WWW.MASH.DOBROTA.BIZ
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - онлайн публикации
 

«БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БАКТЕРИЙ ORNITHOBACTERIUM RHINOTRACHEALE, ВЫДЕЛЕННЫХ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ...»

ЧЕРНЫШОВ Анатолий Викторович

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БАКТЕРИЙ ORNITHOBACTERIUM

RHINOTRACHEALE, ВЫДЕЛЕННЫХ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИЙСКОЙ

ФЕДЕРАЦИИ

06.02.02 «Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология,

микология с микотоксикологией и иммунология»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук 2 1 АПР 2077 Владимир - 2011 г .

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГУ «ВНИИЗЖ») Научный руководитель • доктор биологических наук, профессор ПРУНТОВА Ольга Владиславовна Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор ДИЕВ Вячеслав Иванович ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», г. Владимир доктор ветеринарных наук, профессор ПИРОЖКОВ Михаил Константинович ФГУ «Всероссийский государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов», г. Москва .

Ведущая организация - ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина», г. Москва «^^^"ЖХ г. в ' часов на заседании совета по Защита состоится защите докторских и кандидатских диссертаций Д 220.015.01 при ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу: 600901, г. Владимир, мкр. Юрьевец, ФГУ «ВНИИЗЖ» .



С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке и на сайте диссертационного совета Д 220.015.01 при ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»: http//www.arriah.ru .

с^са /^т а Автореферат разослан чг- ' » ^Т— 2011 г .

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, доцент А.П. Пономарёв

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Респираторные заболевания птиц являются одной из важнейших ветеринарных проблем. К ним относится и орнитобактериоз, вызываемый бактериями вида Ornithobacterium rhinotracheale. Экономический ущерб, наносимый промышленному птицеводству этой инфекцией, складывается из высокой выбраковки больной птицы, смертности (1-15% у индеек и до 10% у цыплят-бройлеров), снижения приростов живой массы, яйценоскости (от 2 до 5%), выводимости цыплят и затрат на проведение оздоровительных и лечебных мероприятий [S.N. El-Sukhon et al., 2002; R. Bock et al., 1995; P. van Empel, H.M .

Hafez, 1999; D. Lafay, 2000] .

Заболевание может возникать как самостоятельно, так и в ассоциации с другими патогенными агентами бактериальной, вирусной или микоплазмозной этиологии, что значительно затрудняет проведение диагностики заболевания и его лечение .

Ввиду сложности диагностики орнитобактериоза птиц (низкая осведомленность специалистов о свойствах бактерии, снижение вероятности выделения на поздних стадиях заболевания, сходство с другими респираторными болезнями) и высокой вероятности заноса возбудителя с инкубационным яйцом, а также резистентности ко многим широко используемым антибиотикам [L. Van Veen at al., 2004], постановка вопроса об изучении биологических и антигенных свойств бактерий вида Ornithobacterium rhinotracheale, выделенных на территории РФ, является актуальной задачей, имеющей научное и практическое значение .

Цели и задачи исследований. Основной целью данных исследований было выделение и идентификация бактерий вида О. rhinotracheale из патологического материала от птиц, изучение их морфологических, культуральных, биохимических, антигенных и патогенных свойств .



Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Выделить изоляты бактерий О. rhinotracheale от птиц из птицеводческих хозяйств РФ .

2. Изучить биологические свойства изолятов О. rhinotracheale, выделенных на территории РФ в сравнении с референтными штаммами .

3. Подобрать оптимальную питательную среду и условия для культивирования О. rhinotracheale

4. Подобрать оптимальные условия для длительного хранения штаммов О. rhinotracheale

5. Получить специфические компоненты бактерий О. rhinotracheale для постановки серологических реакций .

6. Определить антигенное родство между референтными штаммами и изолятами бактерий О. rhinotracheale Научная новизна работы. В результате проведенных исследований патологического материала получены 19 патогенных изолятов О. rhinotracheale, один из которых детально изучен, паспортизирован и депонирован как производственный штамм в коллекции бактериальных культур ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») .

Изучены биологические свойства 3 референтных штаммов и 4 полевых изолятов О. rhinotracheale .

Изучена чувствительность полевых изолятов О. rhinotracheale к широкому спектру антибактериальных препаратов .

Подобрана питательная среда и оптимальные условия для культивирования О. rhinotracheale с целью получения большого объема биомассы .

Определены оптимальные условия и сроки хранения возбудителя орнитобактериоза птиц .

Установлены нуклеотидные последовательности фрагмента гена 16S рРНК выделенных изолятов О. rhinotracheale и заложены в базу данных GenBank .

Практическая значимость работы. В результате проведенных исследований впервые в РФ разработаны «Методические рекомендации по лабораторной диагностике орнитобактериоза птиц» (2010 г.), одобренные ученым советом ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» и утвержденные Заместителем руководителя Федеральной службы по ветеринарному и фитосанитарному надзору в установленном порядке .

Штамм «Задонский-1» №130 ДЕП, депонирован в коллекции бактериальных культур ФГУ «ВГНКИ» и используется при производстве набора ИФА для выявления антител в сыворотке крови кур к О. rhinotracheale .

В коллекцию бактериальных культур ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» после детального изучения заложены следующие изоляты О .

rhinotracheale: «Т-1», «Кр-1», «Б-1» .

