WWW.MASH.DOBROTA.BIZ
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - онлайн публикации
 

«Волков  Денис  Александрович НОВАЯ  АСПАРТАТНАЯ  ПРОТЕИНАЗА  РЕТРОТРАНСПОЗОНА ULYSSES  (DROSOPHELAVIRILIS) ...»

Российская Академия Наук

Ордена Трудового Красного Знамени Институт биоорганической химии им .

академиков М.МШемякина и Ю.А.Овчинникова

На правах рукописи УДК

577.322:577.539.26

Волков  Денис  Александрович

НОВАЯ  АСПАРТАТНАЯ  ПРОТЕИНАЗА  РЕТРОТРАНСПОЗОНА

ULYSSES  (DROSOPHELAVIRILIS)

03.00.04.-Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва-2005 Работа  выполнена  в  Институте  биоорганической  химии  им.  академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН .

Научный  руководитель:

профессор,  доктор химических наук Л.Д.Румш .

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАН,  доктор химических наук Габибов А.Г .

доктор химических наук Филиппова И.Ю .

Ведущая  организация:

Государственный  научно-исследовательский  нститут  биомедицинской химии им. В.Н.Ореховича РАМН .

Защита  диссертации  состоится  "02"  марта  2005  г.  в  10  часов  на  заседании специализированного  совета  Д.002.019.01  при  Институте  биоорганической  химии им.  академиков  М.М.Шемякина  и  Ю.А.Овчинникова  РАН  по  адресу:  117997, Москва,  ул.Миклухо-Маклая,  16/10 .

С  диссертацией  можно  ознакомиться  в  библиотеке  Института биоорганической  химии  им.  академиков  М.М.Шемякина,  и  Ю.А.Овчинникова РАН .



Автореферат разослан  "02"февраля  2005  г .

Ученый  секретарь специализированного совета доктор химических наук, профессор

ОБЩАЯ  ХАРАКТЕРИСТИКА  РАБОТЫ

Актуальность  проблемы.  Функции  аспартатных  протеиназ  в  живом  организме чрезвычайно  разнообразны.  Они  участвуют  в  процессах  пищеварения,  в  процессинге различных  гормонов  и  нейропептидов,  в  деградации  белкового  материала.  К  аспартатным протеиназам  также  относятся  протеиназы  большинства  ретровирусов,  включая  вирус иммунного дефицита человека (HIV)  и  аналогичные  вирусы животных .

В  последнее  время  обнаружено  множество  эндогенных  ретровирусов  и ретротранспозонов  (мобильных  генетических  элементов,  широко  распространенных  в геномах  бактерий,  растений,  животных).  При  этом  оказалось,  что  ретротранспозоны содержат  нуклеотидные  последовательности,  продуктами  трансляции  которых  являются белки,  гомологичные ретровирусным  аспартатным  протеиназам .

Полученные  недавно  данные  о  возможности  активации  эндогенных  ретровирусов животных  при  пересадке  органов  человеку,  а  также  активации  эндогенных  ретровирусов человека  при  заражении  HIV,  делают  изучение  ретротранспозонов  актуальной  проблемой .

Аспартатные  протеиназы  являются  ключевыми  ферментами  жизненного  цикла ретровирусов  и  ретротранспозонов.  Они  осуществляют  процессинг  полибелковпредшествеников,  высвобождая  тем  самым  фунционально-активные  ферменты, ответственные  за  транспозицию  и  встраивание  ретровируса  или  транспозона  в  геном клетки-хозяина.  Поэтому  эти  ферменты  представляют  собой  основную  мишень лекарственной терапии .

Цель  работы.  Целью  данной  работы  было  выделение  и  исследование  протеиназы мобильного  генетического  элемента  Ulysses  (Drosophila  virilis).  Для  достижения поставленной  цели  решались  следующие  задачи:



1.  Локализация  гена протеиназы Ulysses  в  составе ретротранспозона .

2.  Гетерологичная экспрессия в E.coli гена протеиназы ретротранспозона Ulysses .

3.  Исследование  физико-химических и  энзиматических  свойств  протеиназы Ulysses .

4.  Построение  пространственной  модели  протеиназы Ulysses  методом  гомологичного моделирования и молекулярной динамики .

Научная  новизна  и  практическая  ценность  работы.  Ретротранспозон  Ulysses имеет  структурную  организацию,  характерную  для  LTR-содержащих  ретротранспозонов:

первая  свободная  рамка  считывания  кодирует  белки  матрикса  и  капсида,  вторая  протеиназу,  обратную транскриптазу,  РНКазу Н и  интегразу .

Сравнительный  анализ  аминокислотных  последовательностей  аспартатных протеиназ  ретровирусов  и  ретротранспозонов  позволил  сделать  предположение  о первичной  структуре  и  фланкирующих  последовательностях  протеиназы  Ulysses, предполагаемая  последовательность  которой  содержит  консервативные  для  аспартатных протеиназ  структурные  области,  в том  числе  триаду DTG  в  области  активного  центра .

Соответствующий  фрагмент  кДНК  был  клонирован  и  экспрессирован  в  E.coli .

Рекомбинантный  белок  был  подвергнут  рефолдингу  и  очищен  методом  аффинной хроматографии  на  пепстатин-агарозе.  Полученная  протеиназа  обладает  протеолитической активностью  и  имеет  рН  оптимумом  действия  в  области  рН  5,5,  что  характерно  для большинства  аспартатных  протеиназ.  Исследованы  физико-химические  свойства  и субстратная  специфичность  протеиназы  Ulysses .

В  целом,  данная  работа  является  первой  попыткой  получения  и  исследования  свойств аспартатной протеиназы из мобильного элемента .

