WWW.MASH.DOBROTA.BIZ
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - онлайн публикации
 

«ВЕДЕРНИКОВ АЛЕКСАНДР АНДРЕЕВИЧ Сравнительное исследование механизмов Ca2+-зависимой пермеабилизации внутренней мембраны митохондрий печени некоторых видов млекопитающих и птиц ...»

На правах рукописи

ВЕДЕРНИКОВ АЛЕКСАНДР АНДРЕЕВИЧ

Сравнительное исследование механизмов Ca2+-зависимой пермеабилизации

внутренней мембраны митохондрий печени некоторых видов

млекопитающих и птиц

03.01.04 – биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Пущино – 2016

Работа выполнена на кафедре биологии, кафедре фундаментальной медицины и

в лаборатории молекулярной биоэнергетики ФГБОУ ВО «Марийский государственный университет» (г. Йошкар-Ола) .

доктор биологических наук, профессор

Научный руководитель:

Самарцев Виктор Николаевич

Официальные оппоненты: Миронова Галина Дмитриевна, доктор биологических наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук, заведующая лабораторией митохондриального транспорта Амерханов Зариф Гарриевич, кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биофизики клетки Российской академии наук, старший научный сотрудник лаборатории механизмов природных гипометаболических состояний Федеральное государственное бюджетное

Ведущая организация:



образовательное учреждение высшего профессионального образования Московский государственный университет им .

М.В. Ломоносова, Научно-исследовательский институт физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского

Защита состоится «___» ноября 2016 г. в _____ на заседании диссертационного совета Д 002.066.01, созданного на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института фундаментальных проблем биологии Российской академии наук (ИФПБ РАН) по адресу: 142290, Московская обл., г. Пущино, ул. Институтская, 2 .

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ИФПБ РАН (http://www.ibbp.psn.ru/) Автореферат диссертации разос

–  –  –

Митохондрии в энергизованном состоянии Актуальность проблемы .

обладают способностью аккумулировать и удерживать Са2+ в матриксе (Rasola and Bernardi, 2011; Zorov et al., 2014). Максимальный выход Са2+ из матрикса этих органелл наблюдается при условии индукции неспецифической проницаемости или, говоря по-другому, пермеабилизации внутренней мембраны для ионов и растворимых в воде веществ с молекулярной массой до 1500 Да по их градиенту концентрации (открытие митохондриальной поры) (Rasola and Bernardi, 2011; Zorov et al., 2014). Это приводит к нарушению энергетических функций митохондрий, прежде всего синтеза АТФ, а также может вызвать набухание матрикса митохондрий, разрыв внешней мембраны и, как следствие, выход находящихся в межмембранном пространстве цитохрома c и других, так называемых, апоптогенных белков. В связи с этим индукция поры во внутренней мембране митохондрий рассматривается как один из факторов гибели клеток при различных патологических состояниях (Скулачев и др., 2010; Zorov et al., 2014) .

Согласно «классической» гипотезе формирования митохондриальной поры, AДФ/ATФ-антипортер (другое название адениннуклеотидтранслоказа) в присутствии Са2+ связывается с белком матрикса циклофилином D. Циклоспорин А (ЦсА), специфический блокатор поры, нарушает его взаимодействие с AДФ/ATФантипортером и, тем самым, препятствует открытию поры (Rasola and Bernardi, 2011;



Zorov et al., 2014). Было также предположено, что в формировании порового комплекса с циклофилином D принимают участие переносчик фосфата (Leung et al., 2008) и FоF1-ATФсинтаза (Bonora et al., 2013; Giorgio et al., 2013). Эффективным природным индуктором Са2+-зависимой поры во внутренней мембране митохондрий печени является неорганический фосфат (Фн) (Varanyuwatana and Halestrap, 2012). Индукция ЦсАчувствительной поры значительно усиливается при окислительном стрессе (Скулачев и др., 2010; Zorov et al., 2014). Одним из путей моделирования in vitro окислительного стресса в изолированных митохондриях является их инкубация с различными окисляющими агентами, в частности, с трет-бутилгидропероксидом (ТБГ) (Кожина и Самарцев, 2010; Ronchi et al., 2011). Длинноцепочечные,-дикарбоновые кислоты, среди них наиболее эффективна,-гексадекандикарбоновая кислота (ГДК), способны индуцировать Са2+-зависимую пермеабилизацию митохондрий печени по механизму, нечувствительному к ЦсА (Дубинин и др., 2013; Dubinin et al., 2014) .

Са2+-зависимой Изложенные выше механизмы и пути регуляции неспецифической проницаемости изучены главным образом на митохондриях печени и сердца лабораторных крыс и мышей, которые характеризуются относительно короткой продолжительностью жизни (Barja, 2002). Необходимо выяснить, каковы особенности индукции Са2+-зависимой поры в митохондриях животных с большей продолжительностью жизни, чем продолжительность жизни крыс и мышей. Птицы по сравнению с млекопитающими одинаковой массы тела характеризуются более интенсивным метаболизмом, более высокой температурой тела и большей потенциальной максимальной продолжительностью жизни (ПМПЖ) (Hulbert et al., 2007; Furness and Speakman, 2008). Так, например, ПМПЖ голубей составляет 35 лет, что в 8 раз больше ПМПЖ крыс (Montgomery et al., 2011). Однако до сих пор отсутствуют данные о механизме и пути регуляции Са2+-зависимой пермеабилизации в митохондриях жизненно важных органов птиц. Наряду с голубями наше внимание привлекли птицы отряда курообразных (Galliformes) цесарки (Numida meleagris) .

