WWW.MASH.DOBROTA.BIZ
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - онлайн публикации
 

«ПЕЧКОВСКИЙ Евгений Васильевич Роль полиморфизма генов метаболизма половых стероидных гормонов в формировании риска развития рака молочной железы у русских жительниц Алтайского края ...»

иси

ПЕЧКОВСКИЙ

Евгений Васильевич

Роль полиморфизма генов метаболизма половых

стероидных гормонов в формировании риска развития

рака молочной железы у русских жительниц

Алтайского края

03.01.04 - биохимия

03.01.07 - молекулярная генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

21 Н Я 2013

О

Новосибирск - 2013

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук

Научные руководители:

чл.-корр. РАМН, профессор Кушлинский Николай Евгеньевич Д.М.Н., к.б.н. Филипенко Максим Леонидович

Официальные оппоненты:

Макарова Светлана Ивановна, д.б.н., старший научный сотрудник лаборатории метаболизма лекарств и фармакокинетики Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт молекулярной биологии и биофизики» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук Гимаутдинова Ольга Ивановна, д.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт биохимии»

Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Ведущая организация:



Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Новосибирский национальный исследовательский государственный университет»

Защита состоится.{40» декабря 2013 г. в « У ^ » часов на заседании диссертационного совета Д 001.034.01 на базе Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт биохимии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук по адресу: 630099, Новосибирск, ул. Тимакова, 2 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт биохимии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук .

Автореферат разослан « О)) /о::?^ _2013 г .

Ученый секретарь диссертационного совета Русских Г.С .

К.6.Н .

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Рак молочной железы (РМЖ) является самым распространённым онкологическим заболеванием среди женщин. Вероятность развития этого заболевания на протяжении жизни составляет в среднем 9-10 %, а в случае наличия рака молочной железы в семейном анамнезе - как минимум 20% (Willems, 2007). Как заболеваемость, так и смертность от данного вида неоплазии в настоящее время имеют тенденцию к неуклонному росту. Считают, что РМЖ имеет мультифакториальную этиологию - на риск его возникновения оказывают влияние как генетические факторы, так и факторы окружающей среды. Роль генетических факторов более высока при семейной форме рака молочной железы, которая составляет около 10% от общей заболеваемости этим видом неоплазии. В этом случае к развитию опухоли приводят высокопенетрантные мутации в таких генах, как BRCA1 и BRCA2, СНЕК2, PTEN, ATM (Dunning et al, 1999). Спорадическая форма развивается, как правило, у женщин старще 40-45 лет, не имеющих семейной отягощенности по этому заболеванию. К развитию такой формы рака могут приводить аллельные варианты генов в сочетании с воздействием внешних факторов (канцерогенные вещества, курение и потребление алкоголя, ионизирующее излучение, стресс, травма молочных желез и др.) Идентификация генетических вариантов, ассоциированных с увеличением риска развития опухоли, открывает новые возможность для прогнозирования риска возникновения РМЖ и ранней его диагностики, а значит и успещного лечения этого заболевания .



Известно, что половые стероидные гормоны (эстрогены, андрогены, прогестерон) необходимы для правильного развития и функционирования молочных желез. Действие этих гормонов осуществляется через геномные и негеномные механизмы. В первом случае димеризованные комплексы рецепторгормон связываются с респонсивными элементами ДНК и регулируют экспрессию генов. Во втором случае гормоны через свои рецепторы взаимодействуют с участниками МАРК-киназного пути внутриклеточной передачи сигнала, и таким образом участвуют в регуляции эффектов других сигнальных молекул. Метаболизм стероидных гормонов является важным регулятором гормонального гомеостаза в молочной железе, поддерживая оптимальную концентрацию гормонов в этом органе. Нарущение метаболизма половых стероидных гормонов может приводить к аккумуляции соединений, обладающих способностью индуцировать пролиферацию клеток и ингибировать апоптоз, а также повреждать генетический материал. Это может лежать в основе злокачественной трансформации .

К настоящему времени в мировой литературе опубликован ряд исследований, в которых изучали влияние аллельных вариантов генов метаболизма половых стероидных гормонов на риск развития РМЖ. Тем не менее, результаты работ, выполненных на популяциях различного этнического происхождения, противоречивы и не позволяют однозначно ответить на вопрос о роли полиморфизма этой группы генов в развитии данной патологии. Таким V образом, исследование ассоциации полиморфных вариантов генов метаболизма половых стероидных гормонов с риском развития РМЖ в русской этнической группе является важной и актуальной задачей .

Цель и задачи исследования - изучение ассоциации полиморфизма генов метаболизма половых стероидных гормонов с риском развития рака молочной железы у русских жительниц Алтайского края .

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Определить частоты аллелей и генотипов полиморфных локусов rsl056836 в гене CYP1B1, rs 1048943 в гене CYP1A1, rs762551 в гене CYP1A2, rs2470152 в гене CYP19A1, rsl042838 в гене PGR и rs743572 в гене CYP17A1 в выборке женщин, больных спорадическим раком молочной железы, и в группе контроля .

2. Выполнить анализ ассоциации аллелей и генотипов вышеуказанных полиморфных локусов с риском развития рака молочной железы .

3. Исследовать влияние аллельных вариантов данных полиморфных локусов на риск рака молочной железы в подгруппах женщин с разным уровнем экспрессии рецепторов прогестерона (PGR), эстрогенов (ER) и HER2/neu в опухолевых клетках, в подгруппах женщин с разной продолжительностью лактации, а также в пре- и постменопаузе .