Апробация  работы.  Результаты  данной  работы  были  представлены  на  V Симпозиуме  "Химия  протеолитических  ферментов"  (Москва,  Россия,  2002),  на международной  конференции  "ICAPI  03"(Kioto,  Japan.  November  14-16,  2003),  на  VII чтениях  посвященных памяти академика Ю.А.  Овчинникова (Москва,  Россия,  2004) .

Публикации.  По  материалам  исследования  опубликовано  2  печатных  работы .

Структура  работы.  Диссертационная  работа  изложена  на  95  страницах машинописного  текста  и  состоит  из  введения,  обзора  литературы,  обсуждения результатов,  экспериментальной  части,  выводов  и  списка  цитируемой  литературы .

включающего  125  работ .

СОДЕРЖАНИЕ  РАБОТЫ .

1.Определение  локализации  протеиназы Ulysses Drosophila virilis  в  составе полибелка-предшественника .

Первым  этапом  работы  было  установление  локализации  протеиназы  Ulysses  в составе  полибелка-предшественника.  Для  того,  чтобы  выявить  консервативные структурные  области  в  предполагаемой  последовательности  протеиназы ретротрансиозоиа  Ulysses,  был  проведен  сравнительный  анализ  аминокислотных последовательностей  известных  аспартатных  протеиназ  экзогенных  и  эндогенных ретровирусов  (рис .



  1),  основанный  на  использовании  "внутренних  систем  координат" для молекул  белков.  Полученные  данные  позволили  сделать  предположение  о  фланкирующих последовательностях  фермента.  Однако,  мы  столкнулись  с  определенными  трудностями, связанными  с  тем,  что  стандартная  для  всех  ретровирусных  протеаз  темп летная последовательность  -  гидрофобная  аминокислота-гидрофобная  аминокислота-глицинаргинин  (рис.  1),  характерная для  сегмента молекулы,  проходящего  через  активную  петлю активного  центра  и  близкого  к  С-концевому  сегменту,  попадала  совсем  в  другое  место молекулы.  Это  противоречие  можно  было  бы  снять,  предположив,  что  сегменты, связывающие  петлю-козырек  с  центральным  Р-слоем  молекулы,  укорочены  и  молекула  в целом  короче  молекулы  протеиназы  HIV-1.  С  другой  стороны,  было  высказано предположение,  что  молекула  протеиназы  Ulysses  может  быть  длиннее  молекулы протеиназы  HIV-1  за счет С-концевой  части.  Поэтому было  принято решение  клонировать фрагмент,  несколько  увеличенный  с  N-  и  С-концов,  по  сравнению  с  данными  по выравниванию,  в  расчете  на  то,  что  при  автопроцессинге  протеиназа  сама  обеспечит нужную  длину  молекулы.  Таким  образом,  на  основании  вышеизложенного,  было  решено клонировать  фрагмент  кДНК  соответствующий  аминокислотным  остаткам  с  номерами 119-231  для второй рамки  считывания .

Рис.1.  Сравнение  аминокислотных  последовательностей  аспартатных  протеинам ретровирусов  и  ретротранспозонов.  Консервативные  последовательности  в  области  активного центра  и  С-концевой  части  молекулы  выделены  рамкой,  а  -  область  активного  центра,  б  -  Сконцевая теплетная  последовательность.  SIV-  протеиназа вируса иммунодефицита обезьяны;  HIVи  HIV-1  -  протеиназы  вируса  иммунодефицита  человека  первого  и  второго  типа;  EIAV  протеиназа  вируса  инфекционной  анемии  лошади;  P.AER  -  аспартатная  протеиназа  Pseudomonas aeruginosa; Dr.Vir - протеиназа транспозона Ulysses  Drosophila virilis .

-  2. Клонирование гена протеиназы Ulysses Drosophila virilis в плазмидном векторе рЕТ-23а(+) .

Для  получения  рекомбинантной  протеиназы  соответствующий  ген  клонировали  в плазмидном  векторе  рЕТ-23а(+).  Фрагмент  ДНК,  кодирующий  протеиназу,  получали методом  полимеразной  цепной  реакции  (ПЦР),  используя  в  качестве  матрицы  фрагмент гена  ретротранспозона  Ulysses,  любезно  предоставленный  Евгеньевым  М.Б.  (институт молекулярной  биологии  им.  В.А.Энгельгарда  РАН).  Для  амплификации  были использованы  два  олигонуклеотидных  праймера:  1  -  5'-АА  ААА  CAT  ATG  GTC  AGA CGG  GAG  GAG  AGT-3',  содержащий  нуклеотидную  последовательность, соответствующую  5'-концу  гена  протеиназы.  Праймер  содержал  на  5'-конце  сайт узнавания рестриктазой  Nde I  (последовательность подчеркнута);  антисмысловой  праймер 2  -  5'-АА  ААА  AAG  CTT  TTA  CAG  CTC  TGG  TGC  GAT  СТС  АА-3'  содержал последовательность,  комплементарную  С-концевой  области  гена  протеиназы.  Сайт  Hind III  (подчеркнуто)  введен для  последующего  клонирования.  Полученный  в  результате ПЦР фрагмент ДНК  (-350  п.о.)  клонировали  в  вектор рЕТ-23а(+)  по рестриктным  сайтам Nde  I

-  Hind  III  (рис.  2).  Ген  протеиназы  был  клонирован  таким  образом,  что  первому  кодону протеиназы  предшествовал  инициирующий  кодон,  а  вслед  за  последним  кодоном  был вставлен  терминирующий  кодон .

Рис.2 Схема клонирования гена протеиназы Ulysses в плазмидном векторе рЕТ23а(+) З.Экспрессия  рекомбинантного  гена.  Очистка  белка .

