WWW.MASH.DOBROTA.BIZ
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - онлайн публикации
 

«Федорова Ольга Андреевна РОЛЬ ПРОТЕАСОМ И ИХ СУБЪЕДИНИЦ -ТИПА В ГИДРОЛИЗЕ РНК И СПЛАЙСИНГЕ ...»

На правах рукописи

Федорова

Ольга Андреевна

РОЛЬ ПРОТЕАСОМ И ИХ СУБЪЕДИНИЦ -ТИПА В ГИДРОЛИЗЕ РНК И

СПЛАЙСИНГЕ

03.01.03. – молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Санкт-Петербург

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки

Институт цитологии Российской академии наук

Научный руководитель: Барлев Николай Анатольевич, доктор биологических наук Институт цитологии РАН, заведующий лабораторией

Официальные оппоненты: Корнилова Елена Сергеевна, доктор биологических наук, профессор Институт цитологии РАН, заведующий лабораторией Трибулович Вячеслав Генрихович, кандидат химических наук НИИ гриппа РАМН, старший научный сотрудник Санкт-Петербургский государственный университет,

Ведущая организация:

биолого-почвенный факультет

Защита диссертации состоится «25» мая 2012 года в 14 часов на заседании

Диссертационного совета Д.002.230.01 на базе Института цитологии РАН по адресу:

194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий проспект, д. 4 e-mail: cellbio@mail.cytspb.rssi.ru Cайт: http://www.cytspb.rssi.ru Факс: 8(812) 297-35-41



С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН .

Автореферат разослан «___» апреля 2012 года

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук Е.В.Каминская

1.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1 Актуальность проблемы Протеасома – это мультисубъединичный белковый комплекс, одна из главных задач которого в клетке состоит в направленной и специфической деградации белков. Изучение роли протеасом в различных клеточных процессах приобретает все большую актуальность в связи с многочисленными экспериментальными данными об их участии в процессах раковой трансформации, старения и нейродегенерации. Модуляция активности протеасом влияет на клеточные процессы, такие как транскрипция, прохождение по клеточному циклу, репарация ДНК, дифференцировка, развитие, иммунный ответ (Wojcik et al., 2000; Pajonk, McBride, 2001; Glickman, Ciechanover, 2002; Collins, Tansey, 2006; Maupin-Furlow et al., 2006; Reed, 2006; Sikder et al., 2006; Ferdous et al., 2007) .

Под термином протеасома или 26S протеасома обычно подразумевают белковый комплекс, состоящий из 20S корового комплекса (CP или 20S протеасома) и 19S регуляторного комплекса (RP, также известного как 19S протеасома или PA700) (Groll et al., 2005; Nickell et al., 2009). Коровый комплекс является каталитическим центром 26S протеасомы и представляет собой полый цилиндр, состоящий из четырех гептамерных колец. Каждое кольцо образуется семью гомологичными, но не одинаковыми субъединицами. Два внешних кольца состоят из семи -субъединиц (1-7) и формируют “ворота”, через которые входят субстраты и высвобождаются продукты. “Ворота” корового комплекса ограничивают размер субстрата, который способен проникать внутрь протеолитической камеры. Два внутренних кольца образованы семью -субъединицами (1Lupas and Baumeister, 1997; Voges et al., 1999). Известно, что субъединицы 1(Y), 2(Z), 5(X) обладают каспазо-, трипсино- и химотрипсиноподобной активностью, соответственно (Heinemeyer et al., 1997) .



Наиболее известной функцией протеасом является убиквитин-зависимый протеолиз белков, однако в начале 1990-х годов впервые было показано, что протеасома способна расщеплять некоторые белки без предварительного убиквитинилирования. Эксперименты показали, что к таким белкам относятся: c-Jun (Jariel-Encontre et al., 1995), кальмодулин (Tarcsa et al., 2000), тропонин С (Benaroudj et al., 2001), ингибитор циклин-зависимых киназ p21Cip1 (Sheaff et al., 2000), опухолевый супрессор p53 (Asher et al., 2002) .

Более детальное изучение этого процесса показало, что такие белки как кристаллин В (Boelens et al., 2001), ингибитор циклин-зависимых киназ p21 (Touitou et al., 2001), коактиватор стероидного рецептора (SRC-3) (Yi et al., 2008) и опухолевый супрессор Rb (Sdek et al., 2005) деградируют без предварительного убиквитинилирования через связывание с субъединицей 7 .

В 1989 году впервые было показано, что протеасомы обладают эндорибонуклеазной активностью (Tsukahara et al., 1989). Дальнейшие исследования доказали, что 20S протеасомы, выделенные из подсолнечника, были способны расщеплять РНК вируса табачной мозаики и вируса мозаики салата (Ballut et al., 2003). Далее было показано, что РНКазной активностью обладают также 26S протеасомы, выделенные из клеток линий человека А431 и К562, при этом субстратом для расщепления могут быть различные РНК эукариот – как рибосомные, так и специфические информационные (Евтеева и др., 2000;

Миттенберг и др., 2002; Kulichkova et al, 2010). Установлено также, что протеасомы сами содержат низкомолекулярные РНК, которые формируют гетерогенную популяцию молекул с длиной от 20 до 120 нуклеотидов (Pamnani et al., 1994; Schmid et al., 1995). Однако происхождение и природа этих РНК до конца не известна .