Основные положения выносимые на защиту .

- штамм О. rhinotracheale «Задонский-1» №130 ДЕП, депонированный в коллекции ФГУ «ВГНКИ»;

- результаты изучения биологических свойств референтных штаммов и выделенных изолятов О. rhinotracheale;

- питательная среда для получения биомассы бактерий О. rhinotracheale;





- антигенное родство выделенных изолятов;

- способы хранения возбудителя орнитобактериоза птиц в лабораторных условиях .

Апробация работы. Основные материалы диссертационной работы доложены и опубликованы в материалах научных конференций: «Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины» посвященная памяти члена-корреспондента РАСХН Вишнякова И.Ф. (г. Покров, 2009 г.), VII Всероссийской конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2010» (г. Москва, 2010 г.), «Достижения молодых ученых в ветеринарную практику», посвященная 30-летию создания СМУ ФГУ «ВНИИЗЖ»

(г. Владимир, 2010 г.), а также на заседаниях ученого совета ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» в 2007-2010 гг .

Публикации научных работ. По теме диссертационной работы опубликовано 7 научных работ в журналах и материалах научных конференций, 3 из них в изданиях рекомендованных ВАК РФ .

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Нуклеотидное секвенирование осуществлялось сотрудниками лаборатории диагностики вирусных болезней птиц ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» .

Место выполнения работы. Исследования по диссертационной работе выполнены в 2007-2010 гг. в соответствии с планами НИР в ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» .

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 130 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения. Список литературы включает 143 источника, в том числе 115 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 11 рисунками и 17 таблицами. В приложении представлены копии титульных листов документов, подтверждающих результаты отдельных этапов работы, их научную новизну и практическую значимость .

Благодарность. Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам лаборатории микробиологии, лаборатории микробиологии кормов и пищевых продуктов, лаборатории диагностики вирусных болезней птиц и лаборатории эпизоотологии и гриппа птиц ФГУ «ВНИИЗЖ» за оказание консультационнометодической помощи .

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы. Штаммы бактерий. В работе использовали следующие референтные штаммы бактерий, полученные из Американской коллекции типовых культур (АТСС): О. rhinotracheale №51463 (типовой), О. rhinotracheale №51464, О. rhinotracheale №51465, Pasteurella multocida №15742, Mannheimia haemolytica №29699, Actinobacillus pleuropneumoniae №27088, Haemophilus parasuis №19417 и референтные штаммы, полученные из коллекции ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов»: О. rhinotracheale «Задонский-1»

№130 ДЕП (выделенный и депонированный в ФГУ «ВНИИЗЖ»), Salmonella enteritidis №7. Три изолята бактерий О. rhinotracheale «Т-1», «Кр-1», «Б-1», полученные из патологического материала от птиц сотрудниками лаборатории микробиологии кормов и продуктов питания ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» .

Подопытные животные.

В экспериментальной работе использовали следующие виды и возрастные группы лабораторных животных:

- бройлеры, возраст 21-30 суток, для определения патогенных свойств и вирулентности возбудителя орнитобактериоза птиц;

- СПФ-цыплята, возраст 14 суток, для определения патогенных свойств бактерий вида О. rhinotracheale;

- кролики, массой 2,5-3,0 кг, для получения специфических и нормальных сывороток крови .

Питательные среды. Для изучения культуральных свойств бактерий О. rhinotracheale использовали следующие питательные среды: мясо-пептонный бульон (МПБ); МПБ с добавлением экстракта пекарских дрожжей (10% от объема среды) (МПБД); мясо-пептонный агар (МПА); мясо-пептонный полужидкий агар (ПЖА); бульон на основе мясного перевара по Хоттингеру (с содержанием 250-300 мг% аминного азота) (ХБ); ХБ с добавлением 10% экстракта пекарских дрожжей (ХБД); бульон Когана; 1,5% агар на основе мясного перевара по Хоттингеру (ХА);

ХА с добавлением дефибринированной крови барана (5-10% от объема среды) (КА); ХА с добавлением экстракта эритроцитов крови лошади (10% от объема среды) (ХКЭ); ХА с добавлением экстракта пекарских дрожжей (10% от объема среды) и 40% раствора глюкозы (0,3% от объема среды) (ХДЭ); ХА с добавлением экстракта пекарских дрожжей (10% от объема среды), экстракта эритроцитов крови лошади (10% от объема среды), сыворотки крови крупного рогатого скота 1-й категории (5% от объема среды), 40% раствора глюкозы (0,3% от объема среды) (ХФ); ХА с добавлением сыворотки крови крупного рогатого скота 1-й категории (10% от объема среды) (XSB); ХА с добавлением сыворотки крови цыплят (10% от объема среды) (XSA); соевоказеиновый агар (СК); бульон Тодда-Хевита (БТХ);

агар МакКонки; агар Эндо; PPLO агар, приготовленный из основы PPLO бульона «Difco PPLO Broth» (PPLOA); PPLO агар с добавлением 10% экстракта пекарских дрожжей, экстракта эритроцитов крови лошади (10% от объема среды), сыворотки крови крупного рогатого скота 1 -й категории (5% от объема среды), 40% раствора глюкозы (0,3% от объема среды) (PPLOF); PPLO бульон с аргинином (РРВА) .