Научная новизна работы Впервые была изучена ассоциация полиморфных локусов rsl056836 в гене CYP1B1, rsl048943 в гене CYP1A1, rs762551 в гене CYP1A2, rs2470152 в гене CYP19A1, rsl042838 в гене PGR и rs743572 в гене CYP17A1 с риском возникновения РМЖ в популяции этнических русских на представительной выборке, состоящей из 670 женщин, больных спорадическим раком молочной железы, и 480 женщин без онкологических заболеваний. При этом ассоциация локуса rs2470152 в гене CYP19A1 с риском данного заболевания исследована впервые. При сравнении случай-контроль ни для одного из локусов не было продемонстрировано ассоциации с риском данного заболевания после введения поправки на множественное сравнение. Кроме этого, впервые был проведен анализ влияния вышеописанных полиморфных вариантов на риск РМЖ в подгруппах женщин, имеющих разную продолжительность лактации, разный уровень экспрессии рецепторов PGR, ER и HER2/neu в опухолевой ткани и у женщин в пост- и пременопаузе. Впервые выявлена ассоциация локуса rs 1042838 в гене PGR с увеличением риска РМЖ в группе женщин имевших опухоли с низким уровнем экспрессии рецепторов стероидных гормонов и рецептора HER2/neu, а также локуса rsl048943 в гене CYP1A1 с риском развития РМЖ в подгруппе женщин, не кормивших грудью .

Теоретическое и практическое значение работы Результаты данной работы вносят вклад в понимание молекулярно-генетических и патофизиологических механизмов развития рака молочной железы, подтверждая гипотезу о роли нарушения баланса метаболизма половых стероидных гормонов в этиологии данного заболевания. Выявленные биологические маркеры PGR rsl042838 и CYP1A1 rsl048943, ассоциированные с риском возникновения РМЖ, могут быть использованы в дальнейшем для прогнозирования риска развития данного заболевания при условии подтверждения обнаруженных ассоциаций на независимых выборках русского этнического происхождения. В перспективе, возможно, это будет способствовать внедрению персонализированного подхода к профилактике РМЖ у пациенток .

Помимо этого, в настоящей работе было проанализировано распределение частот аллелей и генотипов полиморфных локусов в генах метаболизма половьгх стероидных гормонов в выборке русских жительниц Алтайского края, что вносит вклад в изучение особенностей генетической структуры жигелей данного региона .

Основные положения, выносимые на защиту

1. Полиморфный локус rs1042838 в гене PGR ассоциирован с увеличением риска развития рака молочной железы в группе опухолей с низким уровнем экспрессии рецепторов стероидных гормонов (для аллеля Т: 0 R = 1.59, р =

0.02 в подгруппе с низким уровнем рецептора эстрогена; 0 R = 1.52, р = 0.04 в подгруппе с низким уровнем рецептора прогестерона) и в фуппе с низким уровнем экспрессии рецептора HER2/neu (для аллеля Т: 0 R = 1.82, /5 = 0.002) .

2. Полиморфный локус rs048943 в гене CYP1A1 увеличивает риск развития рака молочной железы в подгруппе женщин, не кормивших грудью (р = 0.002) .

3. Аллельные варианты генов метаболизма половых стероидных гормонов rsl056836 в гене CYP1BI, rs762551 в гене CYPJA2, rs2470152 в гене CYP19A1 и rs743572 в гене CYPI7A1 не ассоциированы с риском развития рака молочной железы в исследуемой выборке женщин, либо ассоциация мала для выявления при данном размере анализируемых групп .

Личный вклад автора Автор организовал и лично участвовал в сборе и обработке первичного биоматериала, создании системы холодовой цепи доставки образцов, формировании экспериментальной выборки и контрольной группы на базе филиала ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН в г. Барнауле, составлении таблиц клинических признаков и формировании критериев разделения пациентов на группы и подгруппы. Автор проводил технические работы по выделению и амплификации ДНК на базе лаборатории фармакогеномики Института химической биологии и фундаментальной медицины РАН в г. Новосибирске. На основании полученных результатов автором проведен статистический анализ ассоциации полиморфных локусов с риском возникновения РМЖ, в том числе в выделенных подфуппах. К обсуждению вопросов по ходу написания работы автором привлекал ведущих специалистов по теме проводимых исследований, по результатам исследования написаны и опубликованы статьи, а по материалам обзора литературы опубликована монография «Половые стероидные гормоны и рак молочной железы» .

Апробация работы По теме диссертации опубликовано 2 статьи в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых научных изданий и журналов, рекомендуемых ВАК. Основные положения и результаты работы были представлены и обсуждены на Российской научно-практической конференции с международным участием «Высокие технологии в онкологии» (Барнаул, 2012) и Научно-практической конференции с международным участием «Инновации в лабораторной медицине» (Новосибирск, 2012) .

Структура и объём работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 112 страницах машинописного текста, содержит 16 таблиц и иллюстрирована 13 рисунками .

Список литературы содержит 257 библиографических источников .

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выборки. Выборка женщин со спорадической формой рака молочной железы и контрольная группа были сформированы в рамках эпидемиологического исследования, проводимого Алтайским филиалом ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН. Все женщины принадлежали к европеоидной расе русской этнической группы и проживали на территории Алтайского края РФ. Все члены выборок подписывали информированное согласие в соответствии с требованиями этического комитета. В контрольную группу было включено 480 женщин (средний возраст - 53.9 ± 12.6), не имеющих онкологических заболеваний. Экспериментальная выборка состояла из 670 женщин (средний возраст - 56.3 ± 7.8 лет) с гистологически верифицированным диагнозом РМЖ. Из них 529 (79%) пациенток имело РМЖ в постменопаузе, 141 (21%) - в пременопаузе. Уровни экспрессии ER, PGR и HER2/neu исследовали в опухоли у 60% пациенток иммуногистохимическим (ИГХ) методом, который основан на специфическом связывании антител, меченных специальными красителями, с выявляемыми молекулами в биологическом материале (табл. 1) .