Регуляция протеолитических и эндорибонуклеазных функций протеасом может осуществляться с помощью дополнительных белков, которые ассоциированы с протеасомами. Недавние исследования показали, что существует ряд дополнительных белков, которые связаны с 26S протеасомами (Verma et al., 2000; Wang et al., 2007). Эти белки могут быть условно разделены на две группы: факторы, относящиеся к системе убиквитинилирования, и белки, которые регулируют функции протеасом. К первой группе белков относятся деубиквитинилирующие ферменты (USP14 и Uch37) (Demartino and Gillette, 2007), E3 лигазы (Hul5/KIAA10, E6AP и Parkin), а также некоторые E2 лигазы (Ubc 1, 2, 3, 4 и 5) (Demartino and Gillette, 2007). Функции белков, относящихся ко второй группе, более сложно определить. К примеру, удалось показать, что с 26S протеасомой, выделенной из коры головного мозга крыс, связываются белки семейства 14-3-3 (gamma и zeta/delta) (Tai et al., 2010). Белки 14-3-3 участвуют в различных процессах, включая регуляцию клеточного цикла, контроль за метаболизмом, апоптоз и транскрипцию генов (Fu et al. 2000, Aitken 2006, Hermeking and Benzinger 2006). Существует множество других белков, которые связаны с протеасомами, таких как p28/gankirin, Rpn14, p27 и S5b. Некоторые из них, предположительно, отвечают за регуляцию 26S протеасом или сброку корового комплекса с регуляторными субъединицами (Tanaka, 2009). Однако функциональная значимость этого связывания неоднозначна и требует дальнейшего изучения .





В связи с тем, что ферментативные активности протеасом отличаются в раковых клетках от нормальных, приобретает особую значимость изучение механизмов регуляции специфических активностей протеасом, в частности через белок-белковые взаимодействия .

Эти данные могут в дальнейшем позволить обнаружить новые ингибиторы активностей протеасом, как протеолитических, так и неканонических, в качестве возможных противораковых препаратов. Соответственно, учитывая данные о наличии эндорибонуклеазной активности у протеасом и их ассоциации с низкомолекулярными РНК и белками сплайсинга, представляет интерес как определение спектра белков, связывающихся с коровым протеасомным комплексом, так и изучение влияния протеасом на метаболизм РНК .

1.2 Цели и задачи работы Целью данной работы является изучение роли протеасом и их отдельных субъединиц в расщеплении РНК и сплайсинге .

Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:

1. Проверка наличия РНКазной активности и ее сравнение у рекомбинантных белков субъединиц альфа-типа 20S протеасомы .

2. Определение спектра белков, способных связываться с 20S протеасомой (субъединица 7) .

3. Изучение участия протеасом в альтернативном сплайсинге .

1.3 Основные положения, выносимые на защиту

1. Рекомбинантные субъединицы 1, 2, 3, 4, 5 и 7 20S корового комплекса обладают РНКазной активностью .

2. РНКазная активность 1, 2, 3, 4, 5 и 7 20S корового комплекса зависит от присутствия ионов Ca2+ и Mg2+ .

3. Рекомбинантная субъединица 7 (PSMA3) 20S протеасомы способна связываться с белками, участвующими в различных клеточных процессах: транскрипция, трансляция, репарация ДНК, сплайсинг .

4. Протеасомы участвуют в регуляции альтернативного сплайсинга in vitro гена SMN1, при этом протеолитические активности 20S протеасом не критичны для подавления сплайсинга .

1.4 Научная новизна полученных результатов В данной работе был впервые определен спектр белков, способных связываться с PSMA3 (7) корового комплекса. Были идентифицированы как цитоплазматические, так и ядерные белки, ассоциированные с субъединицей 7, которые отвечают за важные клеточные процессы: транскрипцию, трансляцию, репарацию ДНК и сплайсинг .

Удалось показать, что субъединицы альфа-типа корового комплекса протеасом обладают регулируемыми РНКазными активностями. Впервые показано, что 20S протеасома участвует в альтернативном сплайсинге. Таким образом, в данной работе впервые установлена роль субъединиц альфа-типа протеасом в метаболизме РНК .

1.5 Теоретическое и практическое значение работы Внимание большинства исследователей сосредоточено на роли протеасом в убиквитин-зависимом протеолизе, однако другие функции остаются малоизученными .

Полученные результаты имеют фундаментальное значение для определения роли протеасом в сплайсинге и расщеплении РНК. Кроме того, изучение роли протеасом в альтернативном сплайсинге гена SMN1 имеет практическое значение для лечения спинальной мышечной дистрофии .

1.6 Апробация работы Материалы диссертации были представлены на Политехнических симпозиумах «Молодые учёные – промышленности Северо-Западного региона» 2009 и 2010 года (СанктПетербург), Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2009» (Москва, 2009), 13-й Международной Пущинской школы-конференции молодых учёных «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2009), 34-м и 35-м конгрессах Европейского биохимического сообщества (Прага, 2009; Гётеборг, 2010), 2-й конференции молодых учёных ИНЦ РАН (Санкт-Петербург, 2010), VI конференции «Фундаментальная онкология – Петровские чтения» (Санкт-Петербург, 2010) .