Приготовленные питательные среды хранили в защищенном от света месте при 4°С не более 14 дней .

Сыворотку крови крупного рогатого скота 1-й категории, 40% раствор глюкозы и экстракт пекарских дрожжей (производства ФГУ «ВНИИЗЖ») добавляли непосредственно перед использованием среды. В плотные питательные среды их вносили в расплавленный агар, охлажденный до температуры 40-45°С .

Отбор проб патологического материала для бактериологического исследования. Материал для бактериологического исследования отбирали от вынужденно убитой или павшей птицы (различных возрастов) .

Для исследования отбирали экссудат из перикардиальной полости, содержимое воздухоносных мешков и синусов, выделения из носовой полости, смывы с трахеи; паренхиматозные органы - легкие, селезенку, печень и головной мозг .

Изучение биологических свойств микроорганизмов. Культуральноморфологические свойства штаммов и изолятов бактерий изучали при выращивании на различных жидких, полужидких и плотных питательных средах с добавлением и без добавления различных питательных веществ .

При изучении морфологических свойств штаммов и при выделении чистой культуры посевы на плотные питательные среды производили по методу Дригальского .

Для определения биохимических свойств использовали культуры орнитобактерий, выросшие на плотной питательной среде, через 48 часов инкубации при 37°С, среды Гисса, системы индикаторные бумажные (СИБ) для идентификации микроорганизмов, карты GN (для идентификации грамотрицательных микроорганизмов, не требовательных к составу питательной среды) и NH (для микроорганизмов, требовательных к составу питательной среды) для бактериологического анализатора Vitek2 Compact (bioMerieux, Франция), наборы API 20E (bioMerieux, Франция) .

Культуру, выросшую на плотной питательной среде, смывали стерильным 0,85%-м раствором поваренной соли и доводили концентрацию бактериальной суспензии до 50 ед. мутности по оптическому стандарту. Эту суспензию использовали в соответствии с наставлением по применению систем индикаторных бумажных (СИБ) и высевали на среды Гисса .

На приборе Vitek2 Compact и в наборах API 20E использовали концентрации бактерий в соответствии с инструкцией по применению .

Каталазную активность определяли с помощью 1% раствора перекиси водорода. Образование сероводорода определяли посредством высева культуры бактериологической петлей на ПЖА и последующим нанесением на поверхность среды соответствующего индикаторного диска. Подвижность орнитобактерий определяли высевом бактериальной культуры в ПЖА уколом бактериологической петлей. Посевы инкубировали от 30 минут до 24 часов при температуре 37°С [GerhardtP. etal., 1981] .

Чувствительность орнитобактерий к антибактериальным препаратам определяли диско-диффузионным методом в соответствии с "Методическими указаниями по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам" (МУК 4.2.1890-04) .

Патогенные свойства орнитобактерий изучали посредством экспериментального заражения восприимчивых животных (цыплят-бройлеров) в инфраорбитальные синусы и брюшные воздухоносные мешки для подбора оптимальных путей заражения .

Для определения концентрации суспензии орнитобактерий экспериментально заражали цыплят-бройлеров в возрасте 24-25 суток в подглазничные синусы О. rhinotracheale в объёме 0,5 см десятикратными разведениями суспензии 48-часовой агаровой культуры возбудителя. Из расчета по 10 голов цыплят-бройлеров на одно 10-кратное разведение .

Наличие антител в сыворотках крови цыплят-бройлеров к орнитобактериям проверяли в коммерческом наборе ИФА (IDEXX) перед заражением и на 14 сутки .

За клиническим состоянием подопытной птицы вели наблюдение в течение 14 суток. Павшую и вынужденно убитую птицу вскрывали, проводили отбор проб патологического материала для бактериологического анализа с целью подтверждения специфичности заболевания и определения диссеминации возбудителя в организме. В качестве материала для бактериологического исследования отбирали: легкие, селезенку, печень, головной мозг, смывы с трахеи, инфраорбитальных синусов и воздухоносных мешков .

Патогенные свойства референтных штаммов и полевых изолятов О. rhinotracheale изучали на СПФ-цыплятах в возрасте 14 суток и цыплятахбройлерах в возрасте 25 суток. Наблюдение за птицей вели в течение 14 дней .

Патогенные свойства штаммов орнитобактерий оценивали при помощи бальной системы [P. van Empel et al., 1996], основанной на проявлении тяжести видимых патологоанатомических изменений, наблюдаемых при вскрытии через 14 дней после экспериментального заражения .

Культуру считали патогенной в случае гибели или наличия у зараженной птицы соответствующих патологических изменений в период наблюдения 14 суток .

Филогенетические свойства изучали с помощью секвенирования гена 16S рРНК. ДНК из исследуемой культуры О. rhinotracheale выделяли с помощью магнитных частиц MagneSil на автоматической станции Freedom EVO 100 .

Постановку ПЦР проводили по стандартной методике с использованием фермента Taq DNA Polymerase. Очищенные фрагменты гена 16S рРНК секвенировали на генетическом анализаторе АВІ Prism 3130 с использованием праймеров OR16S-R1 и OR16-F1 (концентрация 5 пМ/мкл каждого праймера в смеси). Полученные последовательности сравнивали с аналогичными последовательностями из GenBank .