Выраженность экспрессии оценивали в баллах от О до 300 по шкале Н-счёта, используя следующую формулу: Н = ЗхА + 2хВ + 1хС, где А - процент сильноокрашенных ядер опухолевых клеток, В - процент умеренно окрашенных ядер, С - процент слабоокрашенных ядер. Основываясь на результатах ИГХ исследования, для дальнейшего анализа были вьщелены подгруппы женщин с низким (от О до 50 баллов) и высоким (100 и выше баллов) уровнем экспрессии рецепторов PGR, ER и HER2/neu в опухолевых клетках .

Таблица 1. Уровень экспрессии ER, PGR и HER2/neu в опухолевой ткани

–  –  –

Для 81% женщин из контрольной и 75% женщин из экспериментальной выборки имелась информация о продолжительности лактации (табл. 2) .

Таблица 2. Продолжительность лактации у женщин из контрольной и экспериментальной групп .

–  –  –

Определение генотипов. ДНК выделяли из венозной крови с использованием стандартной процедуры, включающей выделение и лизис клеток крови, гидролиз белков протеиназой К, очистку ДНК экстракцией примесей фенолхлороформом и осаждение ДНК этанолом. Данный метод является трудоёмким и затратным по времени, тем не менее позволяет получить большой выход материала (около 2,5 мкг ДНК из 3-4 мл крови). Кроме того, ДНК, выделенная данным методом, содержит минимальное количество примесей, что является важным преимуществом данного метода, поскольку примеси могут снижать эффективность полимеразной цепной реакции (ПЦР) .

Определение генотипов полиморфных локусов rs 1056836 в гене CYP1B1, rsl048943 в гене CYP1A1, rs762551 в гене CYP1A2, rs2470152 в гене CYPJ9A1 и rsl042838 в гене PGR проводилось методом ПЦР в режиме реального времени с использованием конкурирующих TaqMan-зондов, комплиментарных полиморфной последовательности ДНК. Данный метод является быстрым и простым в исполнении и позволяет наблюдать картину накопления продукта непосредственно во время реакции. Вследствие этого, не требуется этап электрофоретического анализа продуктов амплификации, который всегда сопряжен с риском контаминации реагентов наработанными фрагментами ДНК .

На рис. 1 в качестве примера представлены кривые накопления флюоресценции и кластеризация образцов на основе интенсивности флюоресценции для полиморфного локуса CYP1B1 rsl056836 .

Для локуса rs743572 в гене CYP17A1 нуклеотидное окружение полиморфного участка ДНК не позволяло подобрать TaqMan зонды, имеющие оптимальную температуру отжига, поэтому для определения генотипов использовали более трудоёмкий метод, также основанный на ПЦР в режиме реального времени ^ метод аллель-специфичной ПЦР с использованием интеркалирующего красителя SYBR Green I (индикатора начилия двуцепочечной ДНК в образце) .

На рисунке 2 представлены кинетические кривые накопления флюоресценции, а также график производных кривых плавления для трех генотипов локуса CYP17A1 rs743572 .

ПЦР проводили на ДНК-амплификаторах iCycler iQ5 и CFX96 («Bio-Rad», США) .

Статистическая обработка данных. Сравнение частот встречаемости аллелей и генотипов исследуемых локусов в опытной и контрольной группах проводили с использованием критерия х^, тест на соответствие распределения генотипов равновесию Харди-Вайнберга - с использованием точного критерия Фишера. Различия в частотах считали статистически значимыми при уровне значимости р 0.05. Для оценки степени выраженности влияния полиморфных локусов на риск РМЖ использовали отношение шансов (OR) с его 95% доверительным интервалом (C.I.). Вычисления производили с помощью он-лайн программы DeFinetti (hnp://iha2.helmholtz-muenchen.de/cgi-bin/hw/hwal.pl'). В настоящем исследовании также была проведена оценка значений OR, которые со статистической мощностью, равной 80%, могут быть выявлены при данном размере анализируемых групп. Вычисления были проведены с помощью онлайн программы Genetic Power Calculator (http://pngii.rrmh.har\ard.eda/~purce!l/gpcA .

–  –  –

Рисунок 2. Кинетические кривые накопления продуктов амплификации для трех генотипов полиморфного локуса СР17А1 Г5743572 .

а) генотип ТТ, б) генотип СС, в) генотип СТ, г) график производной кривой плавления .

–  –  –

Анализ ассоциации полиморфного локуса rsl056836 гена CYPIB1 с риском РМЖ Фермент CYP1B1 экспрессируется в ткани молочной железы и других органах и катализирует реакцию гидроксилирования эстрогенов по 4 положению. Продукты этой реакции, 4-гидроксиэстрогены, обладают потенциальным генотоксическим и мутагенным эффектом. Кроме того, они медленнее, чем эстрогены, диссоциируют от эстрогеновых рецепторов и могут оказывать более сильное пролиферативное воздействие на клетки молочных желез. Минорной активностью этого фермента является образование 2гидроксиэстрогенов, не обладающих канцерогенными свойствами, и 16гидроксиэстрогенов, способных ковалентно связываться с рецепторами и вызывать стойкий пролиферативный эффект в клетках-мищенях. Фермент CYP1B1 также задействован в метаболической активации проканцерогенов, таких как полициклические ароматические углеводороды и гетероциклические ароматические амины. В исследовании Wen et al, (2007) было показано достоверное увеличение экспрессии данного фермента в опухолевой ткани молочной железы по сравнению с нормальной .

Нуклеотидная замена C4326G (rsl056836) в гене CYP1B1 приводит к аминокислотной замене Leu432Val в последовательности фермента CYP1B1 .

Функциональный эффект данной замены в настоящее время ещё до конца не установлен (Наппа et al, 2000; Shimada et al, 1999). В настоящей работе были определены частоты аллелей и генотипов данного локуса в группе больных спорадическим РМЖ и в контрольной группе женщин без онкологических заболеваний и изучена ассоциация rsl056836 с риском РМЖ и его подтипов .