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них 4 статьи в рецензируемых журналах .

1.7 Объем и структура диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего ___ источников. Диссертация изложена на ___ страницах машинописного текста. Иллюстративный материал содержит ___ схем, ___ рисунков, и ___ таблиц .

1.8 Финансовая поддержка работы Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ (проекты №08-04-00834 и №10-04-01234), Программы Президиума РАН “Молекулярная и клеточная биология”, ФЦНТП “Научные и научно-педагогические кадры инновационной России” на 2009-2013 годы ГК No. 16.740.11.0366 и ФЦНТП “Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы” ГК No.16.512.11.2242

1.9 Личный вклад автора Идентификация белков, ассоциированных с рекомбинантным белком GST-7, была осуществлена с помощью метода масс-спектрометрии совместно с Андрю Боттриллом в отделе биохимии (Университет Лестера, Англия). Влияние протеасом на сплайсинг in vitro было определено в совместных исследованиях с Т.Н.Моисеевой и Ианом Эпероном в отделе биохимии (Университет Лестера, Англия) .

Лично автором были получены экспрессионные вектора, содержащие гены субъединиц 1, 2, 3, 4, 5 и 7, подобраны оптимальные условия синтеза и очистки рекомбинантных белков. Автором также проведены исследования наличия РНКазной активности у субъединиц 1, 2, 3, 4, 5 и 7 протеасом человека. GST-pulldown и двухмерный электрофорез ассоциированных с субъединицей 7 белков были проведены также лично автором. Лично автором проведен иммуноблот анализ для подтверждения связывания белков, участвующих в сплайсинге, с субъединицей 7 .

Материалы, вошедшие в данную работу, обсуждались и публиковались совместно с соавторами и научным руководителем .

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Клеточные культуры Клетки проэритролейкемии человека линии К562 (Lozzio, Lozzio, 1975), полученные из Российской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН), культивировали в среде RPMI 1640, содержащей 10 % эмбриональной телячьей сыворотки в атмосфере 5 % СО2 при температуре 37 °С .

2.2 Создание экспрессионных векторов, экспрессия и очистка белков Последовательности кДНК протеасомных субъединиц -типа (1, 2, 3, 4, 5, 7) были получены методом ОТ-ПЦР из тотальной мРНК клеток человека линии K562 .

Полученные продукты ПЦР были клонированы в экпрессионный вектор pGEX-5X-1, линеаризованный BamHI, для последующей экспрессии химерных белков. Экспрессию белков осуществляли в клетках E.coli BL21 при 37 °С в присутствии 1 мМ изопропил-бетаD-тиогалактопиранозида (ИПТГ). Очистку белка проводили методом афинной хроматографии на глутатион-сефарозе (GE Health Care, США) .

2.3. Транскрипция in vitro Транскрипцию 3’-нетранслируемой области мРНК c-myc проводили с использованием [- Р] ЦТФ и РНК полимеразы фага SP6, мРНК р53 синтезировали в присутствии [- Р] ЦТФ и Т3 РНК полимеразы .

2.4 Обработка РНК с помощью химерных белков РНК инкубировали с 26S протеасомными комплексами в буферном растворе, содержащем 20 мМ HEPES-NaOH, pH 7.6, 50 мМ КСl, 0.1 мМ ЭДТА, 10 % глицерина, 0.5 мМ PMSF, 2 мM DTT, 1 мМ АТФ в течение 30 мин при температуре 37 °С. При необходимости в реакционную смесь добавляли MgCl2 или CaCl2 .

РНК выделяли методом фенольно-термического фракционирования (Георгиев и Мантьева, 1962) .

2.4 Электрофорез РНК в денатурирующих условиях Электрофорез проводили в 5%-ном акриламидном геле в трис-боратном буфере (90 мМ Трис-борат, 2 мМ ЭДТА, рН 8.3) в присутствии 7 М мочевины. Препараты радиоактивно меченных РНК разделяли в приборе для высоковольтного электрофореза фирмы Hoefer (США). Гель сушили на стекле, а затем экспонировали с рентгеновской пленкой Kodak XOmat K (США) .

2.5 Получение клеточного экстракта Для получения клеточного экстракта 2107 клеток линии К562 промывали холодным PBS и лизировали в буфере (50 мМ Tris-HCl (pH 8.0), 150 мМ NaCl, 1% Triton X-100 и protease inhibitor cocktail (Roche)) в течение 30 мин на +4 °C. Затем клетки осаждали центрифугированием в течение 30 мин при 20,000g и 4 °C. Ядерный и цитоплазматический клеточные экстракты были получены с помощью метода Dignam and Roeder (Dignam et al., 1983) .

2.6 Метод GST-pulldown Для анализа белков, способных связываться с субъединицей 7 протеасом человека, был использован метод GST-pulldown. Клеточные экстракты были преинкубированы с 50 мкг GST, иммобилизованном на 50 мкл глутатион-сефарозе (Amersham), в течение 2 ч при 4 °C. Преинкубированный клеточный экстракт затем инкубировали с 50 мкг GST-alpha7 или 100 мкг GST, иммобилизованных на 50 мкл глутатион-сефарозе, в течение 4 ч при 4 °C .

