WWW.MASH.DOBROTA.BIZ
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - онлайн публикации
 

«ОЦЕНКА СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ МЕМБРАН ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ПОЛИОЛОВ Обосновано применение методов люминесцентного В.И. ЕВДОКИМОВ анализа для оценки структурно-функционального состояния В.А. ...»

112 НАУЧНЫЕ ВЕДОМОСТИ E g3 Серия Медицина. Фармация. 2012. № 22 (141). Выпуск 20/3

УДК 614.7:343.426

ОЦЕНКА СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ МЕМБРАН

ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ПОЛИОЛОВ

Обосновано применение методов люминесцентного

В.И. ЕВДОКИМОВ

анализа для оценки структурно-функционального состояния

В.А. ТЕЛЕГИН биологических мембран и определения пороговых и максимально недействующих доз в санитарно­ Белгородский государственный токсикологических экспериментах .

национальный исследовательский университет Ключевые слова: люминесцентный анализ, биологические мембраны, санитарно-токсикологические исследования .

e-mail: evdokimov@bsu.edu.ru Состояние мембранных систем клеток различных органов и тканей во многом определяет внутриклеточный метаболизм. Нарушение структур биологических мембран, изменение их состава и физико-химических свойств лежат в основе разнообразных патологических процессов - воспалительных, аллергических, иммунных и др .

В настоящее время показана роль мембранных нарушений в патогенезе состояний, связанных с взаимодействием организма с полиолами. М ембранная патология может быть следствием нарушения процессов свободнорадикального окисления [1] .

Среди многих методов исследования, которыми располагает современная наука, видное место принадлежит люминесцентному анализу. Этот метод обладает высокой чувствительностью, информативностью и надежностью .



Он дает уникальные возможности изучения возбужденных состояний молекул, фотохимических реакций, динамики быстрых молекулярных процессов, структуры и свойств сложных химических и биологических систем. В практике таких специальностей, как фармакология, токсикология, судебная медицина, лабораторное дело, метод нашел широкое применение [2]. Под люминесценцией понимают свечение, не связанное с тепловым испусканием лучей. В зависимости от источников энергии для свечения физических тел или биологических материалов различают хеми-, электро- или фотолюминесценции. Собственно люминесцирующие тела и субстраты бывают хеми-, электроили фотолюминофорами [2] .

Данные экспериментальных и клинических наблюдений свидетельствуют о больших перспективах люминесцентного анализа в диагностике различных заболеваний и обосновании структурно-метаболических механизмов их формирования .

Являясь высокочувствительными и информативными, методы люминесцентного анализа могут адекватно отражать структурно-функциональное состояние биологических мембран и нарушение гомеостатической функции организма в условиях воздействия на организм вредных антропогенных факторов .

Большое развитие в нашей стране и за рубежом получил метод анализа хемилюминесценции биологических систем (или метод био-хемилюминесценции - БХЛ), таких как органы, ткани, сыворотка и плазма крови. БХЛ плазмы крови в присутствии двухвалентного железа дает возможность уточнить степень мозговой гипоксии на фоне неспецифических заболеваний легких. БХЛ оказалась хорошим тестом на жизнеспособность пересаживаемых и консервируемых органов (почка, роговица и др.) и способом ранней диагностики криза отторжения пересаженного органа [3] .

БХЛ нашла ш ирокое применение для оценки состояния свободнорадикальных процессов и перекисного окисления липидов, происходящих в сложных биологических системах .

Целью настоящей работы было обоснование применения люминесцентного анализа для оценки структурно-функционального состояния мембран и определения пороговых и максимально недействующ их доз в санитарно-токсикологических экспериментах .



Материалы и методы. Исследовали интенсивность сверхслабого свечения гомогенатов внутренних органов, сыворотки и цельной крови у крыс Вистар, подвергавшихся пероральном у воздействию в подостром опы те полиоксипропиленполиолам и м арок Л -294, Л-564, ПГ-100, на хемилюминометре ХЛМ Ц1-01. Определяли спонтанную и индуцированную люминолзависимую БХЛ. В качестве индуцентов использовали перекись водорода и хлорное железо [4]. В кварцевую кювету размером 10 х 10 х 45 мм вводили 1,2 мл изотонического раствора натрия хлорида, 10 мкл сыворотки (4 или 10 мкл гомогенатов внутренних органов), 10 мкл 3%-ного раствора люминола и записывали фон сверхслабого свечения (2 измерения каждого НАУЧНЫЕ ВЕДОМОСТИ I Серия Медицина. Фармация. 2012. № 22 (141). Выпуск 20/3 113 свечения в течение 10 с). После этого в кварцевую кювету для оценки состояния индуцированной БХЛ вносили 3%-ную перекись водорода в количестве 0,05 мл (или хлорное железо в объеме 0,05 мл) и выполняли 6 измерений (каждое в течение 10 с) .