Частота аллеля G (Val) в контрольной выборке русских жительниц Алтайского края составила 41%, что несколько ниже, чем частота этого аллеля в некоторых странах Европы, таких как Германия (45%), Швеция (45%), Польша (по разным данным - 44% и 42%), но выше, чем в Финляндии (34%). Сравнение вышеуказанных частот методом показало, что различия значимы лишь при сравнении настоящей выборки с немецкой (р = 0.03) и финской (р = 0.001) популяциями. В российской популяции частота аллеля G была определена ранее в выборке, проанализированной авторами Зимарина с соавт. (2004), и составила 44%. Различия в частотах аллелей между данной выборкой и группой русских жительниц Алтайского края также не были статистически значимыми .

Анализ ассоциации rsl056836 с риском РМЖ и его подтипов не выявил значимой ассоциации ни в совокупной выборке, ни в проанализированных подгруппах. В большинстве исследований, выполненных другими авторами, локус rs 1056836 также не был ассоциирован с РМЖ. Исключение составили работы Listgarten et al. (2004), Jiao et al. (2010); Wang et al. (2011) и Le Marchand et al. (2005). Однако, в трех последних работах наблюдалось значимое отклонение от равновесия Харди-Вайнберга в группах контроля, поэтому к результатам этих работ следует относиться с осторожностью .

По всей видимости, rsl056836 CYP1B1 не ассоциирован с риском РМЖ, либо его ассоциация настолько мала, что может быть детектирована только на выборках большего размера, чем анализировались до нынешнего времени. В настоящей работе, при размере выборки 642/463 (случай/контроль), со статистической мощностью 80% можно было выявить ассоциацию гз1056836 с риском РМЖ с ОК не менее 1.28. Ассоциация с меньшим значением ОЯ могла быть пропущена. Для проанализированных подгрупп РМЖ с вероятностью 80% можно было детектировать ассоциацию с ещё большим значением ОК (от 1.29 до 1.80). Для выявления более слабой ассоциации гз 1056836 с РМЖ различных подтипов целесообразно исследовать более крупные выборки .

Анализ ассоциации полиморфного локуса rsl048943 гена CYP1A1 с риском РМЖ Фермент CYP1A1 катализирует реакции гидроксилирования эстрогенов (преимущественно по 2 положению), а также реакции первой фазы биотрансформации ксенобиотиков, таких как полициклические ароматические углеводороды, гетероциклические ароматические амины, хлорорганические соединения. Данные реакции приводят к их активации и образованию аддуктов с ДНК. Таким образом, увеличение активности CYP1A1 может приводить к повышению внутритканевой концентрации активных метаболитов и способствовать злокачественной трансформации. В экзоне 7 гена CYP1A1 располагается полиморфная замена A/G, обозначаемая как A4889G или A2455G .

В литературе аллель G также обозначается как CYP1A1*2C или т2. Получаемая аминокислотная замена Ile462Val в гем-связывающем домене фермента ассоциируется с увеличенной индуцибельностью и активностью фермента (Crofts et al, 1994; Kiyohara et al, 1996, Land, et al, 1994). В настоящей работе изучалось влияние данного полиморфного локуса на риск РМЖ у русских жительниц Алтайского края .

Частота аллеля G в контрольной группе (4%) не отличалась значимо от частоты этого аллеля в Германии, Австрии, Англии, в популяции канадцев французского происхождения и Польше и была статистически значимо ниже, чем в Финляндии (7%) .

В результате сравнения частот аллелей и генотипов в выборке больных РМЖ и контрольной группе не было выявлено ассоциации rsl048943 с изменением риска данного заболевания, за исключением подгруппы женщин, не кормивших грудью. Частота генотипа GG в этой подгруппе больных РМЖ составила 3%, в то время как в контрольной выборке этот генотип не встречался. Значимость различий была достаточно высока (р = 0.0004) и не нивелировалась при введении поправки Бонферрони на множественное сравнение (после введения поправки р = 0.002). Тем не менее, нулевая частота встречаемости генотипа GG в группе контроля обусловила невозможность вычисления значения OR (GG vs АА) в настоящем исследовании (нуль в знаменателе формулы). Для того, чтобы в контрольной группе встретился хотя бы один генотип GG при частоте аллеля G, равной 4%, размер контрольной выборки должен составлять не менее 625 женщин .

Кормление грудью является фактором, снижающим риск РМЖ (Helewa et al, 2002). Анализ результатов 47 эпидемиологических исследований, выполненных в 30 странах, показал, что риск РМЖ снижается на 4.3% на каждые 12 месяцев грудного вскармливания (в дополнение к 7% снижению риска, приходящемуся на каждые роды). В исследовании Ing et al. (1977), в котором анализировали выборку женщин, проживавших в Гонконге, которые в силу культурных традиций кормили только правой грудью, было выявлено четырехкратное увеличение риска рака левой груди по сравнению с правой. Предполагаемые причины протективного эффекта лактации - это, во-первых, снижение числа овуляций и уровня эстрогенов в молочной железе. Во-вторых, кормление грудью понижает уровень рН в ткани молочной железы, что препятствует гиперплазии (Kennedy, 1994). В третьих, при кормлении из долек и протоков молочных желез выводятся соединения, обладающие канцерогенной активностью (например, органохлорины). У некормящих женщин ксенобиотики экскретируются в протоки и аккумулируются в них, что может способствовать злокачественному перерождению протокового эпителия (Petrakis et al, 1975) .

Вероятно, увеличение риска РМЖ у носительниц гомозиготного генотипа GG, не кормивших грудью, связано с более интенсивной (чем у носителей других генотипов) активацией проканцерогенов, накопившихся в молочных железах и не секретируемых наружу с молоком .

Необходимо отметить, что в настоящей работе подгруппа больных РМЖ, не кормивших грудью, имела небольшой размер (35 человек). Поэтому в дальнейшем целесообразно подтвердить выявленную ассоциации на выборке большего размера .