Сефарозу промывали 5 раз PBS от несвязавшихся белков. Комплексы белков с GST или GSTalpha7 элюировали с помощью буфера (125 мМ Tris-HCl (pH 6.8), 4% SDS, 0.1% бромфеноловый синий, 20% глицерин, 200 мМ DTT) и анализировали с помощью электрофореза .

2.7 SDS-электрофорез и иммуноблот анализ Белки разделяли в 12 %-ном полиакриамидном геле в присутствии SDS (Laemmli,

1970) и переносили на мембрану PVDF по стандартной методике (Towbin et al., 1979) .

Использовали антитела к -PSMA1, PSMA3, и Rpn2 фирмы Biomol (UK) и -hnRNPA2/B1, Ddx5 фирмы Santa Cruz (USA). Белки выявляли методом усиленной хемилюминесценции (ECL) с помощью SuperSignal system (Pierce) согласно рекомендациям производителя .

2.8 Двухмерный электрофорез белков Белки, ассоциированные с GST и GST-7, были разделены с помощью двухмерного электрофореза с использованием установки GE Healthcare IPGphor Ettan 2D-system согласно инструкциям фирмы-изготовителя (GE Healthcare Bio-Sciences Inc., США). Электрофорез во втором направлении проводили в 12 %-ном ПААГ в стандартной системе Лэммли (Laemmli, 1970). Белки визуализировали при помощи окрашивания Coomassie .

2.9 Масс-спектрометрия Пятна, содержащие белки, были вырезаны из геля, отмыты от Coomassie и подвергнуты трипсинолизу с помощью автомата Multiprobe II Plus EX (Perkin Elmer, Великобритания). Масс-спектрометрии (MS) предшествовала жидкостная хроматография (LC) на обращенно-фазовой колонке, содержащей матрикс Acclaim PepMap (Dionex, Великобритания), с последующим элюированием на обращенно-фазовой колонке Waters Symmetry C18 100Е (Waters, Великобритания). Анализ полученных фракций проводился с помощью масс-спектрометра 4000 Q-Trap (Applied Biosystems, Великобритания). В результате получали спектр ионов, который обрабатывали, используя поисковую программу MASCOT49 и базы данных UniProtKB/Swiss-Prot50. Рассматривались белки, для которых было обнаружено 3 и более пептидов с p 0.05 .

2.10 Сплайсинг in vitro Пре-мРНК гена SMN1, соответствующая 7-му экзону, была транскрибирована с использованием T7 РНК полимеразы в присутствии [- Р] ГТФ. Продукт траснкрипции был очищен с помощью гель-электрофореза от несвязавшихся нуклеотидов и элюирован в течение ночи при 4 °C в TE буфере, содержащем 0.2 % SDS и 0.5M ацетат натрия. Сплайсинг in vitro осуществляли при 30 °C в 40 %-ном ядерном экстракте с добавлением 1.5 мМ ATP, 20 мМ CrPi, 3.2 мМ MgCl2, 20 мМ Hepes pH 7.5 и 50 мМ глутамата калия. Из реакционной смеси отбирали равные аликвоты сразу, через 90 и 180 мин после начала реакции .

Полученные в результате сплайсинга наборы РНК были выделены из каждой пробы и разделены с помощью электрофореза в денатурирующих условиях, в 5%-ном акриламидном геле. Гели высушивали и эффективность сплайсинга анализировали с помощью PhosphoImager (Packard Bioscience) .

–  –  –

Электрофоретический анализ продуктов гидролиза 3’-нетранслируемой области мРНК c-myc (рис. 3) свидетельствует о том, что все исследуемые рекомбинантные белки p53 способны гидролизовать данный РНК-субстрат. Однако мРНК подвергалась эндонуклеолизу не всеми исследуемыми субъединицами — 3 субъединица не способна гидролизовать данный РНК-субстрат (рис. 4, блок 3-GST). При этом РНКазная активность на обоих субстратах специфически зависела от присутствия в реакционной среде ионов Ca2+ или Mg2+. Необходимо также подчеркнуть, что сам по себе белок GST не проявлял РНКазной активности (рис. 3 и рис. 4, блок GST) .

Важно отметить, что в случае использования 3’-нетранслируемой области мРНК cmyc в качестве субстрата только рекомбинантные белки 1 и 5 проявляли РНКазную активность в отсутствие двухвалентных катионов (рис. 3, дорожки 1). Остальные исследуемые субъединицы были неактивны в отсутствие ионов Ca2+ или Mg2+ (рис. 3, дорожки 2, 3). И если ионы Mg2+ во всех случаях активировали РНКазную активность (рис. 3, дорожки 2), то влияние ионов Ca2+ зависело от конкретной субъединицы (рис. 3, дорожки 3) .

Таким образом, можно сделать вывод, что все исследуемые нами рекомбинантные субъединицы были способны гидролизовать 3’-нетранслируемую область мРНК c-myc, но их активность специфически зависела от присутствия двухвалентных катионов .