Цесарки серо-крапчатой популяции (СКП) разводится в племенных хозяйствах в качестве резервного генофонда. Цесарки загорской белогрудой породы (ЗБП), отличаются от этой популяции генетически и характеризуются более высокими продуктивными качествами (Забиякин, 2005) .

Цель работы: сравнительное исследование механизмов Са2+-зависимой пермеабилизации митохондрий печени разных видов млекопитающих (мыши, крысы и кролики) и птиц (голуби, цесарки СКП и цесарки ЗБП) .

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи .

1. Определить, каковы особенности окислительного синтеза АТФ и свободного окисления в митохондриях печени указанных млекопитающих и птиц .





2. Выяснить, имеется ли в митохондриях печени цесарок СКП, цесарок ЗБП и голубей ЦсА-чувствительный механизм индукции Ca2+-зависимой поры, как в митохондриях печени млекопитающих .

3. Оценить кинетику транспорта Ca2+ митохондриями печени указанных животных при индукции ЦсА-чувствительной поры. Определить связано ли различие в резистентности к действию Са2+ как индуктору ЦсА-чувствительной поры с особенностями функционирования системы окислительного синтеза АТФ в митохондрий печени животных разных видов .

4. Выяснить, как влияет окисляющий агент ТБГ на индукцию Ca2+-зависимой ЦсА-чувствительной поры в митохондриях печени указанных животных .

Ca2+-зависимой Исследовать действие ГДК как индуктора ЦсАнечувствительной пермеабилизации внутренней мембраны митохондрий печени указанных млекопитающих и птиц. Определить связано ли различие в резистентности к действию ГДК с особенностями функционирования системы окислительного синтеза АТР в митохондрий печени животных разных видов .

Научная новизна работы. Впервые установлено, что в митохондриях печени цесарок СКП, цесарок ЗБП и голубей имеется ЦсА-чувствительный механизм индукции Ca2+-зависимой поры, как в митохондриях печени млекопитающих – крыс, мышей и кроликов. При этом митохондрии печени указанных птиц по сравнению с митохондриями печени млекопитающих обладают большей резистентностью к действию Са2+ и окисляющего агента ТБГ как к индукторам ЦсА-чувствительной поры. Показано, что митохондрии печени голубей, в отличие от митохондрий печени млекопитающих и цесарок, не способны эффективно поглощать и удерживать Ca2+ в матриксе. Установлена специфика в эффективности действия Ca2+ в присутствии Фн как индуктора ЦсА-чувствительной поры в митохондриях печени животных разных видов (мыши, крысы, кролики и цесарки), в том числе в условиях действия окисляющего агента ТБГ. Впервые дана оценка индукции ГДК Ca2+-зависимой ЦсАнечувствительной пермеабилизации внутренней мембраны митохондрий печени мышей, кроликов, голубей, цесарок СКП и цесарок ЗБП. Показано, что в митохондриях печени животных указанных видов различия в резистентности к действию Са2+ как индуктору ЦсА-чувствительной поры и к ГДК как индуктору Са2+зависимой пермеабилизации не связано с особенностями функционирования системы окислительного синтеза АТФ .

Научно-практическое значение работы. Работа имеет, прежде всего, значение для фундаментальной науки в области эволюционной биохимии и биоэнергетики. Результаты исследований используются в учебном процессе в Марийском государственном университете. Новые знания, полученные при выполнении диссертации, позволят лучше понять связанные с функционированием митохондрий механизмы, определяющие различие в видовой продолжительности жизни гомойотермных животных. Знание таких механизмов, в свою очередь, будет способствовать разработке новых подходов к лечению связанных с нарушением функционирования митохондрий возрастных патологий у пожилых людей, а также патологий, возникающих при воздействии на организм экстремальных факторов окружающей среды .

Основные научные положения, выносимые на защиту .

Митохондрии печени птиц: голубей, цесарок СКП и цесарок ЗБП по 1 .

сравнению с митохондриями печени млекопитающих: крыс, мышей и кроликов обладают большей резистентностью к действию Ca2+ и окисляющего агента ТБГ как к индукторам ЦсА-чувствительной поры .

Митохондрии печени голубей, в отличие от митохондрий печени 2 .

указанных млекопитающих и цесарок, не способны эффективно поглощать и удерживать Ca2+ в матриксе и обладают наибольшей резистентностью к индукторам Ca2+-зависимой ЦсА-чувствительной поры и к ГДК как к индуктору перемеабилизации внутренней мембраны .

В митохондрий печени животных указанных видов различия в 3 .

резистентности к действию Са2+ как индуктору ЦсА-чувствительной поры и к ГДК как индуктору Са2+-зависимой пермеабилизации не связаны с особенностями функционирования системы окислительного синтеза АТФ .