В  настоящей  работе  клонирование  гена  протеиназы  из  мобильного  элемента Ulysses  проводили  в  клетках  E.coli  штамма  НВ101,  не  содержащего  гена  Т7  РНКполимеразы.  Для  экспрессии  соответствующего  гена  рекомбинантной  плазмидой  были трансформированы  компетентные  клетки  E.coli  штамма  BL2](DE3),  имеющего хромосомную  копию  гена  Т7  РНК-полимеразы  под  контролем  промотора  lac  UV5, индуцируемого  IPTG.  Синтез  рекомбинантного белка тестировали  методом  электрофореза в  присутствии  SDS  (рис.  3).  Целевой  белок  (-13  кДа)  накапливался  в  клетках  в  виде  тел включения  с  высоким  выходом.  Выделенные  тела  включения  растворяли  в  буфере, содержащем  8  М  мочевину,  и  подвергали  рефолдингу.  Рефолдинг  (ренату-рацию) денатурированных  целевых  белков  проводили  диализом  относительно  25  мМ  фосфатного буфера  рН  7,0  при  +4  °С.  Затем  белок  подвергали дальнейшей  очистке  методом  аффинной хроматографии  на  пепстатин-агарозе.  Полученный  белок  связывался  с  аффинным сорбентом  Связавшийся  белок  элюировали  буфером,  содержащим  20  мМ  Tris-HCl,  рН 9,5.  Чистота полученного  препарата  составляла  не  менее  90  %.  Из  1  литра  культуральной среды  получали  5-8  мг  очищенной  протеиназы.  Взаимодействие  белка  с  пепстатинагарозой  свидетельствовало  о  том,  что  произошло  формирование  субстрат-связывающего участка,  характерного  для  аспартатных  протеиназ.  Следовательно,  можно  было  ожидать

–  –  –

4.1 .Определение  молекулярной  массы  и изоэлектрической точки  (pi) .

По  данным  гель-электрофореза  в  денатурирующих  условиях  молекулярная  масса мономера  протеиназы  Ulysses  составляет  приблизительно  13  кДа.  Для  более  точного определения  молекулярной  массы  полученной  протеиназы,  использовали  метод  MALDITOF  масс-спектрометрии.  Молекулярная  масса  составила  12738  Да  (рис.4) ,  что соответствует  расчетной  массе  мономера  протеиназы  Ulysses,  соответствующей  12775  Да .

Был  проведен  N-концевой  и  С-концевой  анализ  аминокислотных  последовательностей .

Определено  шесть  N-концевых  аминокислотных  остатков:  Val-Arg-Arg-Glu-Glu-Ser .

Обработка  белка  карбоксипептидазой  А  позволила  установить  первую  С-концевую аминокислоту  белка  -  Leu.  Полученные  данные  находятся  в  полном  соответствии  с ожидаемой  структурой  протеиназы  Ulysses  и  говорят  об  отсутствии  автопроцессинга экспрессированного белка .

Рис. 4. MALDI-TOF-масс спектр протеиназы Ulysses

Определение  изоэлектрической  точки  фермента  проводили  методом изоэлектрического  фокусирования.  Экспериментальное  значение  составило  5.5,  что согласуется  с  расчетным  значением-  5.24.  Следует  отметить,  что  pi  большинства аспартатных  протеиназ  находятся  в  кислой  области,  за  исключением  протеиназы  HIV-1, обладающей  необычайно высокой  изоэлектрической точкой -  10,5 4.2. Гидролиз мелиттина .

Полученный  после  рефолдинга  препарат  белка  был  исследован  на  наличие  в  нем протеолитической  активности.  В  качестве  субстрата  нами  первоначально  был  выбран пептид,  используемый  при  исследовании  активности  протеиназы  HIV-1.  Однако  оказалось,  что  пептидная  связь  Nle-Nph .

гидролизуемая  протеиназой HIV-1  в этом  пептиде не гидролизуется  протеиназой  Ulysses  в интервале рН  3-10  при  37  °С  в течение суток .

Поэтому  для  тестирования  активности  полученного  белка  нами  в  качестве субстрата  был  выбран  мелиттин  -  пептид,  содержащийся  в  яде  пчелы.  Так  как  в  состав мелиттина  входят  как  отдельные  остатки,  так  и  кластеры  гидрофобных  и  заряженных аминокислот,  он  использовался  в  качестве  субстрата  для  сравнительного  анализа специфичности  сериновых  и  аспартатных  протеиназ.  Поэтому  нам  представлялось интересным  исследовать  специфичность  протеиназы  Ulysses  в  отношении  мелиттина .

Гидролиз  мелиттина  протеиназой  проводили  при  рН  5.5  в  течение  1  часа  (37  °С) .

Протеиназа  эффективно  гидролизовала  мелиттин.  Продукты  гидролиза  разделяли методом  высокоэффективной  жидкостной  хроматографии  (ВЭЖХ)  на  колонке  Ultrasphere С18  ("Beckman").  Обнаружено  три  продукта  ферментативного  гидролиза  субстрата ферментом  (рис.  5-1).  Анализ  N-концевых  аминокислотных  последовательностей  и молекулярных  масс  полученных  пептидов  позволил  установить  гидролизуемые пептидные  связи.  Полученные  результаты  и  известные  из  литературы  данные представлены  в  таблице  1.  Гидролизовались  связи  лейцил-треонин  и  лизил-аргинин.  Как видно  из  таблицы,  специфичность  протеиназы  Ulysses  частично  совпадает  со специфичностью  протеиназы  HIV-1  и  протеиназы  из  Trichoderma  viridi..  В  то  же  время гидролиз  связи,  образованной  двумя  положительно-заряженными  остатками  -  лизиларгинин, является необычным для аспартатных протеиназ .