Фотолюминесценцию сыворотки крови оценивали по интенсивности фосфоресценции .

Для этого исследуемые образцы облучали ультрафиолетовыми лучами. После прекращения действия возбуждающего света регистрировали фосфоресценцию (так как испускание квантов свечения во время облучения светом представляет собой флуоресценцию) [5] .

Фосфоресцентный метод не получил такого широкого применения, как биохемилюминесцентный и флуоресцентный. Это связано, во-первых, с тем, что подавляющая часть физических тел и биологических субстратов слабо фосфоресцирует. Во-вторых, в отличие от флуоресценции, наблюдение которой технически не представляет каких-либо трудностей, регистрация фосфоресценции требует специальной измерительной аппаратуры, основу которой составляет фосфороскоп, обеспечивающий разделение во времени процессов облучения образца возбуждающим светом и регистрации его фосфоресценции. Одной из трудностей является обеспечение абсолютной светозащиты фотоприемника от дифракции возбуждающего света. В описанных в литературе приборах данная проблема решена неудовлетворительно, и по этой причине им присуща низкая чувствительность .

Флуоресценция наблюдается преимущественно в жидких и газообразных средах, тогда как фосфоресценция доминирует в твердых средах. Для наблюдения флуоресценции и фосфоресценции необходимо, чтобы изучаемый образец был прозрачным для возбуждающего света. В то же время применительно к фосфоресценции подавляющая часть твердых тел непрозрачна. Это обстоятельство, естественно, услож няет наблюдение фосфоресценции таких образцов и не способствует широкому применению фосфоресцентного метода. В связи с этим был разработан люминометр [5], в котором успешно решены проблемы обеспечения абсолютной светозащиты фотоэлектронного умножителя (ФЭУ) и регистрации фосфоресценции непрозрачных образцов Ф осфоресценцию определяли следующ им образом: на кварцевую пластину размером 5 х 5 мм наносили 50 мкл сыворотки .



При температуре 30°С нанесенные капли высушивали в термостате в течение 20 мин. для образования твердой пленки. Пластину с высушенной сывороткой помещали в фосфороскоп и измеряли ее фосфоресценцию. Источником возбуждающего света служила ртутная лампа ДРК-120. С помощью монохроматора ДМР-4 выделяли следующие линии возбуждения: 297, 313, 334, 365, 404, 434 нм. Ширина выходной щели монохроматора составляла 2 мм. Область спектральной чувствительности ФЭУ=300-830 нм .

Регистрацию фосфоресценции проводили при комнатной температуре в режиме счета фотонов .

В качестве измерительной системы служил счетчик СБС-2. Все процессы измерения были автоматизированы, погрешность не превышала 3% .

В последние годы для изучения физических свойств липопротеинов и биомембран используются разнообразные флуоресцирующие соединения, так называемые флуоресцентные метки и зонды. Они позволяют количественно характеризовать такие физические свойства мембран, как поверхностный заряд, трансмембранный потенциал, микровязкость, расстояние между белками и липидами, концентрацию воды, изменение конформации белков и т.д .

Использование новых зондов позволило разработать новые методы диагностики многих иммунных заболеваний, включая аллергические состояния, токсикозы, атеросклероз. Качества этих методов, основанных на оценке физических свойств мембран лимфоцитов, эритроцитов и белков плазмы крови, обеспечивают их распространение в клинической практике [2] .

О текучести плазматических мембран лимфоцитов и эритроцитов судили по коэффициенту эксимеризации пирена. Он представляет собой отношение количества эксимеров пирена по длине волны испускания Лисп =470 нм к количеству его мономеров при длине волны Лисп = 3 9 3 нм. Коэффициент эксимеризации пирена изучали в зоне белоклипидных контактов (Лвозб =287 нм) и в липидном бислое (Лвозб =334) .