Анализ ассоциации полиморфного локуса rs762551 гена CYP1A2 с риском РМЖ CYP1A2 является одним из основных ферментов, катализирующих гидроксилирование эстрогенов по 2 положению. Также этот фермент участвует в метаболизме кофеина, афлатоксина В1, ацетаминофена и различных полициклических ароматических углеводородов. CYP1A2 экспрессируется в преимущественно в печени, составляя до 13% от всех печеночных CYP. В молочной железе экспрессия этого фермента не обнаружена. В 1 интроне гена CYP1A2 располагается полиморфный локус rs762551 (замена А-164С, обозначаемая также в литературе как CYP1A2*1F), который, в соответствии с данными, полученными рядом авторов (Castorena-Torres et al, 2005; Dobrinas et al, 2011; Han et al, 2001; Sachse et al, 1999), снижает активность фермента .

Частота аллеля С в контрольной выборке женщин, проанализированной в настоящем исследовании, составила 37%. Эта частота незначимо отличалась от частоты аллеля С во французской (36%) и североамериканской (35%) популяциях, но была значимо выше, чем в Швеции и Германии (29%), Англии (33%) и Италии (33%) .

в настояшем исследовании не было выявлено ассоциации гз762551 с риском РМЖ у русских жительниц Алтайского края. В большинстве предьщущих работ, носвяшенных анализу влияния этого локуса на риск РМЖ, включая мета-анализ авторов е/ а1. (2010), ассоциации также показано не было .

Настояшая работа имела 80% статистическую мощность для детекции ассоциации с ОК не менее 1.45 в совокупной выборке РМЖ и не менее 1.48-2.44 в подгруппах. Поэтому нельзя исключить, что гз762551 всё же ассоциирован с РМЖ в российской популяции, но для выявления этой ассоциации потребуются выборки большего размера .

Анализ ассоциации полиморфного локуса rs2470152 гена CYP19A1 с риском РМЖ В гене CYP19A1 закодирован фермент ароматаза, конвертирующий андрогены в эстрогены в различных тканях организма, в том числе в молочной железе. Увеличение активности фермента может приводить к повышению концентрации эстрогенов, что может лежать в основе развития рака молочной железы. В работах Eriksson et al. (2009) и Jiang et al. (2010) было выявлено, что полиморфный локус rs2470152 (С/Т), расположенный в первом интроне гена CYP19A1, ассоциируется со снижением уровня эстрогенов в плазме мужчин. У европеоидных носителей генотипа СС уровень эстрадиола был выше на 11-13% по сравнению с носителями генотипа TT, а уровень эстрона - на 10-16%. Анализ влияния данного SNP на уровень эстрогенов у женщин до настоящему времени ещё не проводился .

В нашей работе впервые в мире было исследовано влияние rs2470152 на риск развития РМЖ. Частота аллеля Т в контрольной выборке русских жительниц Алтайского края составила 41%, что статистически значимо ниже, чем в европеоидных группах в работе Eriksson et al. (2009) (46-48%). Частоты, приведенные в базе данных NCBI для трех выборок европеоидного происхождения, тоже выше и составляют 45-50% (hltp://www.ncbi.nlm.nih.gov/proiects/SNP/snp rel'.cgi'?rs"^2470152) .

Нами не было выявлено ассоциации rs2470152 с риском РМЖ и его подтипов за исключением подгруппы женщин, кормивших грудью менее года (табл. 3) .

Тем не менее, уровень значимости был невысок (р = 0.02), и значимость ассоциации нивелировалась при введении поправки Бонферрони на множественное сравнение (после поправки р = 0.12). Объяснить полученную ассоциацию затруднительно: поскольку лактация является протективным фактором в отношении риска РМЖ, а локус rs2470152 теоретически должен снижать уровень эстрогенов у женщин, то ожидаемая ассоциация - обратная (снижение риска). В нашей же работе носители аллеля Т, напротив, имели повышенный риск РМЖ. Чтобы подтвердить или опровергнуть выявленную ассоциацию, целесообразно провести дополнительные исследования на подгруппах большего размера .

Анализ ассоциации полиморфного локуса rsl042838 гена PGR с риском РМЖ Прогестерон является стероидным гормоном, контролирующим процессы пролиферации и дифференцировки в молочной железе. Рецепторы прогестерона, PRA и PRB, принадлежат к классу ядерных рецепторов и закодированы в одном и том же гене, транскрибируясь при этом с разных промоторов. Вследствие этого, PRB имеет N-концевую последовательность длиной в 164 аминокислоты, отсутствующую у PRA (8саф1п et al, 2009). В ряде исследований было показано, что PRB требуется для нормального развития молочных желез, а PRA - для развития матки и поддержания репродуктивной функции .

Полиморфный локус rsl042838 (замена G/T, УЫбвОЬеи) в гене рецептора прогестерона PGR находится в полном неравновесии по сцеплению с двумя другими локусами в том же гене - rsl042839 (замена С/Т, HisllQHis) и интронной инсерцией Alu-повтора (320 п.н.). Аллель, несущий замены rsl042838 Т, rsl042839 Т и /i/м-повтор, обозначается в литературе как аллель PROGINS. Анализ влияния этих генетических изменений на функциональные особенности PGR показал противоречивые результаты (Agoulnik et al, 2004;

Romano et al, 2007), зависящие от типа клеток, на которых изучался эффект аллеля PROGINS. На линии раковых клеток молочной железы T47-D было выявлено, что аллель PROGINS ассоциируется со снижением уровня транскрипции и меньшей стабильностью пре-мРНК PRA и PRB. А на другой клеточной линии рака молочной железы, MCF-7, была показана одинаковая способность активировать транскрипцию репортерного гена для мутантной и нормально формы PGR .