4.3.Гидролиз В-цепи инсулина Для  дальнейшего  проведения  работ  по  изучению  специфичности  полученной протеиназы  в  качестве  субстрата  был  выбран  олигопептидный  субстрат  -  В-цепь инсулина.  В-цепь  инсулина  эффективно  гидролизуется  протеиназой  Ulysses.  Продукты гидролиза  разделяли  методом  ВЭЖХ  на  колонке  СЦ  (рис.  5-2),  были  установлены  их  Nконцевые  последовательности.  В  таблице  1  приведены  данные  по  расщеплению  В-цепи инсулина  некоторыми  аспартатными  протеиназами.  Гидролизовались  связи:  валилглутаминовая кислота, тирозил-треонин, лейцил-тирозин и глутамил-аланин. Как видно из таблицы,  специфичность  при  гидролизе  В-цепи  инсулина  как  и  при  гидролизе  мелиттина сохраняется:  гидролизуются  связи,  образованные  как  гидрофобными  аминокислотами,  так и заряженными .

Рис.  5. ВЭЖХ продуктов ферментативного гидролиза, рН 5,5, мелиттина (1) и В-цепи инсулина (2) протеиназой Ulysses на колонке Ultrasphere С18.  Гидролизуемые связи отмечены стрелками .

Таблица  1. Специфичность различных аспартатных протеиназ в отношение мелиттина и В-цепи инсулина .

4.4. Определение рН-оптимума .

На  следующем  этапе  работы  была  исследована  рН-зависимость  гидролиза мелиттина  протеиназой  Ulysses.  Реакцию  проводили  в  диапазоне  рН  от  2  до  10.  За реакцией  следили  по  убыли  субстрата.  График  зависимости  степени  гидролиза  субстрата от  рН  представлен  на  рисунке  6.  График  имеет  колокообразную  форму,  оптимум  рН  для протеиназы  находится  в  области  рН  5,5.  Это  обстоятельство  роднит  полученную  нами протеиназу  с  известными  аспартатными  протеиназами,  которые  проявляют  наибольшую активность  при  кислых  значениях  рН .

Интересными  оказались  результаты  по  анализу  рН-зависимости  скорости образования  продукта,  появляющегося  при  гидролизе  связи  Lys-Arg.  Эта  связь  более эффективно  гидролизовалась  при  щелочных  значениях  рН  (9-10).  Подобный  факт  можно объяснить  тем,  что  остатки  аргинина  и  лизина,  при  щелочных  значениях  рН,  находятся  в незаряженном  состоянии.  Таким  образом,  взаимодействие  субстрата  с  ферментом  носит Рисунок  6.  рН  зависимость  гидролиза  мелиттина  протеиназой  Ulysses.  Степень  гидролиза выражена в процентах от исходного количества мелиттина в реакционной смеси .

по  преимуществу  гидрофобный  характер,  что  согласуется  со  специфичностью  протеиназы Ulysses  по  отношению  к  связям,  образованным  гидрофобными  и  незаряженными аминокислотами .

4.5. Ингибирование гидролиза В-цепи инсулина протеиназой Ulysses пепстатином А .

Пепстатин  является  конкурентным  ингибитором,  моделирующем  переходное состояние  субстрат-ферментного  комплекса.  Он  представляет  собой  пептид,  содержащий необычную  аминокислоту  -  статин.  Большинство  аспартатных  протеиназ,  в  том  числе протеиназа  HIV-1,  достаточно  эффективно  ингибируется  пепстатином  А .

Мы  изучали  ингибирование  пепстатином  А  реакции  гидролиза  В-цепи  инсулина протеиназой  Ulysses.  Исследование  зависимости  степени  ингибировапия  реакции гидролиза  от  концентрации  пепстатина  в  реакционной  смеси,  позволило  определить константу ингибирования  IC50,  равную  72  микромоль.  Таким  образом,  протеиназа  Ulysses проявляет  свойства,  характерные  для  аспартатных  протеиназ .

4.6.Автолиз Аспартатные  протеиназы  ретровирусов  склонны  к  автолизу  -  самопроизвольной каталитической  деградации.  Представлялось  интересным  исследовать  свойства протеиназы  Ulysses  в  отношении  автолиза.  Как  оказалось,  протеиназа  Ulysses  не  является исключением.  Эксперементы  по  автолитическому  расщеплению  проводились  при  рН  7 .

Как  указывалось  ранее,  после  рефолдинга  (рН  7,  4°С)  не  наблюдалось  продуктов  автолиза протеиназы  Ulysses.  Однако,  при  инкубировании  протеиназы  при рН7  и температуре  37°С

Рис.  7.  ВЭЖХ продуктов автолитического расщепления  протеиназы Ulysses .

начинается  процесс  автолиза.  2  часовое  инкубирование  в  этих  условиях  приводит  к  50% расщеплению протеиназы (рис.7) .

Как  и  в  случае  протеиназы  HIV-1  в  первую  очередь  автолизу  подвергаются пептидные  связи,  экспонированные  на  поверхности  белковой  глобулы  (таблица  2) .

Полученные  результаты  в  дальнейшем  были  подтверждены  после  построения  трехмерной модели  фермента .

Таблица 2. Специфичность протеиназы Ulysses при автолизе .