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены на 38-м и 39-м Конгрессах федерации европейских биохимических обществ (СанктПетербург, 2013 г.; Париж, 2014 г.); на международных конференциях «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2013 г. и 2015 г.); на международной конференции молодых ученых «Экспериментальная и теоретическая биофизика»

(Пущино, 2014 г.); на 17-ой, 18-ой и 19-ой международных Пущинских школахконференциях молодых ученых (Пущино, 2013 г., 2014 г. и 2015 г.); V международной научной конференции и способы сохранения «Принципы биоразнообразия» (Йошкар-Ола, 2013 г.); 69-ой школе-конференции молодых ученых «Биосистемы: организация, поведение, управление» (Нижний Новгород, 2016г.) Работа выполнена при финансовой Финансовая поддержка работы .

поддержке Федеральной целевой программы Министерства образования и науки Российской Федерации (соглашение 14.В37.21.0191), грантов РФФИ (№ 14-04-00688а и № 16-34-00435 мол_а), государственного задания Министерства образования и науки Российской Федерации (проекты № 4.8257.2013 и № 1365) .

Публикации. По теме диссертации опубликованы 4 статьи в ведущих научных журналах, рекомендованных ВАК, и 12 статей, тезисов докладов региональных, всероссийских и международных научных конференций, также получено авторское свидетельство о государственной регистрации программ для ЭВМ .

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 106 страницах, включая список литературы, иллюстрационный материал включает 36 рисунков и 7 таблиц .

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе были использованы Экспериментальные животные .

млекопитающие зрелого возраста (самцы): белые лабораторные мыши (масса тела 25– 28 г), белые лабораторные крысы (масса тела 210–240 г) и домашние кролики породы серый великан (масса тела 3500-3700 г) .

Птицы зрелого возраста (самцы): сизые голуби (Columba livia) (масса тела 420–460 г), цесарки (Numida meleagris) СКП и ЗБП (масса тела 1570–2100 г). Содержание, кормление и забой животных соответствует необходимым требованиям, изложенным в соответствующих руководствах (Западнюк и др., 1983; Лукьянов, 2008), а также международным правилам «Guide for the Care and Use of Animals» и правилам, утвержденным в системе Министерства высшего и среднего образования СССР (Приказ № 742 от 13 ноября 1984 г.) .

Выделение митохондрий. Митохондрии выделяли из печени животных общепринятым методом дифференциального центрифугирования (Маркова и др., 1999). Среда выделения содержала 250 мМ сахарозу, 1 мМ ЭГТА и 5 мМ МОПСТрис, рН 7,4. Суспензию митохондрий (60 – 70 мг белка в 1 мл) хранили на льду .

Белок определяли биуретовым методом, в качестве стандарта использовали БСА .

Регистрация параметров дыхания и окислительного фосфорилирования митохондрий. Дыхание митохондрий регистрировали полярографическим методом при температуре 25°С (и 39°С при исследовании параметров свободного окисления в митохондриях печени цесарок) с помощью кислородного электрода типа Кларка при постоянном перемешивании с помощью магнитной мешалки. Концентрация кислорода в среде инкубации при 25°C – 240 мкМ (Chance and Williams, 1955) .

Концентрация белка митохондрий в кислородной ячейке составляла ~1,1 – 1,2 мг/мл .

Применяли следующие показатели дыхания и окислительного фосфорилирования: J2

– скорость дыхания митохондрий в присутствии Фн до добавления AДФ (состояние 2 по Чансу); J3 – скорость дыхания митохондрий в присутствии Фн и AДФ (состояние 3 по Чансу); J4 – скорость дыхания митохондрий в присутствии Фн после того, как весь добавленный AДФ был израсходован в процессе синтеза АТФ (состояние 4 по Чансу); Ju – скорость дыхания митохондрий в присутствии протонофорного разобщителя 2,4-динитрофенола в концентрации, вызывающей максимальную стимуляцию дыхания; Jр – скорость синтеза АТФ; RC – отношение величин J3 и J4 (дыхательный контроль по Чансу); PC – отношение величин Jр и J4; AДФ/O – стехиометрический коэффициент, показывающий эффективность окислительного фосфорилирования. Значение коэффициента AДФ/O определяли пульсовым методом (Hinkle and Yu, 1979). Значение величины Jр – как удвоенное произведение величин J3 и AДФ/O. Размерность величин J2, J3, J4 и Ju – нмоль О2/ мин на 1 мг белка;

размерность величины Jр – нмоль AДФ / мин на 1 мг белка; размерность величин RC, PC и AДФ/O – относительные единицы .

Оценка набухания митохондрий. Набухание митохондрий регистрировали по изменению оптической плотности суспензии митохондрий (А) при длине волны 540 нм на спектрометре «КФК- 3-01» («ЗОМЗ», Россия) в кювете объемом 4 мл и при температуре 25С. Для регистрации и первичной обработки данных применяли специально разработанную нами программу (свидетельство о регистрации № 2015619788). Концентрация митохондриального белка в кювете 0,8 – 1,0 мг/мл .

Скорость набухания митохондрий (А540/мин на 1 мг белка) определяли как изменение оптической плотности суспензии митохондрий в течение первой минуты набухания. Амплитуду набухания (А540 на 1 мг белка) определяли как изменение оптической плотности суспензии митохондрий за 10 минут .