В настоящем исследовании был выполнен анализ ассоциации локуса rs 104283 8 с риском РМЖ у русских жительниц Алтайского края. Ранее эффект этого локуса изучался на выборках разного этнического происхождения, и в большинстве работ ассоциации с риском РМЖ показано не было. В России до нынешнего времени таких исследований не проводилось .

Частота аллеля Т {PROGINS) в группе контроля в настоящей работе составила 15%, что соответствует данным по другим популяциям европеоидного происхождения. Локус rsl042838 показал статистически значимую ассоциацию с увеличением риском РМЖ в совокупной выборке, а также в подгруппах больных РМЖ с низким уровнем экспрессии рецепторов эстрогена (ER), прогестерона (PGR) и HER2/neu, а также в подгруппе женщин, кормивших грудью (табл. 3). При анализе ассоциации в подгруппах женщин, кормивших более или менее года, значимая ассоциация была обнаружена только для последней .

После введения поправки Бонферрони на множественное сравнение значимость ассоциации сохранилась только для подгрупп с низким уровнем HER2/neu, ER и PGR. В подгруппе с низким уровнем HER2/neu ассоциация имела самый высокий уровень значимости (после введения поправки р = 0.002 для аллеля Т и р = 0.001 для генотипа TT). В подгруппах с низким уровнем экспрессии ER и PGR уровень значимости был ниже, и ассоциация была значимой только для аллеля Т (после введения поправки р = 0.03 и р = 0.04, соответственно) .

Поскольку и роль прогестерона в развитии злокачественных опухолей молочных желез, и функциональное значение аллеля PROGINS при экспрессии гена PGR в ткани молочной железы ещё до конца не установлены, интерпретировать выявленную ассоциацию в настоящий момент достаточно сложно. Если принять гипотезы, постулирующие, что: 1) аллель PROGINS снижает количество рецептора прогестерона в клетке молочной железы, 2) воздействие прогестерона является антипролиферативным, то носители аллеля PROGINS имеют сниженное количество PGR и, вследствие этого, сниженный ответ клеток молочной железы на действие прогестерона, что приводит к увеличению риска РМЖ. Это согласуется с полученными нами данными об ассоциации аллеля PROGINS с РМЖ в подгруппе с низким уровнем экспрессии PGR .

Связь аллеля PROGINS с увеличением риска РМЖ с низким уровнем ER и HER2/neu ещё более сложна для объяснения. В литературе не опубликовано данных о том, влияет ли прогестерон на экспрессию ER и HER2/neu в ткани молочной железы человека посредством его связывания с PGR. В исследовании Richer et al. (2002) изучали какие именно гены находятся под контролем PGR в клеточной линии рака молочной железы T47-D. В опубликованный ими список генов, регулируемых прогестероном в этой клеточной линии, не вошли ни ER, ни HER2/neu. Тем не менее, если предположить, что аллель PROGINS ассоциируется со снижением экспрессии PGR в молочной железе, а прогестерон при связывании с PGR увеличивает экспрессию ER и HER2/neu, то снижение количества PGR на мембранах клеток у носителей аллеля PROGINS привело бы к соответствующему снижению количества ER и HER2/neu. И тогда, если эффект прогестерона антипролиферативный, носители аллеля PROGINS могли бы обладать повышенным риском развития РМЖ в связи с низким уровнем этих рецепторов .

Очевидно, что в этой области исследования больше вопросов, чем ответов, и все вышеизложенные интерпретации требуют принятия слишком большого количества гипотез. Тем не менее, данные об ассоциации rsl042838 с риском РМЖ, полученные в настоящей работе, могут быть полезны для дальнейшей функциональной валидации роли PGR в развитии РМЖ. Выявленную нами ассоциацию необходимо подтвердить на независимых выборках в России или других странах .

Анализ ассоциации полиморфного локуса Г8743572гена СУР17А1с риском РМЖ Фермент СР17А1 катализирует реакции, продукты которых являются предшественниками стероидных гормонов - андрогенов, эстрогенов, прогестинов, глюкокортикоидов. Полиморфный локус гз743572 (замена Т/С), располагающийся в 5'-нетранслируемой области гена CYP17A1, создает дополнительный промоторный Spl-сайт. Теоретически, это может оказывать влияние на эффективность транскрипции и концентрацию фермента в клетках и приводить к изменению уровня гормонов в плазме крови и ткани молочных желез. В настоящее время функциональная значимость rs743572 до конца не изучена. В двух работах была выявлена ассоциация этого локуса с увеличением концентрации эстрогенов (Feigelson et al, 1998; Haiman et al, 1999) и прогестерона (Feigelson et al, 1998) в плазме женщин, но эта ассоциация не подтвердилась в двух других исследованиях (Lurie et al, 2005; Travis et al, 2004) .

Частота аллеля С, рассчитанная нами для контрольной группы русских жительниц Алтайского края, составила 46%. Эта частота не отличалась значимо от частот в российской популяции, полученных в работах Артамонова с соавт .

(2003) (48%) и Kuligina et al. (2000) (45%). В большинстве европейских стран частота аллеля С ниже и составляет 34-42% .

В настоящей работе локус rs743572 не показал статистически значимой ассоциации с риском РМЖ в совокупной выборке и в подгруппах, кроме подгруппы женщин в пременопаузе (табл. 3). Ассоциация имела низкий уровень значимости (р = 0.04) и нивелировалась при введении поправки Бонферрони на множественное сравнение. Объяснить наличие ассоциации в подгруппе женщин с РМЖ в пременопаузе и отсутствие её в подгруппе женщин с РМЖ в постменопаузе можно тем, что для менопаузы характерен крайне низкий уровень эстрадиола. При этом у женщин с генотипом СС - уровень должен быть несколько выше, чем у носительниц других генотипов, но вследствие общего критического снижения уровня эстрогенов в постменопаузе, носительство генотипа СС теряет свое значение и, по всей видимости, не влияет на риск развития заболевания .