Гидролиз  по  связи  Glu5-Ser6  приводит  к  дестабилизации  системы  водородных связей,  образованных  N-  и  С-концевыми  фрагментами  протеиназы  Ulysses.  Эта  область ответственна  за  стабильность  молекулы  димера.  Гидролиз  связей  Tyr53-Glu54  и  Gly70Arg71,  находящихся  в  области  петли-козырька,  которая  так  же  участвует  в  стабилизации молекулы,  приводит  к  дальнейшей  дестабилизации  межсубъединичных  взаимодействий  и разворачиванию полипептидной цепи белка .

Специфичность  при  автолитическом  гидролизе  соответствует  специфичности фермента  при  гидролизе  полипептидных  субстратов  (мелиттин  и  В-цепь  инсулина) .

Гидролизуются  как  связи  образованные  алифатическими  и  слабозаряженными аминокислотами:  Phe-Tyr,  Tyr-Leu,  Ala-Ser ,  так  и  связи,  содержащие  заряженные аминокислоты:  Glu-Ser,  Gly-Arg,  Asp-Phe.  Следует  отметить,  что  способность  фермента подвергаться  автолизу,  может  являться  одним  из  способов  регуляции  его  активности  в клетке .

5. Построение трехмерной модели протеиназы Ulysses .

Знание  о  трехмерных  координатах  белка,  а  в  особенности  фермента,  дают возможность  объяснить  многие  его  физико-химические  свойства:  субстратную специфичность,  чувствительность  к  ингибиторам,  устойчивость  к  денатурирующим агентам,  способность  к  автолизу  и.т.д.  Для  определения  трехмерных  координат используются  методы  рентгеноструктурного  анализа  и  ЯМР.  Эти  методы  являются достаточно  трудоемкими  и  требуют  больших  концентраций  и  количеств  белка,  что  не всегда  возможно  достигнуть  как  из-за  низкой  растворимости  белка,  так  и  из-за  низкой стабильности  фермента.  В  связи  с  этим,  в  последнее  время  широкое  применение  нашел метод  гомологичного  моделирования,  позволяющий  построить  пространственную структуру  белка  с  использованием  известных  координат  гомологичных  белков .

Предварительно  были  получены  некоторые  дополнительные  физико-химические характеристики  структуры  белка,  в  частности  сняты  спектры  флуоресценции  и  кругового оптического  дихроизма.  Дополнительные  экспериментальные  данные  о  структуре  белка могли  помочь в  построении модели .

5.1. Моделирование трехмерной структуры .

Расчет  элементов  вторичной  структуры  протеиназы  Ulysses  был  проведен  с помощью  программы  PSIPRED.  Большая  часть  структуры  представлена  в  виде  бетаструктуры  (80%),  количество  альфа-  спиральных  участков  составляет  20  %.  Полученные данные  свидетельствует о  наличии  2  участков  с  альфа-структурной  организацией.  Остатки 100-107,  соответствуют  альфа-спирали  С2,  характерной  для  всех  ретровирусных аспартатных  протеиназ.  Второй  участок,  (остатки  37-47),  по-видимому  соответствует структурному  элементу  спирали  С1  -  элементу,  широко  представленному  у  аспартатных протеиназ  высших  организмов,  но  отсутствующему  у  ретровирусных  аспартатных протеиназ  (единственным  исключением  является  протеиназа  вируса  инфекционной анемии  лошади  -  EIAV).  В  связи  с  этим,  для  выравнивания  аминокислотных последовательностей  и  последующего  построения  трехмерной  модели  в  качестве шаблонных  структур  были  взяты:  протеиназа  HIV-1  (файл  1а94),  протеиназа  вируса инфекционной  анемии  лошади  (файл  2fmb),  протеиназа  вируса  иммунного  дефицита обезьяны  (файл  lsiv),  протеиназа  вируса  иммунного  дефицита  кошки  (файл  1Ы1)  и протеиназа вируса саркомы Роуза (файл  Ibai) .

Ретровирусные  аспартатные  протеиназы  имеют  низкую  степень  гомологии  (30Наиболее  консервативными  являются  области  активных  центров  и  С-концевых частей  молекулы.  Выравнивание  аминокислотных  последовательностей,  выполненное программой  ClustalW,  было  скорректировано,  исходя  из  представления  о  «темплетных областях»  аспартатных  протеиназ  (Андреева,  1992).  Результат  выравнивания  представлен на рисунке 8 .

Модель  была  построена  методом  гомологичного  моделирования.  За  основу  были взяты  результаты  выравнивания  аминокислотной  последовательности  протеиназы  Ulysses и  последовательностей  шаблонных  структур.  Полученная  модель  представлена  на  рисунке 9.  Представлены  все  элементы  структуры,  характерные  для  ретровирусных  аспартатных протеиназ,  за  исключением  спирали  С1,  которая  была  смоделирована,  исходя  из  данных по  предсказанию  вторичной  структуры .

Рис.8  Сравнение  аминокислотных  последовательностей  аспартатных  протеиназ.  SIV  протеиназа вируса  иммунного  дефицита обезьяны,  HIV1  -  протеиназа  HIV-1,  FIVa  -  протеиназа вируса иммунного дефицита кошки.  RSV -  протеиназа вируса саркомы  Роуза EIAV  -  протеиназа вируса инфекционной анемии лошади, D.VIR — протеиназа Ulysses .



Рис  9  Трехмерная  модель  протеиназы  Ulysses.  Показана  основная  цепь  молекулы,  выделены каталитически  активные  остатки  аспарагиновой  кислоты  27(27') 5.2. Молекулярно-динамическое моделирование пространственной структуры молекулы протеиназы Ulysses .

Метод  гомологичного  моделирования,  при  всех  достоинствах,  имеет  один существенный  недостаток:  невозможность  проследить  поведение  модели  во  времени  и проверить  ее  стабильность  Для  решения  поставленной  задачи,  нами  был  выбран  метод молекулярной  динамики  (МД),  позволяющий  анализировать  поведение  молекулы биополимера в условиях,  наиболее приближенных  к  реальным .