При использовании мРНК p53 в качестве субстрата ни один из рекомбинантных белков не проявлял РНКазной активности в отсутствие двухвалентных катионов (рис. 4, дорожки 1). Как и в случае субстрата 3’-нетранслируемой области мРНК c-myc, ионы Mg2+ обладали стимулирующим эффектом (рис. 4, дорожки 2), влияние же ионов Ca2+ на РНКазную активность рекомбинантных субъединиц было избирательным (рис. 4, дорожки 3). Однако субъединица 3 не гидролизовала РНК даже в присутствии двухвалентных ионов (рис. 4, блок 3-GST) .

–  –  –

Результаты наших экспериментов показывают, что все исследованные рекомбинантные субъединицы -типа, слитые с GST, обладали РНКазной активностью .

Важно отметить тот факт, что активность отдельных субъединиц зависела от используемого субстрата и присутствия в реакционной смеси двухвалентных катионов (Федорова и др., 2010; Kulichkova et al., 2010) .

Исходя из наших данных о наличии эндорибонуклеазной активности субъединиц типа, а также литературных данных об ассоциации с протеасомами низкомолекулярных РНК, нами было выдвинуто предположение о том, что 20S протеасомные комплексы могут участвовать в РНК-опосредованных процессах, например, в сплайсинге. Для проверки этой гипотезы было решено выяснить, взаимодействуют ли белки 20S протеасомы с белками, участвующими в регуляции сплайсинга. Из литературных данных известно, что с субъединицей 7 связывается целый ряд белков, которые затем деградируют по убиквитиннезависимому механизму. Таким образом, субъединица 7 является узловой точкой взаимодействия различных белков с 20S частицей протеасомы. Именно поэтому эта субъединица была выбрана для определения ассоциированных с ней белков .

–  –  –

Для определения спектра белков, способных связываться с субъединицей 7, был выбран метод GST pulldown с разделением взаимодействующих белков методом двухмерного электрофореза и последующей их идентификацией методом массспектрометрии. Для этого рекомбинантную субъединицу GST-7 инкубировали с цитоплазматической или ядерной фракцией клеточного экстракта, приготовленного из клеток проэритролейкемии человека линии К562. Белок GST был использован в качестве контроля неспецифического связывания. Связавшиеся белки разделяли с помощью двухмерного электрофореза (рис. 5 и рис. 6) .

В результате разделения неинкубированного белка GST с помощью двухмерного электрофореза видно, что он представлен, как минимум, четырьмя изоформами (рис. 6) .

Важно отметить при этом, что ни один белок не связался с GST после инкубации как с ядерным, так и с цитоплазматическим клеточными экстрактами. При этом рекмобинантный белок GST-7 способен связываться с различными белками (рис.5) .

Белки, ассоциированные с рекомбинантным белком GST-7, были идентифицированы с помощью метода масс-спектрометрии. Результаты представлены в таблице 1 и таблице 2 Таблица 1. Ядерные белки, ассоциированные с субъединицей 7 .

–  –  –

Для подтверждения связывания субъедницы 7 с белками, участвующими в сплайсинге, был проведен иммуноблотинг с использованием специфических антител. В данной работе на взаимодействие с GST-7 исследовали белки DDX5 и hnRNPA2/B1, которые оба участвуют в сплайсинге за счет различных механизмов. Клеточный экстракт, приготовленный из клеток K562, инкубировали с GST или GST-7. Удалось показать, что оба белка связываются с химерным белком GST-7, но при этом не связываются с GST .

Данное связывание является специфическим, так как белок GST-7 связывается с другой субъединицей 20S протеасомы – 6, что свидетельствует о нативности конформации 7 (рис.7). Связывания GST с 6 не происходит .

–  –  –

Полученные нами результаты показывают, что субъединица 7 связывается с ядерными белками, участвующими в метаболизме РНК. Это дает основание предполагать, что 20S протеасома участвует в регуляции сплайсинга. Для дальнейшей проверки этой гипотезы были проведены транскрипция и сплайсинг in vitro с использованием ДНКматрицы, представляющей собой фрагмент гена SMN1/2, содержащий экзон 7 с фрагментами интронов, фланкированный с обеих сторон экзонами гена -глобина (рис. 8). Важно отметить, что транскрибированная с этой химерной матрицы мРНК, которая содержит экзон 7 гена SMN1, может подвергаться альтернативному сплайсингу. Ген SMN1/2 кодирует белок выживания моторных нейронов (SMN). Отсутствие этого гена или его мутации приводят к заболеванию, называемому спинальная мышечная атрофия .


Несмотря на то, что белок SMN кодируется двумя высокогомологичными генами (SMN1 и SMN2), последний кодирует неполный белок из-за альтернативного сплайсинга и потери экзона 7 в зрелой мРНК. Такой белок не способен компенсировать потерю полноразмерного белка SMN. Оба варианта белка SMN подвергаются убиквитинилированию и последующей деградации в протеасомах (Burnett et al., 2009). Стабильность двух изоформ белка SMN различается in vitro и in vivo, что свидетельствует о том, что протеасомы могут влиять на уровень экспрессии белка SMN (в дополнение к непосредственной его деградации) путем дополнительных механизмов .

Проведенные нами эксперименты показали, что добавление как 19S, так и 20S снижало уровень продуктов альтернативного сплайсинга гена SMN1/2. 20S комплекс обладал более сильным эффектом в отношении обоих продуктов сплайсинга по сравнению с 19S (рис. 9). При добавлении 19S вместе с 20S ингибирование сплайсинга было более эффективным по сравнению с добавлением в реакцию только 19S, без 20S. Вышеизложенные данные позволяют предположить, что 20S комплекс в значительной степени подавляет образование альтернативно сплайсированной формы SMN1 .