В большинстве аналогичных работ, в том числе в работе Kuligina et al .

(2000), выполненной на выборке жительниц Санкт-Петербурга, ассоциации выявлено не было. Тем не менее, в исследовании Артамонова с соавт. (2003) была обнаружена ассоциация rs743572 с увеличением риска РМЖ в российской популяции. Можно предположить, что причиной разницы в результатах служат какие-то различия в особенностях формирования выборок, в том числе различная представленность в выборке пациенток с РМЖ в пре- и постменопаузе. Но выявить эти особенности не представляется возможным, поскольку в публикациях Артамонова с соавт. (2003) и Kuligina et al. (2000) не приведены характеристики исследуемых групп, за исключением среднего возраста и медицинского учреждения, где была сформирована выборка .

Заключение В настоящей работе были определены частоты генотипов 6-ти полиморфных локусов генов метаболизма половых стероидных гормонов CYPIB1, CYP1A1, CYP1A2, CYP19A1, PGR и CYP17A1 в выборке русских жительниц Алтайского края, а также выполнен анализ ассоциации аллельных вариантов данных генов с риском развития одного из самых распространенных онкологических заболеваний рака молочной железы. Были выявлены ассоциации локусов rs1042838 в гене PGR и rs1048943 в гене CYP1A1 с увеличением риска развития данного вида опухоли в подфуппах с низким уровнем экспрессии рецепторов стероидных гормонов, рецептора HER2/neu и в подгруппе женщин, не кормивших грудью. Результаты данной работы вносят вклад в понимание молек'лярно-генетических и, возможно, патофизиологических механизмов развития рака молочной железы. Генетические локусы, показавшие ассоциацию с риском данного заболевания, могут быть использованы в дальнейшем для прогнозирования риска развития рака молочной железы при условии подтверждения обнаруженных ассоциаций на независимых выборках русского этнического происхождения .

ВЫВОДЫ:

1. Полиморфный локус Г51042838 в гене PGR ассоциирован с увеличением риска развития рака молочной железы в группе опухолей с низким уровнем экспрессии рецепторов стероидных гормонов (для аллеля Т: ОК = 1,59, р = 0,02 в подгруппе с низким уровнем рецептора эстрогена; ОК = 1,52, р = 0,04 в подгруппе с низким уровнем рецептора прогестерона) и в группе с низким уровнем экспрессии рецептора НЕК2/пеи (для аллеля Т:

О Я = 1,82, р = 0,002),

2. Полиморфный локус гз1048943 в гене CYP1A1 увеличивает риск развития рака молочной железы в подгруппе женщин, не кормивших грудью (р = 0,002) .

3. Аллельные варианты генов метаболизма половых стероидных гормонов гз1056836 в гене CYP1B1, Г5762551 в гене CYP1A2, Г52470152 в гене CYP19A1 и гз743572 в гене CYP17Al не ассоциированы с риском развития рака молочной железы в исследуемой выборке женщин, либо ассоциация мала для выявления при данном размере анализируемых групп .

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах;

1. Gulyaeva L.F., Mikhailova O.N., Pustylnyak V.O., Kim I.V., Gerasimov A.V., Krasilnikov S.E., Filipenko M.L., Pechkovsky E.V. Comparative analysis of SNP in estrogen-metabolizing enzymes for ovarian, endometrial, and breast cancers in Novosibirsk, Russia. // Adv Exp Med Biol. - 2008,- Vol.617. - P .

359-66 .

2. Печковский E.B., Вайнер A.C., Боярских У.А., Билтуева Ю.А., Селезнёва И.А., Синкина Т.В., Лазарев А.Ф., Петрова В.Д., Филипенко М.Л. Аллель PR0G1NS гена рецептора прогестерона PGR ассоциированс риском рака молочной железы в Западно-Сибирском регионе России. // Medline.ru. Т. 1 3. - № 1. - С. 207-217 .

3. Монофафия: Вайнер A.C., Боярских У.А., Печковский Е.В. Половые стероидные гормоны и рак молочной железы// LAP LAMBERT Academic Publishing (2013-06-26)-ISBN-13: 978-3-659-13005-2, 76c .

Сокращения и обозначения ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ИГХ - иммуногистохимия мРНК - матричная рибонкулеиновая кислота ИЦР - полимеразная цепная реакция Р М Ж - рак молочной железы CYP1A1 (cytochrome Р450 1А1) -цитохром Р450 1А1 CYP1A2 (cytochrome Р450 1А2) - цитохром Р450 1А2 CYP1B1 (cytochrome Р450 1В1)-цитохром Р450 1В1 CYP17A1 (cytochrome Р450 17А1) - цитохром Р450 17А1 CYP19A1 (cytochrome Р450 19А1) - цитохром Р450 19А1 СЛ. (confidence interval) - доверительный интервал ER (estrogen receptor) - рецептор эстрогена FAM (fluorescein) - флуоресцеин HER2/neu - рецепторная тирозинкиназа семейства егЬВ М А Р К (mitogen-activated protein kinase) - митоген-активируемая протеинкиназа OR (odds ratio) - отношение шансов NCBI (National center for Biotechnological Information) - Национальный центр биотехнологической информации США (Бетесда, Мэриленд) PGR (progestone receptor) - ген рецептора прогестерона PRA (progestone receptor А) - рецептор прогестерона А PRB (progestone receptor В) - рецептор прогестерона В R6G (rhodamine 6G)- родамин 6G SNP (single nucleotide polimorfism) - однонуклеотидный полиморфизм Spl - фактор транскрипции семейства Sp/KLF Благодарности

Автор благодарит:

Заведующего лабораторией клинической биохимии ФГБУ «РОНЦ им. H.H .

Блохина», Д. М. Н., чл.корр. РАМН профессора Кушлинского Николая Евгеньевича за научное руководство и консультации по теме диссертации и обсуждение роли молекулярных биомаркеров в канцерогенезе .