Оценка проницаемости внутренней мембраны митохондрий для Ca2+ .

Проницаемость внутренней мембраны митохондрий для Ca2+ оценивали по изменению концентрации этих ионов в среде инкубации с помощью Ca2+селективного электрода и универсального иономера И-500 («Аквилон», Россия) в ячейке объемом 10 мл и при температуре 25С. Концентрация митохондриального белка в кювете была ~ 1,5 мг/мл .

Измерение разности электрических потенциалов на внутренней мембране митохондрий (). оценивали по распределению предварительно добавленного в среду инкубации катиона тетрафенилфосфония (ТФФ+) через внутреннюю мембрану, концентрацию которого регистрировали ТФФ+-чувствительным электродом (Kamo et al., 1979) при 25°С и постоянном перемешивании в открытой ячейке объемом 2 мл с помощью оригинальной многоканальной электрометрической системы Record 4usb. В этих экспериментах среда инкубации содержала 1,6 мкМ ТФФ+. Концентрация митохондриального белка в кювете была ~ 1,5 мг/мл .

Состав среды инкубации митохондрий. В большинстве экспериментов среда инкубации содержала 200 мМ сахарозу, 20 мМ KCl, 5 мМ янтарную кислоту, 1 мМ КН2РО4, 20 мкМ ЭГТА, 10 мМ МОПС-Трис, рН 7,4. При изучении дыхания и окислительного фосфорилирования среда инкубации дополнительно содержала 2 мМ MgCl2 и БСА (0,2-0,4 мг/мл), а концентрации ЭГТА и КН2РО4 были увеличены до 0,5 и 5 мМ соответственно .

Статистическая обработка результатов исследований. Анализ гомогенности дисперсий был выполнен с применением критериев Бартлетта, Кохрена, Хартли. Для анализа данных применяли метод однофакторного дисперсионного анализа или tкритерий Стьюдента. Результаты представлены в виде средних значений ± средняя квадратичная ошибка среднего значения. Статистическая обработка данных проводилась с использованием лицензионных программ STATISTICA 6.0 и Microsoft Excel 2010 .

Реактивы. В работе использовалась 3-[N-Морфолино]пропансульфоновая кислота (МОПС),,-гексадекандикарбоновая кислота (ГДК), рутениевый красный (РК), олигомицин, янтарная кислота, циклоспорин А (ЦсА), очищенный от жирных кислот бычий сывороточный альбумин фракции (БСА) V, трис(гидроксиметил)аминометан, хлорид тетрафенилфосфония, ("Sigma", США), ротенон, ЭГТА ("Serva", Германия), сахароза, АДФ, 2,4- динитрофенол, KCl (“Fluka” Швейцария), КН2РО4, CaCl2, MgCl2 ("Merck", Германия). Использовались растворы олигомицина (2 мг/мл), ротенона (2 мМ), ГДК (20 мМ), ЦсА (1 мМ) в дважды перегнанном этаноле; АДФ (100 мМ) и 2,4-динитрофенола (5 мМ) – в бидистиллированной воде. При проведении экспериментов в контрольных пробах к митохондриям добавлялись растворители в том же объеме, как и в опытах с исследуемыми веществами. Во всех случаях растворители не изменяли исследуемые параметры митохондрий .

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Характеристика дыхания и окислительного фосфорилирования митохондрий печени млекопитающих и птиц разных видов .

Как видно из таблиц 1 и 2, митохондрии печени крыс, голубей и цесарок СКП не отличаются по показателям дыхания и окислительного синтеза АТФ, за исключением скорости разобщенного 2,4-динитрофенолом дыхания. Митохондрии печени мышей отличаются от митохондрий этих животных более высокой скоростью дыхания в отсутствии синтеза АТФ (свободное окисление) и вследствие этого меньшей степенью сопряжения дыхания и окислительного фосфорилирования. В отличие от этого митохондрии печени кроликов характеризуются как меньшей скоростью дыхания в различных состояниях, так и большей степенью сопряжения дыхания и окислительного фосфорилирования. Митохондрии печени цесарок ЗБП характеризуются более низкой скоростью дыхания в состоянии 2 и более высокой в состоянии 4, меньшей скоростью окислительного синтеза АТФ, а также наиболее слабым сопряжением дыхания и окислительного синтеза АТФ .

–  –  –

Установлено, что в митохондриях печени указанных животных скорость свободного окисления как составная часть скорости дыхания в состоянии 3 равна скорости дыхания в состоянии 4. Это свидетельствует о том, что окислительный синтез АТФ не оказывает ингибирующего действия на свободное окисление в состоянии 3. В качестве коэффициента, характеризующего способность митохондрий эффективно синтезировать АТФ, предложено использовать отношение скорости окислительного синтеза АТФ и скорости дыхания в состоянии 4 – коэффициент PC .

Са2+-зависимой Сравнительное исследование индукции ЦсАчувствительной поры в митохондриях печени млекопитающих и птиц разных видов .