–  –  –

Принимая во внимание, что основной функцией протеасом является расщепление белков, можно предположить, что некоторые субъединицы сплайсосом деградируют с помощью 20S протеасом. Для проверки этой точки зрения в реакцию сплайсинга in vitro был добавлен ингибитор протеолитических активностей MG132. В качестве контроля в реакцию сплайсинга in vitro был добавлен ингибитор без протеасом или DMSO, который использовался как растворитель для ингибитора. Эксперимент показал, что ингибитор протеасом практически не влияет на эффект 20S корового комплекса, заключающийся в подавлении сплайсинга (рис.10). Для исключения неспецифического ингибирования за счет изменения белкового баланса в качестве контроля был взят нагретый до 80° C бычий сывороточный альбумин (BSA), который подавил сплайсинг in vitro незначительно по сравнению с добавлением в реакцию 20S или 20S с ингибитором MG132. Кроме того, важно было исключить эффект небелковой природы, для этого 20S протеасомы были нагреты до 80 °C, что приводит к денатурации белков. Удалось показать, что добавление в реакцию нагретых до 80 °C 20S протеасом приводило к подавлению сплайсинга, но не так эффективно, как без нагревания. Таким образом, нами было показано, что как 20S коровый комплекс, так и 19S регуляторные частицы влияют на альтернативный сплайсинг гена SMN1. При этом протеолитические активности 20S коровой частицы не являются условием эффективного подавления сплайсинга (Fedorova et al., 2011) .

4. ВЫВОДЫ

1. Рекомбинантные субъединицы 1, 2, 4, 5 и 7 проявляют специфическую эндорибонуклеазную активность in vitro по отношению к мРНК p53 и с-myc. Для проявления этой активности необходимы ионы Мg2+ или Ca2+ .

2. Рекомбинантная субъединица 3 не проявляет эндорибонуклеазную активность по отношению к мРНК p53 и проявляет сравнительно небольшую активность по отношению к мРНК c-myc .

3. Рекомбинантная субъединица 7 взаимодействует с белками, участвующими в транскрипции, репарации ДНК, трансляции, метаболизме и сплайсинге .

4. Как 20S коровый комплекс, так и 19S регуляторные частицы влияют на альтернативный сплайсинг гена SMN1, мутации в котором приводят к мышечной дистрофии .

5. Протеолитические активности 20S коровой частицы не критичны для подавления сплайсинга .

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Федорова О.А. РНКазная активность рекомбинантных субъединиц альфа5 и альфа7 протеасомы // Материалы конференций Политехнического симпозиума. 2009. c.185Федорова О.А. Локализация РНКазного центра субъединицы зета 20S протеасомы // Ломоносов – 2009: Международная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных; Секция «Биология». Сборник тезисов. 2009. с.194-195 .

3. Moiseeva T.N., Fedorova O.A., Mittenberg A.G., Barlev N.A. Novel RNAse activities of proteasome alpha-type subunits are found to be affected by apoptosis induction // FEBS J .

2009. Vol.276 supp.1, p.212-213 .

4. Федорова О.А., Моисеева Т.Н., Миттенберг А.Г., Барлев Н.А. РНКазная активность рекомбинантных альфа субъединиц протеасом, экспрессированных в e.coli// биология-наука XXI века. 13-я Пущинская международная школа-конференция молодых учёных. Сборник тезисов. 2009, с.48-49 .

5. Kulichkova V.A., Fedorova O.A., Tsimokha A.S., Moiseeva T.N., Bottril A., Lezina L., Gauze L.N., Konstantinova I.M., Mittenberg A.G. and Barlev N.A. 26S proteasome exhibits endoribonuclease activity controlled by extra-cellular stimuli // Cell Cycle. 2010. 9(4): 840 Moiseeva T.N., Fedorova O.A., Mittenberg A.G., Barlev N.A. DNA-damage induction affects RNAse activities and posttranslational modifications of proteasome alpha-type subunits // FEBS J. 2010. Vol.277 supp.1, p.291 .

7. Федорова О. А., Моисеева Т. Н., Миттенберг А. Г., Барлев Н. А. Эндорибонуклеазная активность рекомбинантных альфа-субъединиц протеасом // Цитология. 2010. 52 (12):

1012–1015

8. Моисеева Т.Н., Федорова О.А., Цимоха А.С., Миттенберг А.Г., Барлев Н.А. Влияние убиквитинилирования на пептидазные активности протеасом при генотоксическом стрессе // Доклады Академии наук. 2010. 435(2): 267-271 .

9. Федорова О.А. Субъединица альфа7 протеасомы человека как возможный участник регуляции экспрессии генов // Материалы конференций Политехнического симпозиума. 2010. с.212-213 .

10. Федорова О.А., Миттенберг А.Г., Барлев Н.А. Регулируемые эндорибонуклеазные активности рекомбинантных альфа-субъединиц протеасом // Цитология. 2010. 52 (6):509-510 .