Интенсивность флуоресценции 1-анилино-8-нафталинсульфата (1,8-АНС), изменяющуюся обратно пропорционально поверхностному заряду мембраны лимфоцита, исследовали по методу Ю.А. Владимирова и Е.Г. Добрецова [2]. Флуоресценцию отдельной клетки изучали с помощью микроскопа ЛЮ МАМ -И3, Л =360 нм, Лисп = 4 9 0 нм .

возб Статистическая обработка полученных результатов проведена с использованием критерия Стьюдента-Фишера .

Результаты и их обсуждение. Состояние свободнорадикальных процессов и перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали по величине светосуммы и интенсивности сверхслабого свечения Н2О2 или РеС1з -индуцированной люминолзависимой БХЛ. Согласно данным литературы интенсивность БХЛ в системе индуцированной Н2О2 отражает образование наиболее реакционно-способных радикалов (ОН-гидроксильный радикал, О2-супероксидный анион кислорода), с которыми взаимодействуют биологические субстраты [6]. Они инициируют 114 НАУЧНЫЕ ВЕДОМОСТИ E g3 Серия Медицина. Фармация. 2012. № 22 (141). Выпуск 20/3 цепной процесс ПОЛ, протекающий в биомембранах и липопротеинах крови [7]. По мнению многих авторов, накопление активных форм кислорода, перекисей, гидроперекисей, свободных радикалов потенцирует развитие свободнорадикальной патологии и усиливает скорость старения организма [3, 8]. Результаты исследований свидетельствуют о повышении спонтанной (СХЛ) и индуцированной (ИХЛ) хемилюминесценции сыворотки крови, цельной крови, гомогенатов внутренних органов и тканей экспериментальных животных, подвергавшихся пероральному воздействию l/ io, l/lOO, 1/1000 и l/ io o o o Д Л 50 в условиях подострого опыта .

Наиболее существенные различия между интенсивностью свечения сравниваемых групп наблюдали в условиях оценки люминолзависимой БХЛ (табл. l). Анализ полученных данных свидетельствует, что субтоксическое воздействие изучаемых полиоксипропиленполиолов марок Л-094, Л-564, ПГ-100 во всех дозах, кроме 1/10000 Д Л 5 0, индуцирует свободнорадикальные процессы и ПОЛ, которые сопровождаются генерацией активных форм кислорода и накоплением в организме гидроперекисей, свободных радикалов, способных привести к ингибированию антиоксидантной системы (АОС) и развитию патологических структурно-метаболических состояний. Повышение уровней люминолзависимой хемилюминесценции, индуцированной Н2О2 и FeCl3, подтверждает цепной свободнорадикальный характер происходящих изменений в биологических системах, которые впоследствии активируют ПОЛ. Исследования свидетельствуют, что в условиях интоксикации полиоксипропиленполиолами образуется супероксидный анион кислорода (О2) и гидроксильный радикал (ОН). Первый из них содержит два неспаренных электрона, возникающих, как правило, в результате разрыва валентной связи. В отсутствие освещ ения концентрация неспаренных электронов в образце незначительна. В условиях химической индукции или при освещении количество их существенно возрастает. Повышение продукции супероксидного аниона кислорода под влиянием испытуемых соединений свидетельствует о наличии высоких уровней, триплетного в частности, возбужденных электронных состояний .

–  –  –

Примечание: * - р0,05 по сравнению с контролем .

Система энергетических уровней триплетного состояния в белках подтверждалась нами результатами изучения фосфоресценции сыворотки крови опытных и контрольных животных, а многими авторами - методом электронно-парамагнитного резонанса (ЭПР) [6, 7]. Эти результаты свидетельствуют, что исчезновение сигнала ЭПР соответствует исчезновению триплетного состояния, в чем можно убедиться, сравнив кривую затухания ЭПР-поглощ ения с кривой фосфоресценции триплетного состояния. Ход обеих кривых после выключения света (источника возбуждения) одинаков [6, 7]. Наличие высоких уровней триплетных возбужденных состояний, обусловленных неспаренными электронами, может свидетельствовать об изменении конформации белковых молекул, присутствующих в сыворотке крови. Это связано, повидимому, с окислительной модификацией белков, свободнорадикальными процессами и активацией ПОЛ, возникающими под влиянием воздействия полиолов .