В  качестве  поля  потенциальной  энергии  нами  было  выбрано  поле  CHARMM,  а  в качестве программы для его реализации - одноименный  программный  комплекс Молекула  протеиназы  Ulysses,  полученная  после  моделирования,  была сольватированна  (добавлены  молекулы  растворителя  и  ионы)  при  помощи  программы SOLVATE.  Прежде  чем  начать  молекулярно-динамический  эксперимент,  необходимо было  провести  минимизацию  энергии.  Минимизация  была  проведена  методом коньюгированного  градиента с  числом  шагов  равным  2000 .

Уравновешивание  структуры  проводилось  в  несколько  этапов.  Вначале  была проведена молекулярная  динамика с  фиксированной  молекулой  белка,  когда  подвижными являлись только молекулы воды и ионов, затем фиксирующие потенциалы были убраны,  и было  проведено  окончательное  уравновешивание  системы  в  течение  100  пикосекунд  с шагом 1 фс .

Окончательный  запуск  молекулярной  динамики  проводился  в  течение  1 наносекунды  с  шагом  1  фемптосекунды.  За  поведением  системы  следили  по  изменению потенциальной  энергии  системы  от  времен  (Рис.10).  Из  графика видно,  что  полученная модель сохраняет стабильность в течение длительного  (1  не)  промежутка времени .

–  –  –

Для  проведения  дальнейших  исследований  была взята средняя  структура протеиназы Ulysses .

5.3. Анализ третичной структуры .

Трехмерные  структуры  аспартатных  протеиназ  в  значительной  степени  схожи .

Можно  выделить  ряд  элементов  третичной,  структуры  характерных  для  всех представителей  данного  класса  ферментов  (Рис.11).  Как  уже  указывалось  ранее, аспартатные  протеиназы  ретровирусов  представляют  собой  гомодимер,  образованный  из двух  идентичных  субъединиц,  не  связанных  между  собой  ковалентно.  Мономер  состоит из  четырех  основных  элементов:  шпильки,  содержащей  петлю  А1,  широкой  петли  В1 .

содержащей  каталитический  остаток  аспарагиновой  кислоты,  спирали  С1  и  второй шпильки  D1.  Второй  мономер  содержит идентичные  элементы,  называемые А2,  В2,  С2  и D2.  В  целом,  модель  протеиназы  Ulysses  не  имеет  явных  отличий  от  известных ретровирусных  аспартатных  протеиназ, за исключение дополнительной  альфа спирали  С1 .

Как  уже  отмечалось,  спираль  С1,  характерная  только  для  структуры  протеиназы  EIAV, среди  ретровирусных  протеиназ,  была добавлена при  моделировании.  Спираль  оставалась стабильной  на  протяжении  всех  экспериментов  по  молекулярной  динамике,  что  может указывать  на то,  что  включение ее в  модельную  структуру было  корректным .

5.4.Междоменный  лой .

с Чрезвычайно  важны  для  сохранения  стабильности  и  функциональной  активности молекулы  аминокислотные  остатки,  участвующие  в  образовании  междоменного  слоя .

Исходя из  полученных  нами данных,  их можно разбить  на три  группы:

1)  Аминокислотные  остатки,  N-  и  С-концевой  части  молекулы,  образующие четырехтяжевый  антипарралельный  бетта-слой.  В  молекуле  протеиназы  Ulysses  в  его образовании  участвуют  аминокислотные  остатки  1-6  и  109-]  13.  Эта  часть  междоменного слоя  стабилизирована за  счет образования  водородных  связей  между  атомами  кислорода  и азота пептидной связи,  что характерно для  бетта-структуры.  (  Рис  12-1) 2)  Аминокислотные  остатки,  расположенные  в  области  петли-козырька:  Gln95,  азот пептидной  связи,  которого  образует  водородную  связь  с  кислородом  Gly63  второго мономера;  азот  пептидной  связи  А1а64,  образующий  водородную  связь  с  кислородом пептидной  связи  остатка  А1а64  другого  мономера;  Кислород  пептидной  связи  остатка Arg66,  взаимодействует  с  азотом  боковой  группы  Asn65  другого  мономера,  образуя устойчивую  водородную  связь  (  Рис  12-2) 3)  Аминокислотные остатки,  примыкающие  к области  активного  центра,  и  участвующие  в образовании  разветвленной  сети  водородных  связей,  известной  так  же  как  «fireman  grip» .

В  образовании  водородных  связей  участвуют:  OD1  кислород  остатка  Asp27, взаимодействующий  с  азотом  Thr28  другого  мономера,  OD2  кислород  остатка  Asp27, взаимодействующий  с  OD1  кислородом  остатка  Asp27  второго  мономера;  гидроксильная группа  Thr26  образует  водородную  связь  с  кислородом  пептидной  связи  Leu26  другого мономера, то же справедливо и для второго мономера.  (Рис. 12-3) Рис. 12 Междоменные взаимодействия в молекуле  протеиназы Ulysses .

1- аминокислотные остатки, N- и С-концевой части  молекулы, образующие ч еты рехтяжевы й антипарралельный  беттаслой .

2- Аминокислотные остатки, расположенные в области  петли-козырька 3  -Аминокислотные остатки, примыкающие к области активного центра, и учавствующие в образовании разветвленной  сети водородных  связей, известной так же как «fireman grip» .

5.5. Анализ карманов связывания протеиназы Ulysses .

Анализ  карманов  связывания  протеиназы  Ulysses  и  сравнение  их  с  карманами связывания  протеиназы  HIV-1  позволил  выявить  ряд  особенностей,  способных  объяснить широкую  специфичность  протеиназы  Ulysses .