Получение специфических компонентов для постановки серологических реакций. Антигены бактерий для гипериммунизации кроликов и для серологических реакций получали по методам описанным О. Erganis и A. Back [О. Erganis et al., 2002; A. Back et al., 1998]. Антиген, предназначенный для иммунизации животных, хранили без консерванта при 4°С, в то время как антигены, предназначенные для использования в серологических реакциях, консервировали раствором мертиолята (1:10 000) и хранили при 4СС .

Гипериммунизацию кроликов формалинизированным антигеном (Ф-АГ) О. rhinotracheale проводили в соответствии с методикой описанной О. Erganis [О. Ergaras etal., 2002] .

Определение антигенного родства изолятов бактерий О. rhinotracheale .

Степень двустороннего антигенного родства (R) по соматическому антигену определяли в реакции агглютинации, рассчитывали по формуле Архетти и Хорсфала [J. Archetti, F.L. Horsfall, 1950] и выражали в процентах .

При 3-кратном титровании значение R 70% свидетельствует о родстве испытуемых изолятов .

Определение концентрации микробных клеток. Концентрацию микробных клеток в бактериальных суспензиях определяли визуально по стандарту (эталону) мутности или по МакФарленду. Концентрацию живых микробных клеток определяли методом титрования на плотной питательной среде и выражали в колониеобразующих единицах .

Культивирование орнитобактерий проводили методами поверхностного и периодического глубинного культивирования. Поверхностное культивирование и проводили на поверхности плотной питательной среды для изучения культуралыюморфологических свойств бактерий, получения антигенов для иммунизации животных и постановки серологических реакций .

В ходе изучения динамики роста графически описывали кривые изменения концентрации микробных клеток в процессе культивирования, а также определяли фазы роста бактерий и их продолжительность .

При определении основных параметров роста бактерий учитывали удельную скорость роста, время удвоения концентрации живых микробных клеток, максимальное накопление бактерий в питательной среде и время культивирования орнитобактерий .

Расчет показателя удельной скорости роста микроорганизмов производили по общепринятой методике [С.Дж. Перт, 1978] .

Подбор условий и способов хранения орнитобактерий. Хранение штаммов орнитобактерий в лабораторных условиях осуществляли путем замораживания штаммов орнитобактерий при температуре минус 40°С и минус 20°С, лиофильного высушивания культур, а также методом субкультивирования на плотных и жидких питательных средах. При хранении проводили количественную оценку выживаемости бактерий .

При хранении на плотных и жидких питательных средах выживаемость микроорганизмов оценивали качественно. С этой целью бактериальные культуры высевали на плотные питательные среды. Посевы инкубировали при 37°С в течение 48 часов .

Статистическая обработка результатов. При анализе и обработке результатов исследований были использованы статистические методы, описанные И.П. Ашмариным и А.А. Воробьевым (1962) .

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Бактериологический анализ патологического материала. Первым этапом данной работы было исследование патологического материала от вынужденно убитой и павшей птицы. Материал поступал из различных регионов РФ:

Белгородской, Вологодской, Владимирской, Нижегородской, Новгородской, Самарской, Московской, Костромской, Ярославской, Ульяновской, Липецкой, Тульской, Пермской, Челябинской, Курской, Ростовской, Ленинградской, Кировской областей и республик: Мордовия, Чувашия, Татарстан, Башкортостан .

За период с 2007 по 2010 гг. исследовано 410 проб патологического материала от заболевших кур и индеек различных возрастов на наличие возбудителя орнитобактериоза птиц. Получено 19 изолятов орнитобактерий. На основании исследования биохимических свойств изолятов, в дальнейшем для работы использовали изоляты «Т-1», «Кр-1», «Б-1» и штамм №130 ДЕП .

В лабораторию доставляли как живую птицу на разных стадиях заболевания, так и патологический материал от павшей и вынужденно убитой птицы .

Схема бактериологического исследования патологического материала на орнитобактериоз птиц представлена на рис. 1 .

В качестве патологического материала для исследования на наличие возбудителя орнитобактериоза птиц отбирали кровь из сердца, смывы с трахеи, подглазничных синусов и воздухоносных мешков, пораженные легкие, экссудат из перикардиальной полости, суставную жидкость, селезенку, печень и головной мозг .

Посевы из органов (отпечатки), экссудата и смывов проводили на плотные питательные среды (ХА, Эндо или МакКонки, КА или ХФ, ХКЭ). Также первичный посев делали на жидкие питательные среды (ХБ, МПБ). Рост учитывали через 24-72 ч инкубирования в аэробных условиях при 37°С .

Возбудитель орнитобактериоза птиц был выделен только из легких и инфраорбитальных синусов птицы с респираторным синдромом .

После инкубирования посевов патологического материала выросшие культуры просматривали визуальноТШикроскопировали мазки из подозрительных "колоний—под—иммерсией при х2000, наблюдали мелкие грамотрицательные полиморфные палочки. Изолированные колонии с КА, ХКЭ, ХФ, характерные по тинкториальным и морфологическим свойствам для О. rhinotracheale (через 48 часов инкубации округлые, выпуклые, прозрачные или полупрозрачные с ровными краями колонии, диаметром около 0,2-1 мм), пересевали на КА, ХКЭ или ХФ для получения чистой культуры .