Добавление CaCl2 к митохондриям печени крыс, инкубируемых в сахарозной среде в присутствии Фн и энергизованных путем окисления сукцината, приводит к существенному снижению оптической плотности суспензии (рис. 1, а). Аналогичные результаты получены при добавлении CaCl2 в том же количестве и к митохондриям печени мышей (рис. 1, б) и кроликов (рис. 1, в). В присутствии ЦсА эффективное набухание митохондрий печени этих животных наблюдается только при добавлении CaCl2 в количестве порядка 1000 нмоль на 1 мг белка. Полученные данные согласуются с литературными источниками, свидетельствующими о формировании в присутствии Фн Са2+-зависимой ЦсА-чувствительной поры во внутренней мембране митохондрий печени млекопитающих (Petronilli et al., 1993; Leung et al., 2008;

Varanyuwatana, Halestrap et al., 2012) .

Митохондрии печени кроликов отличаются от митохондрий печени крыс и мышей по амплитуде набухания (рис. 1, табл. 3). Добавление к митохондриям печени этих животных известного каналообразующего агента аламетицина (Brustovetsky et al., 2002; Gostimskaya et al., 2003), вызывает дальнейшее изменение оптической плотности не более чем на 20% (рис. 1). Это свидетельствует о том, что лишь малая часть популяции митохондрий является резистентной по отношению к действию применяемых нами индукторов поры .

Митохондрии печени цесарок СКП (рис. 2, а) и ЗБП (рис. 2, б), также как митохондрии печени голубей (рис. 2, в) не набухают при добавлении CaCl2 в количестве 250 нмоль на 1 мг белка. В этом случае количество добавляемого CaCl2 должно быть повышено как минимум до 875 нмоль на 1 мг белка для митохондрий цесарок СКП (рис. 2, г) и цесарок ЗБП (рис. 2, д) и до 1000 нмоль на 1 мг белка для митохондрий печени голубей (рис. 2, е). В отличие от митохондрий печени крыс, добавление аламетицина к митохондриям печени цесарок СКП, цесарок ЗБП и голубей приводит к дальнейшему существенному усилению их набухания (рис. 2) .

Следовательно, имеется существенная доля митохондрий резистентная к действию Са2+ и Фн как к индукторам поры. Скорости и амплитуды набухания митохондрий этих животных приведены в табл. 3. Митохондрии печени голубей обладают наименьшей скоростью и амплитудой набухания этих органелл .

–  –  –

Таблица 3. Сравнение скорости и амплитуды набухания митохондрий печени крыс, мышей и кроликов в условиях индукции Ca2+/Фн -индуцируемой неспецифической проницаемости внутренней мембраны .

–  –  –

Для митохондрий печени крыс показано, что импульсное добавление к суспензии 160 нмоль на 1 мг белка CaCl2 в отсутствии ЦсА вызывает необратимое снижение. Для митохондрий печени мышей и кроликов аналогичные концентрации CaCl2 составляют в среднем 100 нмоль и 40 нмоль соответственно. В присутствии ЦсА концентрация CaCl2, необходимая для индукции необратимого падения возрастает в 6-8 раз .

Концентрация Са2+, вызывающая полное падение мембранного потенциала в митохондриях печени птиц, существенно выше аналогичной концентрации для митохондрий печени исследуемых нами млекопитающих и составляет в среднем 930 нмоль CaCl2 на 1 мг белка. ЦсА повышает концентрацию CaCl2 необходимую для необратимого снижения до 1330 нмоль CaCl2 на 1 мг белка. Митохондрии печени голубей практически нечувствительны к добавкам ионов кальция – даже при добавлении значительного количества CaCl2 не происходит видимого изменения .

Са2+ Изучение кинетики поглощения митохондриями печени 3.3 .

млекопитающих и птиц разных видов при индукции ЦсА-чувствительной поры .

Кальциевая емкость митохондрий .

В отсутствие ЦсА митохондрии печени крыс способны полностью поглощать Ca2+ при условии пятикратного добавления CaCl2 по 13,3 нмоль на 1 мг белка и удерживать его в матриксе как минимум 10 мин (рис.3, а). В этом случае только после шестой добавки CaCl2 наблюдается выход Ca2+ из митохондрий. Выход Ca2+ из митохондрий печени мышей и кроликов наблюдается соответственно после пятой и третьей добавок CaCl2 в том же количестве (рис.3, б, в). В отличие от митохондрий печени млекопитающих, митохондрии печени цесарок СКП, также инкубируемые в сахарозной среде с Фн, способны даже в отсутствие ЦсА поглощать и удерживать Ca2+ при условии шестикратного добавления CaCl2 по 133 нмоль на 1 мг белка .



Аналогичные свойства были обнаружены и у митохондрий печени цесарок ЗБП. Для митохондрий печени голубей было отмечено, что они практически не способны поглощать и удерживать даже относительно небольшие добавки CaCl2 (рис.3, г-е) .

Способность Ca2+ индуцировать открытие поры в митохондриях можно выразить количественно как кальциевая емкость (КЕ) митохондрий, другими словами, то максимальное количество Ca2+, которое может быть аккумулировано в матриксе без последующего открытия поры (Basso et al., 2008; Varanyuwatana, Halestrap, 2012; Giorgio et al., 2013). Исходя из кинетики поглощения Са2+ митохондриями исследуемых животных были получены значения их КЕ, представленные в сводной таблице 4. Исключение составляют голуби, митохондрии которых, как упоминалось выше, практически не поглощают ионы кальция .