Директора Алтайского филиала ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина», д.м.н., чл.корр. РАМН, профессора Лазарева Александра Федоровича и заведующую лабораторией, д.м.н. Петрову Валентину Дмитриевну за помощь в сборе биоматериала и формировании выборки пациентов, консультации по клиническим аспектам данной работы и возможность доложить и обсудить результаты исследований на научно-практической конференции .

Заведующего лабораторией фармакогеномики ФГБУН ИХБиФМ СО РАН, к.б.н .

Филипенко Максима Леонидовича за общее научное и идеологическое руководство работой и ценные научные и организационно-методические рекомендации .

Сотрудницу лаборатории фармакогеномики ФГБУН ИХБиФМ СО РАН, м.н.с .

Шадрину Александру Сергеевну за огромную помощь в работе над совместными публикациями .

Сотрудницу лаборатории фармакогеномики ФГБУН ИХБиФМ СО РАН, с.н.с .

к.б.н. Боярских Ульяну Александровну за помощь в статистической обработке результатов исследований и конструктивную критику .

Заведующую лабораторией молекулярных механизмов канцерогенеза ФГБУ НИИ МБиБ СО РАМН, д.б.н. профессора Гуляеву Людмилу Федоровну как своего первого научного руководителя, за организационную помощь в подготовке этой диссертации .

Главного специалиста по КЛД МЗ РФ по СФО, д.м.н. профессора Пикалова Илью Викторовича за поддержку, общие консультации и возможность доложить результаты работы на конференции .

Главного специалиста по КЛД ВС РФ, д.м.н. профессора Иванова Андрея Михайловича за поддержку при подготовке к сдаче кандидатских экзаменов в BMA им. Кирова г. Санкт-Петербург .

Заместителя генерального директора по науке компании Инвитро, к.м.н .

Юрасова Василия Викторовича и заведующую КДЛ ФГБУ КБ УДП, к.б.н .

Стериополо Нику Александровну за моральную поддержку и ценные замечания по сути и стилю изложенного материала .

д.б.н. Гимаутдиновой Ольге Ивановне и д.б.н. Макаровой Светлане Ивановне за самоотверженный труд и помощь в работе над ошибками .

Подписано в печать 08.11,2013 г. Печать цифровая .

Бумага офсетная. Формат 60x84/16, Усл. печ. л. 2 Тираж 100 экз. Заказ № 187 Отпечатано в типографии «Срочная полиграфия»

ИП Малыгин Алексей Михайлович 630090, Новосибирск, пр-т Академика Лаврентьева, 6/1, оф, 104 Тел. (383) 217-43-46, 8-913-922-19-07






Похожие работы:

«ФЕДЕРАЛЬНЫЙ АРБИТРАЖНЫЙ СУД МОСКОВСКОГО ОКРУГА ПОСТАНОВЛЕНИЕ от 26 августа 2009 г. N КА-А40/8122-09 Дело N А40-77653/08-127-398 Резолютивная часть постановления объявлена 19 августа 2009 года. Полный текст постановления изготовлен 26 августа 2009 года. Федеральный арбитражный суд Московского округа в состав...»

«УТВЕРЖДАЮ 1. Цели освоения дисциплины Цели освоения дисциплины: формирование знаний о структуре, морфологии и свойствах природных и геохимических ландшафтов; эколого-геохимического анализа антропогенной миграции химических элементов, а также основы ландшафтногеоэкологического планирования и проектирования...»

«Принципы экологии 2016. Т. 5. № 1 научный электронный журнал ПРИНЦИПЫ ЭКОЛОГИИ http://ecopri.ru http://petrsu.ru Издатель ФГБОУ "Петрозаводский государственный университет" Российская Федерация, г. Петрозаводск, пр. Ленина, 33 Научный электронный журнал ПРИНЦИПЫ ЭКОЛОГИИ http://ecopri.ru Т. 5. № 1(17). Март, 20...»

«Информация Министерства экологии и природных ресурсов Республики Татарстан о ходе реализации мероприятий "Программы социально-экономического развития Республики Татарстан на 2011-2015 годы", срок реализации которых завершается в 2012 году Мероприятие Исполните Сроки Исполнение ли выполнен ия 1. Обеспечить разработ...»

«КОРМА – ЗАГОТОВКА, ПРИГОТОВЛЕНИЕ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ 1. Биологическая ценность зерна белого люпина при использовании в птицеводстве / М. Ю. Третьяков [и др.] // Достижения науки и техники АПК. N 4. С. 79-81.2. Блохина, К. А. Сорго надежный и...»

«МУНИЦИПАЛЬНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ДОПОЛНИТЕЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ ДЕТСКИЙ ОЗДОРОВИТЕЛЬНО-ОБРАЗОВАТЕЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИМ. Т.САВИЧЕВОЙ РАССМОТРЕНО УТВЕРЖДАЮ на заседании педсовета директор МОУ ДО ДООЦ протокол №от им.Т.Савичевой Калина О.В. "" ОБРАЗОВАТЕЛЬНАЯ ПРОГРАММА ДОПОЛН...»

«ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ НАУЧНЫХ ЭКСПЕРИМЕНТОВ, ПОЛУЧЕННЫЕ ИССЛЕДОВАТЕЛЯМИ НАСА В ПОЛЕТЕ КА "ФОТОН-М2" ОТЧЕТ ПРЕДСТАВЛЯЕТ РУКОВОДИТЕЛЬ ПРОЕКТА "ФОТОН-М2" ОТ НАСА МАЙК СКИДМОР 26 октября 2005 года ОГЛАВЛЕНИЕ 1. Введение 3 2. Краткое описание подготовки и проведения экспериментов 5 3. Основные цели и з...»




 
2019 www.mash.dobrota.biz - «Бесплатная электронная библиотека - онлайн публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.