Щж Серия НАУЧНЫЕ ВЕДОМОСТИ Медицина. Фармация. 2012. № 22 (141). Выпуск 20/3 115 При изучении фосфоресценции сыворотки крови животных, подвергавшихся воздействию полиоскипропиленполиолов в дозах 1/10; 1/100; 1/1000 Д Л 5 0, обнаружены существенные различия в интенсивности свечения при длинах волны возбуждения анализируемых объектов 297, 313, 334, 365, 404 и 434 нм. Особенно значимым было повышение уровня фосфоресценции в длинноволновой (Л=297 и 313 нм) области возбуждения (табл. 2) .

Результаты эксперимента показывают, что при субхроническом воздействии на организм полиолов происходит увеличение накопления в биосистемах числа молекул, находящихся в триплетном возбужденном состоянии, то есть имеющих два неспаренных электрона. Эти молекулы более живучи и лиш ь по истечении сравнительно большого отрезка времени (10-4-10-2 с) излучают свет и переходят на низкий, невозбужденный синглетный уровень [6, 7] .

Появление в длинноволновой области возбуждения повышенного количества молекул в триплетном состоянии может, по всей видимости, свидетельствовать о разобщении окислительного фосфорилирования и тканевого дыхания, которое сопровождается увеличением рассеивания тепла в организме экспериментальных животных под воздействием полиоксипропиленпо-лиолов. Вещества в дозе 1/10000 ДЛ50 не влияли на показатели фосфоресценции сыворотки крови опытных животных под воздействием 1/1000 Д Л 50 полиоксипропиленполиолов .

Результаты исследований свидетельствуют об интенсификации под влиянием полиоксипропиленполиолов окислительных процессов, приводящих к развитию дистрофических и деструктивных нарушений клеточных и внутриклеточных структурно­ функциональных единиц .

Таблица 2 А ктивность ф осф оресценции сы воротки крови кры с под воздействием 1/1000 ДЛ50 полиоксипропиленполиолов

–  –  –

плазматических мембран лимфоцитов и эритроцитов крови в зонах белок-липидных контактов и липидном бислое по сравнению с таковой у контрольных животных (табл. 3). Интенсивность флуоресценции 1,8-АНС, отражающая изменения поверхностного заряда плазматических мембран, также была снижена, что может свидетельствовать об их гиперполяризации .

Нарушений структурно-функциональных и физико-химических свойств мембран при воздействии на организм 1/10000 Д Л 50 не наблюдали .

–  –  –

Примечание: * - р0,05 по сравнению с контролем .

Выводы:

1. Полиолы (в частности полиоксипропиленполиолы) при пероральном пути поступления в дозах 1/10; 1/100; 1/1000 ДЛ50 стимулируют свободнорадикальные процессы и перекисное окисление липидов, приводящие в условиях подострого опыта к глубоким 116 НАУЧНЫЕ ВЕДОМОСТИ E g3 Серия Медицина. Фармация. 2012. № 22 (141). Выпуск 20/3 изменениям физико-химических свойств мембран и структурно-метаболических процессов, лежащ их в основе нарушения ядерно-цитоплазматических взаимодействий и формирования основных симптомов мембранной патологии .

2. Методы люминесцентного и флуоресцентного анализа высокочувствительны и информативны при оценке структурно-функционального состояния мембран и определения пороговых и максимально недействующих доз в санитарно-токсикологических экспериментах .

Л итература

1. Жуков, В.И. Детергенты - модуляторы радиомиметических эффектов / В.И. Жуков, В.В. Мясоедов, Ю.И. Козин и др. - Белгород : Полимерсинтез, 2000. - 375 с .

2. Владимиров, Ю.А. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран / Ю.А. Владимиров, Е.Г. Добрецов. - М. : Наука, 1980. - 320 с .

3. Цыганенко, А.Я. Структурно-метаболические механизмы формирования атеросклероза / A.Я. Цыганенко, В.И. Жуков, И.А. Григорова и др. - Белгород : Полимерсинтез, 2001. - 601 с .

4. Жуков, В.И. Использование биохемилюминесценции и фосфоресценции при изучении влияния химических факторов производственной среды на организм / В.И. Жуков, О.В. Зайцева, B.М. Абашин и др. // Тез. докл. 1-й Республ. конф. «Новые методы в медицине». - Ворошиловград, 1 9 9 0. - С. 51-53 .