Таблица 4. Сравнение кальциевой емкости (нмоль CaCl2 на 1 мг белка) митохондрий печени различных животных в отсутствии и присутствии добавок .

–  –  –

В условиях индуцированного ТБГ окислительного стресса наблюдается снижение КЕ митохондрий печени животных (табл. 4). Наибольший эффект ТБГ наблюдается в митохондриях печени кролика (снижение КЕ на 77%), в меньшей снижение степени – в митохондриях печени мышей и крыс (снижение КЕ на 56 и 57% снижение соответственно). В то время как в митохондриях печени цесарок СКП и ЗБП ТБГ менее эффективен (снижение КЕ на 35 и 38% соответственно). Эти и приведенные снижение выше данные свидетельствуют о том, что по сравнению с митохондриями печени крыс и мышей митохондрии печени кроликов являются менее резистентными к действию изучаемых нами индукторов поры, в то время как, митохондрии печени цесарок существенно более устойчивы к действию окисляющего агента ТБГ как индуктору Са2+-зависимой поры Как уже отмечалось выше, определить КЕ для зависимой поры. выше митохондрий печени голубей не представляется возможным. Однако исходя из Однако, данных по набуханию митохондрий печени этих птиц (рис. 6) можно также говорить об их высокой устойчивости к действию окисляющего агента ТБ как индуктору ТБГ Са2+-зависимой поры .

3.5. Действие ГДК как индуктора Ca2+-зависимой ЦсА-нечувствительной нечувствительной неспецифической проницаемости внутренней мембраны митохондрий печени указанных млекопитающих и птиц .

Как показано на рис. 7, внесение к митохондриям печени крыс, мышей и кроликов последовательно CaCl2 (200 нмоль на 1 мг белка и ГДК (20 нмоль на 1 мг белка) белка) в присутствии ЦсА приводит к снижению оптической плотности суспензии, что свидетельствует о высокоамплитудном набухании этих органелл при формировании ЦсА-нечувствительной пермеабилизации (Дубинин и др., 2013;

нечувствительной Дубинин Dubinin et al., 2014). При аналогичных экспериментальных условиях внесение к митохондриям печени цесарок и голубей последовательно CaCl2 и ГДК также приводит к снижению оптической плотности суспензии (рис. 6 В контрольных 6) .

экспериментах изменения оптической плотности суспензии митохондрий печени изученных животных не наблюдается при добавлении только CaCl2 или только ГДК в указанных выше концентрациях Митохондрии печени птиц характеризуются концентрациях .

меньшей скоростью и амплитудой набухания, по сравнению с митохондриями печени млекопитающих (табл. 5) .

–  –  –

Добавление ГДК к суспензии митохондрий печени указанных животных, предварительно нагруженных Са2+ в присутствии ЦсА, во всех случаях приводит к быстрому увеличению концентрации этих ионов, что свидетельствует о выходе их из матрикса в среду инкубации. При этих условиях добавление ГДК после внесения Ca2+ приводит к быстрому и полному падению митохондрий печени всех животных .

Полученные данные свидетельствуют о том, что в митохондриях печени птиц ГДК так же, как в митохондриях печени млекопитающих индуцирует Ca2+-зависимую ЦсА-нечувствительную пермеабилизацию внутренней мембраны, однако, с меньшей эффективностью .

Проведенные исследования не выявили связи между скоростью (рис. 8) и ГДК/Са2+-зависимой амплитудой ЦсА-нечувствительной (r=0,06; p=0,90) проницаемости внутренней мембраны и скоростью синтеза АТФ (JP) для митохондрий печени крыс, мышей, кроликов, цесарок СКП, цесарок ЗБП и голубей .

Кроме того было показано отсутствие связи (r=0,51; p=0,3) между скоростью набухания и коэффициентом PC для митохондрий указанных животных. Также установлено отсутствие связи (r=0,48; p=0,34) между амплитудой набухания и коэффициентом PC для митохондрий печени этих животных .

Следовательно, в митохондрий печени животных указанных видов различие в Са2+-зависимой резистентности к действию ГДК как индуктору ЦсАнечувствительной пермеабилизации внутренней мембраны не связано с особенностями окислительного синтеза АТФ .

–  –  –

4. В присутствии ТБГ индукция Ca2+-зависимой ЦсА-чувствительной поры в митохондриях печени указанных животных наблюдается при добавлении CaCl2 в существенно меньших количествах, чем в отсутствии этого окисляющего агента .

Наибольший эффект ТБГ наблюдается в митохондриях печени кролика, в то время как в митохондриях печени цесарок СКП, цесарок ЗБП и голубей этот окисляющий агент наименее эффективен .

5. В митохондриях печени цесарок СКП, цесарок ЗБП и голубей ГДК индуцирует Ca2+-зависимую ЦсА-нечувствительную пермеабилизацию внутренней мембраны, но с меньшей эффективностью чем в митохондриях печени млекопитающих. Различие в резистентности к действию ГДК митохондрий печени указанных животных не связано с особенностями окислительного синтеза АТФ .

