза голубей рекомендуется использовать вакцину инактивированную полиэтиленгликолевую против сальмонеллеза голубей в дозе 0,5 см3 с 20-30-дневного возраста двукратно с интервалом 30-40 дней .

4. Для профилактики сальмонеллеза и ньюкаслской болезни птиц рекомендуется применение вакцины «Виросальм» ассоциированной инактивированной против сальмонеллеза и болезни Ньюкасла голубей и декоративных птиц с 20-дневного возраста двукратно с интервалом 30 дней .

5. Специалистам биотехнологических предприятий рекомендуется использовать производственный регламент вакцины «Виросальм» .

6. Штаммы бактериофагов Phagum Salmonella typhimurium №5 ТЗ ДЕП, Ph. S. typhimurium №8 МЕ -ДЕП, Ph. S. typhimurium №9 ММ -ДЕП, Ph. S. enteritidis A-1 -ДЕП, Ph. S. enteritidis ЮН-1 -ДЕП, Ph. S. enteritidis ЮН-2 -ДЕП рекомендуется использовать в качестве производственных для создания ветеринарных препаратов .

7. Для лечения и профилактики сальмонеллеза голубей рекомендуется использовать Бактериофаг тифимуриум против сальмонеллеза голубей орально индивидуально или с водой групповым способом в дозе 0,5 см3 на голову при концентрации фага 108 и в дозе 0,25 см3 голубятам до 14дневного возраста с первых дней жизни. Для лечения и профилактики сальмонеллеза птиц рекомендуется использовать бивалентный бактериофаг согласно инструкции по применению .

8. Для лечения и профилактики сальмонеллеза птиц рекомендуется использовать метод селективной деконтаминации, включающий применение Бактериофага тифимуриум или бивалентного бактериофага против сальмонеллеза птиц и пробиотика лактобифадол .

9. Штамм вируса ньюкаслской болезни «PN-T» рекомендуется депонировать в ФГБУ ВГНКИ и использовать в качестве производственного .

Данные по свойствам вакцины «Виросальм» в новом варианте с включением антигена инактивированного штамма «PN-T» рекомендуется использовать для дальнейшего совершенствования средств специфической профилактики болезни Ньюкасла птиц .

10. При организации противоэпизоотической борьбы с сальмонеллезом птиц необходимо использовать «Рекомендации по диагностике, профилактике и ликвидации сальмонеллеза кур» и «Рекомендации по диагностике, профилактике и ликвидации сальмонеллеза голубей», одобренные Департаментом ветеринарии Министерства сельского хозяйства Российской Федерации .

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Куриленко А.Н., Пименов Н.В., Ленев С.В., Толпыгин М.А. Специфическая профилактика сальмонеллеза кур // Ветеринарная медицина. – 2002. – № 2. – С. 29-30 .

2. Пименов Н.В., Бубнова Л.В. Бактерии рода Salmonella – этиологический фактор острых кишечных расстройств у серых ворон // Ветеринарная медицина. – 2002. – № 2. – С. 29 .

3. Куриленко А.Н., Пименов Н.В., Ленев С.В., Малахов Ю.А., Яковлев С.С. Рекомендации по диагностике, профилактике и ликвидации сальмонеллеза кур. – М.: МСХ-МГАВМиБ. – 2002. – 34 с .

4. Пименов Н.В., Ленев С.В., Куриленко А.Н. Протективная активность бивалентного сальмофага против сальмонеллеза энтеритидис и пуллороза-тифа кур // Сб. науч. трудов ВГНКИ. – М.: ФГУ ВГНКИ, 2003. – Т .

64. – С. 178-182 .

5. Пименов Н.В., Ленев С.В., Малахов Ю.А., Куриленко А.Н. Новый этап в совершенствовании профилактики и лечения сальмонеллеза кур // Мат-лы XI Московского международного вет. конгресса. – М.: Асс. практ .

вет. врачей, 2003. – С. 228-229 .