5. Пат. 2031400 РФ. Устройство для регистрации при комнатной температуре люминесценции биологических мембран. В.М. Абашин, Н.Г. Сергиенко, В.И. Жуков, 1995. Бюл. № 8 .

6. Владимиров, Ю.А. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах / Ю.А. Владимиров, А.И. Арчаков. - М. : Наука, 1972. - 320 с .

7. Барабой, В.А. Окислительно'-антиоксидантный гомеостаз в норме и при патологии / В.А. Барабой, Д.А. Сутковой. - К., 1997. - Ч. I. - 200 с.; Ч. II. - 220 с .

8. Цыганенко, А.Я. Структурно-метаболические механизмы формирования нарушений клеточного и гуморального иммунитета под воздействием детергентов в связи с проблемой охраны водных экосистем /А.Я. Цыганенко, В.И. Жуков, Г.Н. Щербань и др. - Харьков, 2001. - 414 с .

–  –  –






Похожие работы:

«УДК 528.77 (075.8) АНАЛИЗ ВИЗУАЛЬНО-ОДНОРОДНЫХ ОБРАЗЦОВ МНОГОСПЕКТРАЛЬНОЙ ИНФОРМАЦИИ КАК ОДИН ИЗ ПОДХОДОВ В СОВРЕМЕННОМ ЦИФРОВОМ КАРТОГРАФИРОВАНИИ Боенко К.А. Институт водеых и экологических проблем СО РАН 656038, г. Барнаул, ул. Мол...»

«ПАРАЗИТОЛОГИЯ, 48, 1, 2014 ХРОНИКА УДК 576.895.771 МЕЖДУНАРОДНАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ "ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ H ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ ИЗУЧЕНИЯ ПАРАЗИТИЧЕСКИХ ЧЛЕНИСТОНОГИХ В XXI ВЕКЕ" (САНКТ-ПЕТЕРБУРГ, 21—25 ОКТЯБРЯ 2013 Г.) © С. Г. Медведев, А. В. Хал...»

«Социально-экологические технологии. 2018. № 2 DOI: 10.31862/2500-2966-2018-2-83-107.,.,. * ** *, *** *, 117485., **, 125466., *** " ", 117485., Методика диалога со спящим испытуемым в состоянии осознанного сновидения с использованием дыхательных движений В исследованиях осознанных сновидений для идентификации э...»

«СОГЛАСОВАНО Анализаторы Внесены в Государственный биохимические реестр средств измерений автоматизированные Регистрационный № /В Ь& 0~00 АБ-01-”УОМЗ” Взамен № Выпускаются по ТУ 9443-023-07539541-99 Назначение и область применения Анализаторы биохимические автоматизированные АБ-01-”УОМЗ” предна­ значены для определения содержа...»

«ПРОТОКОЛ заседания Учебно-методической комиссии Биологического факультета 12 февраля 2015 г. №2 ПРИСУТСТВОВАЛИ: А.В. Баскаков, Е.В. Абакумов, М.П. Баранов, А.Г. Гончар, А.И . Гранович, А.А. Нижников, А.А.До...»

«Федеральное агентство по образованию Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "ГОРНО-АЛТАЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ" Кафедра анатомии, физиологии человека и животных ТЕОРИЯ ЭВОЛЮЦИИ Учебно-методический комплекс Для студентов, обучающихся по специальности 050102 "Биология" кв...»

«Лето 2014: Публикуется Альянсом по сохранению сайгака выпуск 18 SAIGA NEWS Издается на 6-ти языках для информационного обмена по вопросам экологии и охраны сайгака Фото Е . Полонско...»

«ЕФРЕМОВА ВИТАЛИНА АЛЕКСАНДРОВНА СООБЩЕСТВА ПОЧВЕННЫХ ВОДОРОСЛЕЙ И ЦИАНОБАКТЕРИИ В ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ ОЦЕНКЕ ГОРОДСКИХ ПОЧВ (НА ПРИМЕРЕ Г . КИРОВА) 03.02.08 экологая (биология) 03.02.01 ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук 1...»




 
2019 www.mash.dobrota.biz - «Бесплатная электронная библиотека - онлайн публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.