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Работы, опубликованные в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, определенных ВАК:

1. Дубинин М.В., Ведерников А.А., Хорошавина Е.И., Самарцев В.Н .

Индукция,-гексадекандиоловой кислотой кальций-зависимой циклоспорин Анечувствительной неспецифической проницаемости внутренней мембраны митохондрий печени и освобождения цитохрома С в средах различной ионной силы // Биохимия. – 2014. – Т. 79. – Вып. 6. – С. 726-733 .

2. Самарцев В.Н., Ведерников А.А., Дубинин М.В., Забиякин В.А .

Сравнительное исследование свободного окисления в митохондриях печени «дикой»

серо-крапчатой популяции и продуктивных домашних пород цесарки Numida meleagris // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. – 2014. – Т. 50. – № 2. – С. 160–162 .

3. Vedernikov A.A., Dubinin M.V., Zabiakin V.A., Samartsev V.N. Ca2+-dependent nonspecific permeability of the inner membrane of liver mitochondria in the guinea fowl (Numida meleagris) // Journal of Bioenergetics and Biomembranes. – 2015. – V. 47. – №. 3 .

–Р. 235–242 .

4. Дубинин М.В., Ведерников А.А., Хорошавина Е.И., Адакеева С.И., Самарцев В.Н. Индукция кальций-зависимой неспецифической проницаемости внутренней мембраны в митохондриях печени млекопитающих и птиц:

сравнительное исследование // Биологические мембраны. – 2015. – Т. 32. – № 5–6. – С. 328–337 .

Свидетельства о государственной регистрации программ для электронных вычислительных машин Свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ №2015619788. Приложение для обработки данных, передаваемых фотометром КФКЗОМЗ / Юсупов Н.В., Бакланова Н.Б., Виноградов В.О., Ведерников А.А., Дубинин М.В., Самарцев В.Н.; заявитель и правообладатель ФГБОУ ВПО «Марийский государственный университет». – Заявка № 2015616662 от 20.07.2015; Зарегистр. в реестре программ для ЭВМ 15.09.2015 .

Статьи, тезисы докладов региональных, всероссийских и международных конференций Ведерников А.А., Дубинин М.В., Самарцев В.Н., Хорошавина Е.И., 1 .

Трубянов А.Б. Сравнение функционального состояния митохондрий печени различных популяций цесарки Numida meleagris L. по признаку свободного окисления // Принципы и способы сохранения биоразнообразия: материалы V Международной научной конференции в 2 ч. – Мар. гос. ун-т. – Йошкар-Ола, 2013. – Часть II. – с. 18–22 .

Ведерников А.А., Волкова В.В., Дубинин М.В., Хорошавина Е.И., 2 .

Самарцев В.Н., Трубянов А.Б. Особенности свободного окисления в митохондриях печени и скелетных мышц различных популяций цесарки // Биология – наука XXI века. 17-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых (Пущино, 21 – 26 апреля 2013 г.). Сборник тезисов. – Пущино, 2013. – С. 403 .

Дубинин М.В., Ведерников А.А., Адакеева С.И., Хорошавина Е.И., 3 .

Самарцев В.Н. Физиологические модуляторы циклоспорин А-нечувствительной неспецифической проницаемости внутренней мембраны митохондрий печени индуцированной ионами кальция и,-гексадекандиоловой кислотой // Материалы международной конференции и внутриклеточная сигнализация»

«Рецепторы (Пущино, 27 – 30 мая 2013 г.). Сборник статей. – Пущино, 2013. – С. 666–670 .

Dubinin M., Khoroshavina E., Vedernikov A., Adakeeva S., Samartsev V .

4 .

Induction of non-selective permeability of the inner membrane of rat liver mitochondria by,-dicarboxylic acids // FEBS J. – 2013. – V. 280. – Supplement 1. – P. 252-253 .

Dubinin M., Vedernikov A., Khoroshavina E., Adakeeva S., Samartsev V .

5 .

The effect of ionic strength of incubation medium on the cytochrome c release from liver mitochondria under conditions of the pore opening by,-hexadecanedioic acids // FEBS J .

– 2013. – V. 280. – Supplement 1. – P. 255 .

Самарцев В.Н., Дубинин М.В., Ведерников А.А., Адакеева С.И., 6 .

Хорошавина Е.И. Взаимодействие свободных жирных кислот с митохондриями печени животных: механизмы и физиологическое значение // Принципы и способы сохранения биоразнообразия: материалы V Международной научной конференции в 2 ч. – Мар. гос. ун-т. – Йошкар-Ола, 2013. – Часть II. – с. 47–52 .

Vedernikov A.A., Dubinin M.V., Zabiyakin V.A., Adakeeva S.I., Samartsev 7 .

V.N. The study of calcium capacity and induction of Ca2+-dependent nonspecific permeability of the inner membrane in the liver mitochondria of guinea fowl // FEBS J. – 2014. – V. 281 (Suppl. 1). – P. 367 .

Дубинин М.В., Хорошавина Е.И., Ведерников А.А., Адакеева С.И., 8 .