6. Пименов Н.В., Капустин А.В. Смешанная инфекция – сальмонеллез и болезнь Нью-Касла голубей // Ветеринарная медицина. – 2004. – № 4. – С. 23-24 .

*7. Данилевская Н.В., Пименов Н.В. Проблема антибиотикорезистентности на примере лечения сальмонеллеза у домашних голубей // Российский ветеринарный журнал. – 2005. – № 4. – С. 21-24 .

8. Пименов Н.В. Основные направления борьбы с сальмонеллезом голубей // Вклад молодых ученых в решение проблем аграрной науки: Матлы межрег. науч.-практ. конф. мол. уч. – Воронеж: ФГОУ ВПО «ВГАУ им .

К.Д. Глинки», 2005. – Ч. 2. – С. 144-147 .

*9. Пименов Н.В., Данилевская Н.В. Антибиотикорезистентность сальмонелл, выделенных у домашних голубей // Ветеринария. – 2006. – № 9. – С. 20-24 .

10. Пименов Н.В. Эпизоотологические особенности сальмонеллеза голубей // Мат-лы XIII Московского международного конгресса по бол .

мелк. дом. жив. – М.: Асс. практ. вет. врачей, 2005. – С. 153-155 .

11. Пименов Н.В. Сальмонеллез синантропных птиц – проблема токсикоинфекций человека // Проблемы рационального природопользования техногенного региона: Сб. науч. тр. Междунар. шк.-конф. – Кемерово:

ФГОУ ВПО КГСХИ, 2006. – С. 206-210 .

12. Данилевская Н.В., Пименов Н.В. Новое в антибиотикотерапии: антибиотикорезистентность – угроза реальна // Новейшие разработки в ветеринарии. Клеточная терапия: Мат-лы совм. конф. – М.: ГУ РОНЦ им. Н.Н .

Блохина РАМН, 2006. – С. 16-22 .

13. Пименов Н.В., Чиркова И.В. Биологические свойства бактериофагов Salmonella typhimurium и их терапевтическая эффективность против сальмонеллеза голубей // Молодежь и наука XXI века: Мат-лы II Открытой Всеросс. науч.-практ. конф. мол. уч. – Ульяновск: ФГОУ ВПО УГСХА, 2007. – Ч. 1. – С. 336-340 .

14. Пименов Н.В., Чиркова И.В. Специфическая профилактика сальмонеллеза голубей // Голубеводство.–2007.–№ 12.–С.29; 2008.– №1.– С.29 .

*15. Пименов Н.В., Чиркова И.В. Фаговыделение, профилактика и терапия сальмонеллеза голубей // Ветеринария. – 2007. – № 10. – С. 24-28 .

*16. Пименов Н.В. Создание и необходимость применения инактивированной вакцины против сальмонеллеза и болезни Нью-Касла голубей // Ветеринарная медицина. – 2008. – № 2-3. – С. 11-12 .

17. Пименов Н.В., Куриленко А.Н., Чиркова И.В., Яковлев С.С. Рекомендации по диагностике, профилактике и ликвидации сальмонеллеза голубей. – М.: МСХ; «МегАрт» – 2008. – 43 с .

*18. Чиркова И.В., Пименов Н.В. Биологические свойства бактериофагов против сальмонелл тифимуриум и их использование в борьбе с сальмонеллезом птиц // Ветеринария и кормление.– 2008.– № 3. – С.32-34 .

*19. Пименов Н.В. Перспективы применения бактериофагов в ветеринарии // Ветеринария и кормление. – 2009. – № 5. – С. 34-35 .

20. Желудева Е.В., Пименов Н.В. Человек и природа: «биологическое»

и «социальное» // Вопросы ветеринарии и ветеринарной биологии: Сб. науч. тр. мол. уч. – М.: ФГОУ ВПО МГАВМиБ, 2009. – Вып. 5. – С. 206-210 .