–  –  –

- микроскопия мазков по Граму;

- биохимические свойства;

- серологическая идентификация;

- положительная биопроба на восприимчивых животных (цыплятабройлеры, возраст 20-25 сток Рис. 1. Схема бактериологического исследования на орнитобактериоз птиц Для установления принадлежности к виду О. rhinotracheale исследовали биохимическую активность подозрительных культур, их серологические свойства в РА на стекле, а также проводили постановку ПЦР. Для дальнейшей работы были отобраны изоляты бактерий О. rhinotracheale, обладающие различиями между собой по биохимическим свойствам. Изолят О. rhinotracheale «T-1» был выделен из легкого цыпленка-бройлера 30-суточного возраста, «Кр-1» был выделен из инфраорбитальных синусов индейки 105-суточного возраста, «Б-1» выделен из инфраорбитальных синусов цыпленка-бройлера 32-суточного возраста. Штамм «Задонский-1» №130 ДЕП был выделен из легких цыпленка-бройлера 24-суточного возраста .

Основные биологические свойства референтных штаммов и изолятов бактерий О. rhinotracheale. На данном этапе работы были изучены культуральноморфологические и биохимические свойства бактерий О. rhinotracheale изолятов «Т-1», «Кр-1», «Б-1» и штамма «Задонский-1» №130 ДЕП в сравнении с референтными штаммами №№ 51463, 51464, 51465 .

При окраске по Граму в фиксированных мазках культур О. rhinotracheale всех выделенных изолятов наблюдали мелкие, тонкие, полиморфные, грамотрицательные палочки, расположенные одиночно или парами. Окраск изолятов орнитобактерий по Бурри-Гинсу и Ольту показала отсутствие капсулы .

Рост на ПЖА всех изолятов О. rhinotracheale строго по уколу свидетельствовал об отсутствии жгутиков .



Референтные штаммы и изоляты орнитобактерий росли на КА, ХКЭ, ХДЭ, ХФ, XSB, XSA, ХБ, ХБД через 24-48 часов инкубации. На СК, ХА только через V часа инкубации. На МПБ, МПА, МПБД, БТХ, агаре МакКонки, среде Эндо рос орнитобактерий отсутствовал. На РРВА рост орнитобактерий наблюдали через 4 часов инкубирования в виде небольшого помутнения. Выделенные изоляты н обладали гемолитической активностью на КА .

Морфологию колоний изолятов О. rhinotracheale определяли пр выращивании на ХФ и КА, через 24-48 ч инкубирования в термостате при 37°С Колонии изолятов О. rhinotracheale через 24 часа инкубирования был прозрачными, правильной круглой формы, блестящие, диаметром не более 0,2 мм через 48 часов инкубации круглые, блестящие, края ровные, полупрозрачные диаметром около 0,5-0,7 мм .

При изучении биохимических свойств изолятов орнитобактери посредством наборов СИБ и сред Гисса было отмечено, что все изоляты имею положительную реакцию по оксидазе, р-галактозидазе, лактозе и D-маннозе Отрицательные результаты наблюдали в реакциях на орнитиндекарбоксилазу лизиндекарбоксилазу, цитрат и малонат натрия, окисление арабинозы, инозита сорбита, на образование индола и сероводорода, а также на уреазную активность Штамм «Задонский-1» №130 ДЕП отличался от других изолятов положительной реакцией по окислению сахарозы и маннита. Изоляты «Т-1» и «Б-1» отличались положительной реакцией по аргининдегидролазе. Изоляты «Т-1», «Б-1», штамм «Задонский-1» №130 ДЕП, в отличие от изолята «Кр-1», показали положительный результат по окислению мальтозы. Изолят «Б-1» не окислял D-глюкозу .

При изучении биохимических свойств изолятов орнитобактерий на бактериологическом анализаторе Vitek2 Compact, с использованием карт GN было отмечено, что все они обладают одинаковой биохимической активностью. Изоляты О. rhinotracheale «Т-1» и «Б-1» окисляли D-мальтозу в отличие от других. Изоляты «Т-1» и «Кр-1» ферментировали D-глюкозу в отличие от остальных изолятов .

Изолят «Б-1» также отличался от других изолятов отрицательной реакцией по липазе. Изолят «Задонский-1» №130 ДЕП в отличие от других изолятов показал отрицательную реакцию по D-маннозе и положительную реакцию по окислению сахарозы .

При исследовании биохимических свойств изолятов орнитобактерий на бактериологическом анализаторе с использованием карт NH установили различия между изолятами и штаммами. Штамм «Задонский-1» №130 ДЕП отличался от других выделенных изолятов положительной реакцией по у-глютамилтрансферазе и отрицательной по окислению D-глюкозы, D-мальтозы и N-auemn-Dглюкозамину. Изолят «Кр-1» отличался от других изолятов положительной реакцией по L-лизинариламидазе .

При исследовании биохимических свойств изолятов орнитобактерий с использованием систем API 20E наблюдали идентичные биохимические свойства у всех штаммов и изолятов О. rhinotracheale .

При определении чувствительности изолятов О. rhinotracheale к антибактериальным препаратам было установлено, что выраженным антибактериальным действием обладают цефалоспорины III поколения (цефоперазону), полусинтетические аминопенициллины (ампициллин), ингибиторозащищенные пенициллины (амоксициллин клавуланат), фторхинолоны III поколения (байтрил) и группа левомицетина (левомицетин) .