  Во-первых,  карманы  связывания протеиназы  Ulysses  более  глубокие  по-сравнению  с  карманами  связывания  протеиназы HIV-1,  что  способствует  связыванию  и  гидролизу  субстратов,  содержащих  аминокислоты с  разветвленными  боковыми  цепями,  в  том  числе  и  заряженными.  Во-вторых,  карманы связывания  S1  и  S2  протеиназы  Ulysses  содержат  отрицательно  заряженные  остатки глутаминовой  и  аспарагиновой  кислот,  что  дает  возможность  предполагать  наличие ионных  пар  при  образовании  субстрат-связывающего  комплекса  и  частично  объясняет специфичность  протеиназы  Ulysses  по  отношению  к  связям,  образованным  положительно заряженными  аминокислотами  (рис.13).  Карманы  связывания  протеиназы  HIV-1  не содержат  заряженных  аминокислот,  это  объясняет тот  факт,  что  она  не  гидролизует  связи, содержащие  заряженные  аминокислоты .

Рис.13  Схематическое  изображение  карманов  связывания  протеиназы  Ulysses  при  гидролизе  связи Lys-Arg .

Способность  протеиназы  Ulysses  гидролизовать  связи,  образованные  отрицательнозаряженными  аминокислотами,  можно  объяснить  глубиной  карманов  связывания, позволяющим  свободно  двигаться  отрицательно-заряженным  боковым  цепям  субстрата  в положении  Р1,  не  встречая  наталкивания  со  стороны  отрицательно  заряженных  остатков Glu96 и Met62 .

5.6.Спектр флуоресценции .

Максимум  спектра  флуоресценции  протеиназы  Ulysses  составил  350  нм  (рис.14) .

Димер  протеиназы  Ulysses  содержит  восемь  остатков  тирозина  и  четыре  остатка триптофана.  Основной вклад в спектр флуоресценции вносят остатки триптофана, т.к. они имеют  более  широкую  область  поглощения.  Форма  спектра  свидетельствует  о  наличии двух  популяций  остатков  триптофана,  это Тгр 48  (Тгр 48')  и  Тгр  104  (Тгр  104').  Исходя из данных  по  выравниванию  аминокислотных  последовательностей  протеиназы  Ulysses  и известных  ретровирусных  аспартатных  протеиназ,  а  так  же  полученных  ранее  данных молекулярного  моделирования,  можно  предположить,  что  Тгр  48  (48')  находятся  на поверхности  молекулы  и  должны  в  большей  степени  влиять  на  спектр  флуоресценции .

Остатки  Тгр  104  (104')  повернуты  внутрь  белковой  глобулы  и,  соответственно,  должны оказывать  минимальное  влияние  на  интенсивность  и  характер  флуоресценции.  В  тоже время,  асимметрия  спектра  флуоресценции  свидетельствует  о  том,  что  они  вносят  вклад в суммарную  флуоресценцию  молекулы.  Это  может  быть  вызвано  тем,  что  молекула протеиназы  Ulysses  является  нековалентным  гомодимером.  Мономеры  находятся  в состоянии  динамического  равновесия  с  молекулой  димера.  Таким  образом,  определенная часть  молекул  находится  в  диссоциированном  состоянии,  при  этом  остатки  Тгр  104  (104') экспонированы  к растворителю,  и таким образом влияют на  спектр  флуоресценции .

Рис.14  Спектр флуоресценции протеиназы Ulysses .

Кроме  того,  получены  спектры  флуоресценции  протеиназы  Ulysses  в  комплексе  с пепстатином,  который  полностью  совпадает  со  спектром  свободного  фермента.  Раннее, при  исследовании  протеиназы  HIV-1  (Джудит  Фиди  и  авторы),  было  показано  что связывание  пепстатина  не  влияет  на  спектр  флуоресценции  фермента.  Это  связано,  повидимому,  с  тем,  что  полярное  окружение  остатков  триптофана  в  молекуле  протеиназы HIV-1  слабо  меняется  при  связывании  пепстатина,  что  в  свою  очередь,  находит  свое отражении  в  неизменности  спектра  флуоресценции.  Учитывая  отсутствие  влияния связывания  пепстатина  на  спектр  флуоресценции  в  обоих  случаях,  можно  сделать заключение  о  сходстве  пространственной  конфигурации  протеиназы  HIV-1  и  протеиназы Ulysses  в  области  активного  центра .

5.7. Круговой оптический дихроизм (КД) Вторичная  структура  белка  может  быть  определена  при  помощи  КД  спектрометрии .

Измерения  проводят  в  дальней  УФ  области  (190-250  нм).  В  этом  диапазоне  длин  волн хромофором  является  пептидная  связь,  возникновение  сигнала  происходит  в  том  случае .

если  белок  свернут  в  регулярную  структуру.  КД  спектр  протеиназы  Ulysses  представлен на рисунке  15 .

Состав  элементов  вторичной  структуры  протеиназы  Ulysses,  определенных  из спектров КД (интервал  1  нм) можно представить следующим образом:

Рис.15 Спектр КД протеиназы Ulysses .

Полученные  результаты  хорошо  согласуется  с  данными  по  предсказанию  вторичной структуры:  20  %  альфа-спирали  и  80  %  бетта-структуры.  Количество  областей  с  альфаспиральной  организацией  у  протеиназы  Ulysses,  как  по  данным  КД  так  и  по  данным теоретических  расчетов,  оказывается  большим,  чем  у  большинства  ретровирусных аспартатных  протеиназ,  например  у  протеиназы  HIV-1.  Это  вызвано,  по-видимому, наличием  двух  областей  с  альфа-структурной  организацией:  С2,  характерной  для  всех представителей  этого  класса  ферментов  и  С1-  альфа  спирали,  представленной  только  у протеиназы  E1AV .