21. Пименов Н.В., Бурико Б.Ю. Основные методы борьбы с ньюкаслской болезнью в голубеводстве // Вопросы ветеринарии и ветеринарной биологии: Сб. науч. тр. мол. уч. – М.: ФГОУ ВПО МГАВМиБ, 2009. – Вып. 5. – С. 132-138 .

*22. Пименов Н.В., Чиркова И.В. Препарат против сальмонеллеза голубей и способ лечения сальмонеллеза голубей: Патент на изобретение №2366456 // Официальный бюллетень Федеральной службы по интеллектуальной собственности. – 2009. – № 25 .

23. Пименов Н.В. Вирус для изготовления инактивированной полиэтиленгликолевой вакцины против сальмонеллеза и болезни Нью-Касла голубей // Вопросы ветеринарии и ветеринарной биологии: Сб. науч. тр .

мол. уч. – М.: ФГОУ ВПО МГАВМиБ, 2009. – Вып. 5. – С. 138-141 .

*24. Пименов Н.В. Распространенность инфекционных болезней в голубеводстве // Ветеринария и кормление. – 2009. – № 6. – С. 69-70 .

*25. Пименов Н.В., Чиркова И.В., Субботин В.В., Данилевская Н.В .

Способ лечения птиц при сальмонеллезе, вызванном Salmonella typhimurium: Патент на изобретение №2375075 // Официальный бюллетень Федеральной службы по интеллектуальной собственности.– 2009. – №34 .

*26. Пименов Н.В. Вакцина инактивированная против сальмонеллеза голубей и способ ее применения: Патент на изобретение №2377015 // Официальный бюллетень Федеральной службы по интеллектуальной собственности. – 2009. – № 36 .

27. Пименов Н.В. Антигенные и иммуногенные свойства вакцины «Виросальм» инактивированной ассоциированной против сальмонеллеза и болезни Ньюкасла птиц // Мат-лы междунар. науч.-практ. конф. «Молодость, талант, знания – ветеринарной медицине и животноводству». – М.Троицк: ФГОУ ВПО УГАВМ, 2010. – Т. 3. – С. 107-112 .

28. Пименов Н.В. Молодые предлагают новые методы и препараты // Информационный бюллетень Минсельхоза России.– 2010.– № 4.– С.50-52 .

*29. Пименов Н.В. Сальмонеллез птиц: перспективные направления в лечебно-оздоровительных мероприятиях // Ветеринария и кормление. – 2010. – № 3. – С. 24-25 .

30. Пименов Н.В. Диагностика, профилактика и меры борьбы с основными инфекциями в голубеводстве. – М.: Колос, 2010. – 96 с .

31. Желудева Е.В., Пименов Н.В. Проблемы экологии: способность мыслить в общепланетарном масштабе // Вопросы ветеринарии и ветеринарной биологии: Сб. науч. тр. мол. уч. – М.: ФГОУ ВПО МГАВМиБ, 2011. – Вып. 7. – С. 275-277 .

32. Пименов Н.В. Инновационный метод профилактики сальмонеллеза и ньюкаслской болезни птиц в условиях мелких и средних хозяйств // Актуальные проблемы развития АПК в научных исследованиях молодых ученых: Труды Всерос. совета мол. уч. и спец-тов аграрных образовательных и научных учреждений. – М.: МСХ РФ, 2011. – С. 146-149 .

33. Пименов Н.В., Зотова З.В. Иммунобиологические свойства вакцины «Виросальм» в сравнении с живыми вакцинами против ньюкаслской болезни у голубей // Вопросы ветеринарии и ветеринарной биологии: Сб .

науч. тр. мол. уч. – М.: ФГОУ ВПО МГАВМиБ, 2011.– Вып.7.– С. 164-178 .

34. Желудева Е.В., Пименов Н.В. Социальная экология: аксиологическая переориентация сциентизированного мышления // Вопросы ветеринарии и ветеринарной биологии: Сб. науч. тр. мол. уч. – М.: ФГОУ ВПО МГАВМиБ, 2011. – Вып. 7. – С. 278-280 .