Патогенные свойства О. rhinotracheale. Результаты опытов показали, что орнитобактериоз птиц удалось воспроизвести при способах заражения птицы в инфраорбитальные синусы и брюшные воздухоносные мешки. Тем не менее, в дальнейших экспериментах по изучению патогенных свойств О. rhinotracheale мы пользовались только методом заражения в инфраорбитальные синусы, как наиболее удобным и максимально приближенным к естественному пути заражения птицы. Установлено, что для полноценного воспроизведения орнитобактериоза птиц в лабораторных условиях, концентрация живых микробных клеток в используемой суспензии должна составлять не менее 3,0х109 КОЕ/см3 .

Патогенность изолятов О. rhinotracheale «Т-1», «Кр-1», «Б-1» и штаммов №№51463, 51464, 51465, «Задонский-1» №130 ДЕП оценивали при экспериментальном заражении в подглазничные синусы цыплят мясных кроссов 21-30-суточного возраста в концентрации бактерий 5,0х109 КОЕ/см3 и СПФ-цыплят 14-суточного возраста в концентрации бактерий 1,0х1010 КОЕ/см3. Наблюдение за экспериментально зараженной птицей показало, что все изоляты и штаммы вызывали клинические и патологоанатомические изменения, которые в полевых условиях можно было спутать с другими заболеваниями респираторного тракта .

У экспериментально зараженных цыплят мясных кроссов 21-30 суточного возраста наблюдали стертые респираторные клинические признаки. Начало падеж птицы наблюдали при экспериментальном заражении штаммом О. rhinotracheale «Задонский-1» №130 ДЕП на 3 день после заражения, при введении возбудителя концентрации живых микробных клеток 6,6x109 КОЕ/см3. В остальных случая падеж не наблюдали .

При вскрытии павшей и вынужденно убитой на 14 сутки птицы, зараженно штаммом О. rhinotracheale «Задонский-1» №130 ДЕП, наблюдали следующи патологоанатомические изменения: катаральные и серозные синуситы, трахеиты одно- или двустороннюю крупозную пневмонию в стадии красной гепатизации серозные аэросаккулиты и редкие случаи гидроперикардита. При вскрытии птицы зараженной изолятом «Т-1», наблюдали катаральные синуситы, трахеиты и оте легких. Вскрытие птицы, зараженной изолятом «Кр-1», показало катаральны синуситы, трахеиты и крупозное воспаление легких. При экспериментально;

заражении бактериями штаммов №№51463, 51464, 51465 наблюдали катаральные серозные синуситы, трахеиты, одно- или двустороннюю крупозную пневмонию стадии красной гепатизации, единичные случаи аэросаккулитов гидроперикардита .

При экспериментальном заражении СПФ-цыплят !4-суточного возраста штаммом О. rhinotracheale «Задонский-1» №130 ДЕП наблюдали наиболее тяжелые патологоанатомические поражения в отличие от остальных изолятов, общая сумма баллов была равна 24. При экспериментальном заражении СПФцыплят суспензиями полевых изолятов «Т-1», «Кр-1», «Б-1», а также референтного штамма №51463, среди опытной птицы наблюдали схожую тяжесть патологоанатомических изменений около 18 баллов. Было установлено наличие положительных титров антител к О. rhinotracheale в сыворотках крови птиц опытных групп в ИФА .

Возбудитель болезни был изолирован из пораженных легких, реже из инфраорбитальных синусов и трахеи .

Таким образом, на основании патологоанатомических изменений и результатов бактериологического исследования можно заключить, что на территории РФ циркулируют патогенные изоляты О. rhinotracheale, вызывающие заболевание восприимчивой птицы в экспериментальных условиях .

Определение филогенетических свойств, выделенных изолятов О. rhinotracheale. При изучении нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК установлено, что все выделенные изоляты были близкородственны с уровнем идентичности 99-100%. В результате сравнения с аналогичными последовательностями изолятов и штаммов О. rhinotracheale из GenBank российские изоляты были генетически наиболее близки к PT-SB930803-E2 и CY200505L2, выделенным в Тайване, а также референтному штамму АТСС-51464 .

Изоляты «Б-1», «Кр-1», «Т-1» были полностью идентичны изолятам U87100, АТСС-51464, OR-IR, тогда как штамм «Задонский-1» №130 ДЕП не имел полной идентичности ни с одним из зарубежных изолятов .

Подбор условий культивирования орнитобактерий. В исследованиях использовали ХБ, ХБД и РРВА. Оценку питательных сред проводили комплексно изучали динамику и определяли основные параметры роста орнитобактерий на примере штамма №51463. Также проводили сравнение динамики роста орнитобактерий в стационарных условиях и при культивировании на УВМТ-12-250 (при шуттелировании), кроме того изучали ростстимулирующее влияние экстракта пекарских дрожжей .

Кривые динамики роста орнитобактерий на различных питательных средах представлены на рисунке 2 .

–  –  –

Рис. 2 Динамика роста О. rhinotracheale на различных питательных средах .

Было установлено, что наилучшими ростовыми свойствами обладаю питательные среды на основе ХБ.

При выращивании бактерий на данны:

питательных средах отмечали высокие показатели удельной скорости рост (0,39±0,04, 0,32±0,02 ч"'), продолжительную экспоненциальную фазу роста (6-!