Юсупов Н.В., Самарцев В.Н. Влияние малоната и неорганического фосфата на циклоспорин А-нечувствительную Са2+-зависимую неспецифическую проницаемость внутренней мембраны митохондрий печени, индуцированную,-диоловыми кислотами // Международная конференция молодых ученых. 27-29 октября 2014 г .

Экспериментальная и теоретическая биофизика `14. Сборник тезисов. – 2014. – С .

154 .

Ведерников А.А., Дубинин М.В., Адакеева С.И., Самарцев В.Н .

9 .

Особенности индукции Са2+-зависимой неспецифической проницаемости внутренней мембраны митохондрий печени цесарок Numida meleagris L. // Биология – наука XXI века. 18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых (Пущино, 21 – 25 апреля 2014 г.). Сборник тезисов. – Пущино, 2014. – С. 85 .

10. Дубинин М.В., Хорошавина Е.И., Ведерников А.А., Белослудцев К.Н., Самарцев В.Н. Пальмитиновая кислота и продукты её -окисления как индукторы Са2+-зависимой неспецифической пермеабилизации митохондрий и липосом // Биология – наука XXI века. 19-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых (Пущино, 20 – 24 апреля 2015 г.). Сборник тезисов. Пущино, 2015. – С. 91–92 .

11. Дубинин М.В., Ведерников А.А., Хорошавина Е.И., Адакеева С.И., Самарцев В.Н. Индукция кальций-зависимой неспецифической проницаемости внутренней мембраны в митохондриях печени млекопитающих и птиц:

сравнительное исследование // Материалы международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация», Пущино, 25 – 28 мая 2015 г. Сборник статей. Том .

2. Пущино, 2015. – С. 451–455 .

12. Ведерников А.А., Дубинин М.В., Самарцев В.Н. Са2+-зависимая неспецифическая проницаемость внутренней мембраны митохондрий печени птиц // Биосистемы: организация, поведение и управление: Тезисы докладов 69-й Всероссийской школы-конференции молодых ученых (Н. Новгород, 27–29 апреля 2016 г.). Н. Новгород, Университет Лобачевского. – 2016. – С. 26 .

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АДФ – аденозин-5’-дифосфат;

АТФ – аденозин-5’-трифосфат;

БСА – бычий сывороточный альбумин;

ГДК -,- гексадекандикарбоновая кислота;

ДНФ – 2,4-динитрофенол;

МОПС - 3-[N-Морфолино]пропансульфоновая кислота, буфер;

ПМПЖ – потенциальная максимальная продолжительность жизни;

РК – рутениевый красный ТБГ – трет-бутилгидропероксид;

Трис-OH – трис-(гидроксиметил)аминометан;

ТФФ+ – катион тетрафенилфосфония;

Фн – фосфат неорганический;

ЦсА – циклоспорин А .

ЭГТА – этиленгликоль - бис - (2-аминоэтиловый эфир) - N, N, N, N - тетрауксусная кислота;

– разность электрических потенциалов на внутренней мембране митохондрий .






Похожие работы:

«Секция 3: Социально-гуманитарные аспекты экологии Литература.1. Акимов В.А., Соколов Ю.И. Проблемы анализа риска. – 2010. – Т. 7, № 4. – С. 29–33.2. Яковлев С.Ю. Когнитивные модели и технологии обеспечения безопасности развития региональных промышленно-природных кластеров Арктической зоны Российск...»

«Руководство Общее руководство осуществляет организационный комитет (Оргкомитет). Оргкомитет проводит работу по подготовке и проведению конференции и конкурсов, формирует состав жюри, утверждает программу работы конф...»

«Заметки по методикам ихтиологических исследований Решетников Ю.С., Попова О.А. Институт проблем экологии и эволюции им.А.Н.Северцова РАН, Москва Звенигород—23.04.2015. Канули в вечность 1. Коэффициенты упитанности по Фультону и Кларк; 2 – Морфофи...»

«Услуги Все Включено действительны до 24:00 РЕСТОРАНЫ 1. Cosmos Главный ресторан, где подают блюда средиземноморской и Международной кухни (Корпус Maris) Открыт ежедневно Ранний...»

«Князев Николай Александрович ВЛИЯНИЕ ПОЛИХРОМАТИЧЕСКОГО ВИДИМОГО И ИНФРАКРАСНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА РОСТ ОПУХОЛЕЙ 03.03.04 – Клеточная биология, цитология, гистология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 20...»

«Казанский Федеральный Университет Институт фундаментальной медицины и биологии Кафедра морфологии и общей патологии ЛЕКЦИЯ 6 Топографическая анатомия и операции на органах шеи Границы, области, треугольники Органы, фасции и пространства шеи Оперативные доступы к органам шеи Операции на органах, сосудах, мыш...»

«РАБОЧАЯ ПРОГРАММА по учебному предмету "Технология" 7 класс Год реализации: 2018-2019 учебный год Составлена на основе программы: Технология: 5-8 классы/ А.Т. Тищенко, Н.В.Синица. – М.: Вентана –Граф, 2015. по напра...»




 
2019 www.mash.dobrota.biz - «Бесплатная электронная библиотека - онлайн публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.