*35. Зотова З.В., Пименов Н.В. Проблема ньюкаслской болезни голубей и пути ее решения // Ветеринария и кормление.– 2011.– № 5.– С.35-36 .

36. Пименов Н.В. Бивалентный сальмофаг против сальмонеллеза птиц // Вопросы ветеринарии и ветеринарной биологии: Сб. науч. тр. мол. уч. – М.: ФГОУ ВПО МГАВМиБ, 2011. – Вып. 7. – С. 168-174 .

37. Пименов Н.В. Вакцина «Виросальм» – новый биопрепарат для специфической профилактики сальмонеллеза и болезни Ньюкасла птиц // Инновационные тенденции развития Российской науки: Мат-лы IV Междунар. науч.-практ. конф. мол. уч. – Красноярск: ФГОУ ВПО «Красноярский ГАУ», 2011. – Ч. 1. – С. 139-142 .

38. Зотова З.В., Пименов Н.В. Факторы риска распространения эпизоотии ортомиксвирусной и парамиксвирусной инфекций птиц в Московской области // Вопросы ветеринарии и ветеринарной биологии: Сб. науч .

тр. мол. уч.– М.: ФГОУ ВПО МГАВМиБ, 2011. – Вып. 7. – С. 145-151 .

39. Пименов Н.В. Специфическая эффективность вакцины «Виросальм» ассоциированной инактивированной против сальмонеллеза и болезни Ньюкасла птиц // Молодежь и инновации – 2011: Мат-лы Междунар .

науч.-пр. конф. – Горки: Белорусская ГСХА, 2011. – Ч. 1. – С.309-312 .

*40. Пименов Н.В. Новые пути решения медико-социальной проблемы сальмонеллеза птиц // Жизнь без опасностей.– 2011.– № 2.– Т. 6.– С. 56-60 .

*41. Пименов Н.В., Зотова З.В. Конструирование вакцины «Виросальм» на основе парамиксовируса типа 1 голубиного варианта штамма «PN-T» // Ветеринарный врач. – 2011. – № 4. – С. 2-4 .

42. Пименов Н.В., Зотова З.В. Методические рекомендации по недопущению распространения гриппа птиц и болезни Ньюкасла голубей в частных подворьях, птицеводческих хозяйствах и голубятнях. – М.:

ФГБОУ ВПО МГАВМиБ. – 2011. – 56 с .

43. Пименов Н.В. Новые методы и средства в борьбе с сальмонеллезом птиц // Вопросы ветеринарии и ветеринарной биологии: Сб. науч. тр. мол .

уч. – М.: ФГБОУ ВПО МГАВМиБ, 2012. – Вып. 8. – С. 138-143 .

*44. Пименов Н.В. Эффективность оздоровительных мероприятий против сальмонеллеза птиц в условиях зоопарка // Российский ветеринарный журнал. – 2012. – № 3. – С. 22-24 .

*45. Пименов Н.В. Вакцинопрофилактика сальмонеллеза голубей и декоративных птиц // Ветеринария. – 2012. – № 8. – С. 20-22 .

*46. Пименов Н.В. Совершенствование средств и методов борьбы с сальмонеллезом птиц // Ветеринария и кормление. – 2012. – № 4.– С.32-33 .

47. Пименов Н.В. Эффективность метода селективной деконтаминации в условиях пунктов содержания птицы, неблагополучных по сальмонеллезу // Вопросы ветеринарии и ветеринарной биологии: Сб. науч. тр. мол. уч .

– М.: ФГБОУ ВПО МГАВМиБ, 2012. – Вып. 8. – С. 143-147 .

*48. Пименов Н.В. Совершенствование системы противоэпизоотической борьбы с сальмонеллезом птиц // Ветеринарная медицина. – 2012. – № 3. – С. 38-40 .

* - издания, рекомендованные ВАК РФ