часов) и большое накопление орнитобактерий (8,23±0,03; 8,22±0,09 lg КОЕ/см ) .

Изучено ростстимулирующее влияние экстракта пекарских дрожжей н динамику роста бактерий О. rhinotracheale при его добавлении к ХБ. При этои отмечали увеличение удельной скорости роста на 43,8% (0,73 ч'1), сокращена экспоненциальной фазы до 6 часов, увеличение максимального выхода биомасс* до 8,40 lg КОЕ/см3 .

Культивирование орнитобактерий на ХБ в УВМТ-12-250 позволяет получил максимальное накопление биомассы (8,36 lg КОЕ/см ) через 8 часоі культивирования, что в 1,5 раза превышает максимальный выход прі культивировании в стационарных условиях (8,23 lg КОЕ/см3), полученный через 10 часов культивирования .

Получение специфических компонентов для серологических реакций .

Формалинизированный антиген (Ф-АГ) и специфические сыворотки крови кролика получали по методикам, изложенным в предыдущих разделах .

При постановке качественной РА на стекле, реакцию наблюдали лишь между специфическими компонентами одного вида. В количественной РА все компоненты были высоко активны и специфичны .

Показано, что сыворотки гомологичные О. rhinotracheale имели титр от 21±5 до 1024 .

Полученные специфические компоненты позволяют проводить качественную РА на стекле и количественную РА для идентификации культур орнитобактерий .

Определение антигенного родства орнитобактерий. На данном этапе работы для определения антигенного родства использовали Ф-АГ из референтных штаммов О. rhinotracheale из АТСС. Серотипирование проводили в РА посредством перекрестного титрования сывороток сравниваемых штаммов с гомологичными и испытуемыми антигенами .

Установлено, что изолят «Кр-1» родственен штаммам №№ 51463, 51464, изолят «Б-1» родственен штамму №51464. Изолят «Т-1» и штамм «Задонский-1»

№130 ДЕП не родственны ни одному из референтных штаммов .

Определение условий и сроков хранения штаммов О. rhinotracheale. С этой целью изучали выживаемость бактерий в процессе хранения методом субкультивирования, замораживания на минус 40°С и минус 20°С и в лиофилизированном виде. В ходе проведенных опытов было установлено, что хранение бактерий О. rhinotracheale в лиофилизированном виде обеспечивало сохранность исходных биологических свойств штаммов в течение 12 месяцев (срок наблюдения) .

4. ВЫВОДЫ

1. Впервые выделены изоляты О. rhinotracheale от птиц, поступавших из различных регионов РФ, и изучены их основные биологические свойства

2. Изучены генетические свойства изолятов орнитобактерий. Установлена идентичность последовательностей гена 16S рРНК изолятов «Кр-1», «Т-1» и «Б-1»

с изолятами из Тайваня: PT-SB930803-E2, CY200505L2 и зарубежным штаммами U87100, ATCC-51464, OR-IR. Последовательность гена 16S рРНК штамма «Задонский-1» №130 ДЕП отличалась от последовательностей генов зарубежных штаммов, содержащихся в базе данных GenBank .

3. Обоснована рецептура питательной среды на основе мясного гидролизата по Хоттингеру (с содержанием аминного азота 250-300 мг%) и определен оптимальный способ культивирования О. rhinotracheale (в динамических условиях), что позволяет через 6 часов культивирования получить максимальный выход бактериальной массы (8,40 lg КОЕ/см3) .

4. Установлено, что лиофильное высушивание орнитобактерий в сахарозожелатозной среде и последующее хранение при минус 40°С в течение 12 месяцев (период наблюдения) не изменяет их биологических свойств .

5. Определена заражающая доза (ЗхЮ9 КОЕ/см3) у цыплят, необходимая дл воспроизведения орнитобактериоза птиц. Было показано, что гибель цыплят наиболее тяжелые поражения вызывал штамм «Задонский-1» №130 ДЕП .

6. Роль О. rhinotracheale в этиологии респираторной патологии кур был подтверждена при экспериментальном заражении, при котором у птиц опытны групп наблюдали развитие пневмонии, трахеита и синусита .

7. Впервые в РФ получены специфические компоненты О. rhinotracheale определена степень антигенного родства изолятов между собой и по отношению референтным штаммам. Изолят «Кр-1» родственен референтным штамма №№51463, 51464, изолят «Б-1» - штамму №51463, в то время как, изолят «Т-1»

штамм «Задонский-1» №130 ДЕП не родственны ни одному из референтны штаммов .

8. Установлено, что выделенные изоляты О. rhinotracheale чувствительны аминопенициллинам, ингибиторозащищенным пенициллинам, фторхинолонам II поколения, группе левомицетина, группе нитрофурановых препаратов цефалоспоринам III поколения .

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для практического использования предложены «Методически рекомендации по лабораторной диагностике орнитобактериоза птиц утвержденные Заместителем руководителя Федеральной службы по ветеринарному и фитосанитарному надзору. Данная методика позволяет проводить выделение орнитобактерий из патологического материала и их идентификацию .

Штамм «Задонский-1» №130 ДЕП депонирован в коллекции бактериальных культур ФГУ «ВГНКИ» и используется при производстве набора для выявления антител к О. rhinotracheale в ИФА .

6. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ

1. Чернышев А.В., Прунтова О.В., Ручнова О.И. Патогенные свойства Ornitobacterium rhinotracheale при экспериментальном заражении цыплятбройлеров // Вестник ветеринарии. - 2010. -№55. - С. 45-49 .

2. Чернышев А.В., Ручнова О.И., Прунтова О.В. Подбор питательной среды и условий культивирования Ornithobacterium rhinotracheale II Ветеринария и кормление.-2010.-№6.-С. 52-53 .

3. Генетическая характеристика бактерий Ornithobacterium rhinotracheale, выделенных на птицеводческих хозяйствах Российской Федерации / Чернышев А.В., Спрыгин А.В., Ручнова О.И., Мудрак Н.С., Прунтова О.В., Дрыгин В.В. // Сб .

тр. VII Всерос. конф. с междунар. участием «Молекулярная диагностика Москва, 2010. - Т.2. - С. 191-192 .

4. Чернышев А.В., Ручнова О.И., Прунтова О.В., Шадрова Н.Б .

Биологические свойства штаммов Ornithobacterium rhinotracheale II Тр .

Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2010. - Т.8. - С .

204-213 .

5. Чернышев А.В., Ручнова О.И. Изучение биологических свойств штамма «3-1» Ornithobacterium rhinotracheale, выделенного на территории РФ // Тр .

Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2009. - Т.7. - С .

202-209 .

6. Чернышов А.В., Прунтова О.В., Шадрова Н.Б. Биохимические свойства Ornithobacterium rhinotracheale II Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины / Всерос. науч.-исслед. ин-т ветеринар, вирусологии и микробиологии.- Покров, 2009. — С. 166-168 .

7. Genetic characterization of Ornithobacterium rhinotracheale from commercial chicken flocks in Russia / Chernyshev A.V., Sprygin A.V, Mudrak N.S. [et al.] // MEEGID X Congress. - Amsterdam, the Netherlands, 2010 .

–  –  –






Похожие работы:

«Министерство природных ресурсов и экологии Волгоградской области Доклад о состоянии окружающей среды Волгоградской области в 2013 году Волгоград "СМОТРИ" УДК 502/504(470.45)(042.3) ББК 20.18 Д63 Редакционная коллегия: Вергун П.В. – министр природных ресурсов и экологии Волгоградской области, председатель ред...»

«Кесорецких Иван Иванович ОЦЕНКА УЯЗВИМОСТИ ЛАНДШАФТОВ КАЛИНИНГРАДСКОЙ ОБЛАСТИ К АНТРОПОГЕННЫМ ВОЗДЕЙСТВИЯМ Специальность 25.00.36 – геоэкология (науки о Земле) Диссертация на соискание ученой степени кандидата географических наук Научный руководитель доктор географических наук,...»

«\\ Выписка из инструкции № 01/12 по применению средства дезинфицирующего с моющим эффектом "А-ДЕЗ" на предприятиях общественного питания и продовольственной торговли ООО "Дезконтракт", Россия 1.1. Cредство "А-ДЕЗ" предста...»

«По военным дорогам отца Часть 4 Предисловие. В конце лета и осенью 1944 года в этих местах воевал мой отец в составе 307 стрелковой дивизии. Бои тут были тяжёлые. Немцы создали здесь мощную оборону по реке Бебжа (Бобр) и Августовскому каналу. Леса, озёра и болота были для них...»

«РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ЗООЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ Программа ОБН РАН "Фундаментальные основы управления биологическими ресурсами" Программа Президиума РАН "Научные основы сохранения биоразнообразия России" ОТЧЁТНАЯ НАУЧНАЯ СЕССИЯ ПО ИТОГАМ РАБОТ 2004 г. ТЕЗИСЫ ДОКЛАДОВ Санкт-Петербург...»

«РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК (ОТДЕЛЬНЫЙ ОТТИСК) МОСКВА ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2001, том 380, № 4, с. 548-551 БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ УДК 578.825.11:577.6.08853:577.113.6.088 АНТИГЕРПЕТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ДИМЕРНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ НЕТРОПСИН...»

«Ю.ъ. й/ ' Стародубова Юлия Владнмировна МЯСНАЯ ПРОДУКТИВНОСТЬ и КАЧЕСТВО МЯСА МОЛОДНЯКА СВИНЕЙ ПОД ВЛИЯНИЕМ ПРЕПАРАТОВ САТ-СОМ И СЕЛЕНОЛИН 06.02.10 частная зоотехния, технология производства продуктов животноводства 8 Д Е Н 2011 АВТ...»

«СЕКЦИЯ 10. ГЕОЭКОЛОГИЯ, ОХРАНА И ЗАЩИТА ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ. ГЕОИНФОРМАЦИОННЫЕ СИСТЕМЫ В ГЕОЭКОЛОГИИ ОЦЕНКА ВОЗДЕЙСТВИЯ НЕФТЕГАЗОДОБЫВАЮЩИХ МЕСТОРОЖДЕНИЙ НА СОСТОЯНИЕ АТМОСФЕРНОГО ВОЗДУХА ПО ДАННЫМ ИЗУЧЕНИЯ СНЕГОВОГО ПОКРО...»




 
2019 www.mash.dobrota.biz - «Бесплатная электронная библиотека - онлайн публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.