Выводы 1.  На основе сравнительного анализа продукта трансляции гена ретротранспозона Ulysses (Drosophila virilis) и первичных структур известных ретровирусных аспартатных  протеиназ  определены фланкирующие  последовательности протеин&зы  Ulysses .

2.  Клонированием и экспрессией гена протеиназы ретротранспозона  Ulysses в E.coli впервые  получен  кодируемый  им белок,  обладающий  протеолитической активностью .

3.  Исследованы  физико-химические свойства протеиназы  Ulysses,  в том числе  ее устойчивость при автолизе,  а также специфичность при  гидролизе пептидных субстратов и проведено сравнение с протеиназой HIV-1. Показано, что протеиназа ретротранспозона  Ulysses  обладает  широкой  специфичностью  (гидролизует  связи, образованные карбоксильными  группами гидрофобных и заряженных аминокислот).  Оптимум рН действия равен 5.5 .

4.  Методом  молекулярного моделирования построена пространственная модель протеиназы Ulysses, согласующаяся с экспериментальными данными по спектрам флуоресценции  и  КД и  результатам  автолиза .

Основные результаты диссертации изложены  в следующих публикациях:

1.  Волков Д.А.,  Дергоусова Н.И.  Савватеева Л.В.,  Евгеньев  М.Б,  Румш Л.Д.,  Андреева Н.С.  Аспартатные  протеиназы  из  транспозона  Drosophila  virilis.  V  Симп.  «Химия протеолитических  ферментов».  Посвящ.  75-летию  со  дня  рождения  чл.корр.  РАН В.К.Антонова.  Москва,  22-24  апр.  2002  г.  Тезисы докл.  и стенд.сообщ,- С.47 2.  Волков  Д.А.,  Дергоусова Н.И.  Савватеева  Л.В.,  Румш  Л.Д.  Аспартатная  протеиназа ретротранспозона  Ulysess  (Drosophila  virilis).  Вопросы  мед.  Химиии.2002,48(6), с.533-560 3.  Volkov  DA,  Dergousova  N1,  Rumsh  LD.  "New  Aspartic  Proteinase  of  Ulysses Retrotransposone  From  Drosophila  Virilis".  Int.  Aspartic  Proteinase  and  Inhibitors Conf.  "ICAPI  03", Kioto,  Japan.  November  14-16,  2003  Abstr.G35 4.  Волков  Д.А.,  Дергоусова  Н.И.,  Румш  Л.Д.  Новая  аспартатная  протеиназа  из ретротраспозона Ulysess (Drosophila virilis).  Биохимия. - 2004, 69(6), с.856-861 .

–  –  –






Похожие работы:

«Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "СИБИРСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ" Институт нефти и газа кафедра "Бурение нефтяных и газовых скважин" УТВЕРЖДАЮ Заведующий кафедро...»

«УДК 541.64 Г. Ж. Елигбаева, канд. хим. наук, доц., КазНТУ ПОЛИАМФОЛИТНЫЕ ГИДРОГЕЛИ СОПОЛИМЕРОВ ВИНИЛОВОГО ЭФИРА МОНОЭТАНОЛАМИНА И АКРИЛАТА НАТРИЯ В РЕАКЦИЯХ КОМПЛЕКСООБРАЗОВАНИЯ С ИОНАМИ МЕДИ И ПОВЕРХНОСТНО–АКТИВНЫМИ ВЕЩЕСТВАМИ Келтірілген жмыста моноэтаноламинні винил эфирі...»

«и экологии МИНИСТЕРСТВО ПРИРОДНЫХ РЕСУРСОВ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральная служба по гидрометеорологии и мониторингу окружающей среды (Росгидромет) РД РУКОВОДЯЩИЙ ДОКУМЕНТ 52.24.533МАССОВАЯ КОНЦЕНТРАЦИЯ ФТОРИДОВ В ВОДАХ Методика измерений фотометрическим методом с лантан-ализаринкомплексоном в присутствии ацето...»

«Департамент образования, науки и молодежной политики Воронежской области государственное бюджетное профессиональное образовательное учреждение Воронежской области "БОРИСОГЛЕБСКИЙ ДОРОЖНЫЙ ТЕХНИКУМ" (ГБПОУ ВО "БДТ") ПРИКАЗ "29" мая 2018 года № 58 "Об установлении разме...»

«Сибирский центр климато-экологических систем и образования УДК 57.045 УТВЕРЖДАЮ Директор, д.ф.м.н., профессор Гордов Е.П. "" _ 2007 г. ОТЧЕТ О НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОЙ РАБОТЕ Моделирование углеродного баланса болотных экосистем южной тайги при различных сценариях изменения климата Государственный контракт № 02.517.11.901...»

«Лекция №14. Популяционная динамика Лекцию читает Петр Валентинович Турчин – один из сильнейших специалистов в мире по популяционной динамике, преподаватель Коннектикутского университета. Данная лекция состоит из 3 лекций курса общей экологии, преподаваемого Турчиным, относ...»

«ГЕНЕТИКА И РАЗВЕДЕНИЕ ЖИВОТНЫХ 2/2017 УДК 617.577:619 Е. А. Репина К вопросу о болезнях конечностей. Скрытые причины (обзор) Аннотация. На современном этапе развития молочного животноводства как и во всем мире, так и в Российской Федерации проблема болезне...»




 
2019 www.mash.dobrota.biz - «Бесплатная электронная библиотека - онлайн публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.