11. Федорова О.А., Моисеева Т.Н., Миттенберг А.Г, Барлев Н.А. Протеомный анализ белков, взаимодействующих с 20S протеасомой в клетках К562 // Вопросы онкологии .

2010. 56(2):49 .

12. Fedorova O.A., Moiseeva T.N., Nikiforov A.A., Tsimokha A.S., Livinskaya V.A., Mark H., Andrew B.l, Evteeva I.N., Ermolayeva J.B., Kuznetzova I.M., Turoverov K.K., Eperon I., Barlev N.A. Proteomic analysis of the 20S proteasome (PSMA3)-interacting proteins reveals a functional link between the proteasome and mRNA metabolism // Biochemical and Biophysical Research Communications. 2011. 416(3-4): 258-265

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Георгиев Г.П., Мантьева В.Л. Биохимия 1962, 27(7):949-957. Евтеева И.Н., Куличкова В.А., Волкова И.В., Ермолаева Ю.Б., Миттенберг А.Г., Тесленко Л.В., Обухова А.Д., Пеннияйнен В.А., Гаузе Л.Н., Константинова И.М. Цитология 2000, 42(7):675-680 .

Миттенберг А.Г., Куличкова В.А., Медведева Н.Д., Пеннияйнен В.А., Гаузе Л.Н., Константинова И.М. Цитология 2002, 44(2):181-187. Aitken A. Semin. Cancer Biol. 2006, 16(3):162-172. Asher G., Lotem J., Sachs L., Kahana C., Shaul Y. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 2002, 99(20):13125-13130. Ballut L., Petit F., Mouzeeyar S. Le Gall O., Candresse T., Schmid P., Nicolas P., Badaoui S. Biochim. Biophys. Acta 2003, 1645:30-39. Benaroudj N., Tarcsa E., Cascio P., Goldberg A.L. Biochimie 2001, 83(3-4):311-318. Boelens W.C., Croes Y., de Jong W.W. Biochim. Biophys. Acta 2001, 1544 (1-2):311-319. Collins G.A., Tansey W.P. Curr. Opin .

Genet. Dev. 2006, 16(2):197-202. Demartino G.N., Gillette T.G. Cell 2007, 129(4):659-662 .

Dignam J.D., Lebovitz R.M., Roeder R.G. Nucleic Acids Res. 1983, 11(5):1475-1489. Ferdous A., Sikder D., Gillette T., Nalley K., Kodadek T., Johnston S.A. Genes Dev. 2007, 21(1):112Fu H., Subramanian R.R., Masters S.C. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2000, 40:617-647 .

Glickman M.H., Ciechanover A. Physiol. Rev. 2002, 82(2):373-428. Groll M., Bochtler M., Brandstetter H., Clausen T., Huber R. Chembiochem. 2005, 6(2): 222-256. Heinemeyer W., Fischer M., Krimmer T., Stachon U., Wolf D.H. J. Biol. Chem. 1997, 272: 25200-25209 .

Hermeking H., Benzinger A. Semin. Cancer Biol. 2006, 16(3):183-192. Jariel-Encontre I., Pariat M., Martin F., Carillo S., Salvat C., Piechaczyk M. J. Biol. Chem. 1995, 270(19):11623-11627. Kulichkova V.A., Tsimokha A.S., Fedorova O.A., Moiseeva T.N., Bottril A., Lezina L., Gauze L.N., Konstantinova I.M., Mittenberg A.G., Barlev N.A. Cell Cycle 2010, 9(4):840-849. Laemmli U.K. Nature 1970, 227:680-685. Lupas W., Baumeister A. Curr. Opin .

Struct. Biol. 1997, 7(2):273-278. Maupin-Furlow J.A., Humbard M.A., Kirkland P.A., Li W., Reuter C.J., Wright A.J., Zhou G. Curr Top Dev. Biol. 2006, 75:125-169. Nickell S., Beck F., Scheres S.H., Korinek A., Frster F., Lasker K., Mihalache O., Sun N., Nagy I., Sali A., Plitzko J.M., Carazo J.M., Mann M., Baumeister W. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 2009, 106(29):11943-11947. Pajonk F., McBride W. H. Radiat. Res. 2001, 156:447-459. Pamnani V., Haas B., Phler G., Snger H.L,. Baumeister W. Eur. J. Biochem. 1994, 225(2):511-519 .

Petit F., Jarrousse A. -S., Boissonnet G., Dadet M. -H., Buri J., Briand Y., Schmid H-P. Mol .

Biol. Rep. 1997a., 24:113-117. Petit F., Jarrousse A. -S., Dahlmann B., Sobek A., Hendil K.B., Buri J., Briand Y., Schmid H. -P. Biochem. J. 1997b, 326:93-98. Schmid H.P., Pouch M.N., Petit F., Dadet M.H., Badaoui S., Boissonnet G., Buri J., Norris V., Briand Y. Mol. Biol. Rep .

1995, 21(1): 43-47. Sdek P., Ying H., Chang D.L., Qiu W., Zheng H., Touitou R., Allday M.J., Xiao Z.X. Mol. Cell. 2005, 20(5):699-708. Sheaff R.J., Singer J.D., Swanger J., Smitherman M., Roberts J.M., Clurman B.E. Mol. Cell. 2000, 5(2):403-410. Sikder D., Johnston S.A., Kodadek T. J. Biol. Chem. 2006, 281(37):27346-27355. Tai H.C., Besche H., Goldberg A.L., Schuman E.M. Front. Mol. Neurosci. 2010, 3: 12. Tanaka K. Proc Jpn Acad Ser B Phys .

Biol. Sci. 2009, 85(1):12-36. Tarcsa E., Szymanska G., Lecker S., O'Connor C.M., Goldberg A.L. J. Biol. Chem. 2000, 275(27):20295-301. Touitou R., Richardson J., Bose S., Nakanishi M., Rivett J., Allday M.J. EMBO J. 2001, 20(10):2367-2375. Tsukahara T., Tanaka K., Ogawa T., Ishiura S., Funabiki R., Sugita H. FEBS Lett. 1989, 255(1):179-183. Verma R., Chen S., Feldman R., Schieltz D., Yates J., Dohmen J., Deshaies R.J. Mol. Biol. Cell. 2000, 11(10):3425-3439. Voges D., Zwickl P., Baumeister W. Annu. Rev. Biochem. 1999, 68:1015-68 .

Wang X., Chen C.F., Baker P.R., Chen P.L., Kaiser P., Huang L. Biochemistry. 2007, 46(11):3553-3565. Wojcik C., Bury M., Stoklosa T., Giermasz A., Feleszko W., Mlynarczuk I., Pleban E., Basak G., Omura S., Jakobisiak M. Int. J. Biochem. Cell Biol. 2000, 32: 957-965. Yi P., Feng Q., Amazit L., Lonard D.M., Tsai S.Y., Tsai M.J., O'Malley B.W. Mol. Cell. 2008, 29(4):465-476 .






Похожие работы:

«1 Организация ООО БДТ-АГРО Заводской № Лист комплектации Борона БДМ-4х4ПКС (БД-44.00.00.00) контроль Кол-во Наименование № спецификации примечание на деталей, узлов погрузка выгрузка 1 изд. БД-44.01.00.00 Рама 1 БД-44.03.00.00 Шасси 1 ВО3 6/161/205/Е2 ЕТ-5 Диск 9,00х15,3 Шина 10,0/75-15,3 14PR ST-155TL 2 БД-44.08.00.0...»

«ОРГКОМИТЕТ расширенного заседания Научного Совета по криологии Земли РАН: Председатель заседания Мельников В. П. Заместители председателя Брушков А. В., Железняк М.Н. Ответственный ученый секретарь Мотенко Р.Г. Члены оргкомитета: Алексеев А.Г., Ашпиз Е.С., Ананьев В.В., Богданов М.И., Васильчук Ю.К., Гнатюк И.И., Гребенец В.И., Дроздов Д.С., Д...»

«КАЗАНСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИНСТИТУТ ФУНДАМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ И БИОЛОГИИ Кафедра морфологии и общей патологии Г.Р. БУРГАНОВА, А.С. ПЛЮШКИНА, Д.И. АНДРЕЕВА, А.А. ГУМЕРОВА, А.П. КИЯСОВ МЫШЕЧНАЯ ТКАНЬ Учебно-методическое пособие Казань – 2018...»

«За верное выполнение всех заданий экзаменационной работы можно максимально получить 100 баллов. Требования к уровню подготовки абитуриентов по биологии Проверяемые в тесте знания и учебные умения абитуриента, поступающего в высшее учебное заведение, представлены в таблице. Требование стандарта Коды контролируемых знаний и умений...»

«Известия Челябинского научного центра, вып. 4 (46), 2009 БИОЛОГИЯ УДК 595.753.3 (470.5) ПОЛИМОРФИЗМ ПЕННИЦЫ PHILAENUS SPUMARIUS L. (HOMOPTERA, CICADINA) НА УРАЛЕ У. В . Колова e-mail: u_kolova@mail.ru Нижегородский университет им. Н.И. Лобачевского, пр. Гагарина, 23, г. Ниж...»

«ОСТ 108.275.51-80 Группа Е26 ОТРАСЛЕВОЙ СТАНДАРТ СБОРОЧНЫЕ ЕДИНИЦЫ И ДЕТАЛИ ПОДВЕСОК ТРУБОПРОВОДОВ ТЭС И АЭС ТИПЫ, ОСНОВНЫЕ ПАРАМЕТРЫ И РАЗМЕРЫ ОКП 31 1312 Срок действия установлен с 01.01.85 до 01.01.93 _ * Измененная редакция, Изм. N 2, 3. ** См. ярлык Примечания. УТВЕ...»

«Экология языка и коммуникативная практика. 2015. № 1. С. 179–187 Нерегламентированная пунктуация в романе Д. Рубиной "Белая голубка Кордовы" М.В. Веккессер УДК 811.161.1 НЕРЕГЛАМЕНТИРОВАННАЯ ПУНКТУАЦИЯ В РОМАНЕ Д. РУБИНОЙ "БЕЛАЯ ГОЛУБКА КОРДОВЫ" М.В. Веккессер В статье рас...»

«МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ "БРЯНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ" ПРОГРАММА вступительного испытания для поступающих в магистратуру Направле...»




 
2019 www.mash.dobrota.biz - «Бесплатная электронная библиотека - онлайн публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.